阅读说明：本技术 一种重组胰蛋白酶的生产工艺 (A kind of production technology of recombinant trypsin ) 是由 乐峰松 于 2019-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种利用酵母重组表达可溶性重组胰蛋白酶的生产工艺,使胰蛋白酶能高表达于上清液中,并可利用离子交换层析方法从发酵液上清中纯化获得重组胰蛋白酶原,通过自身催化获得高活性重组胰蛋白酶,在成本、收率、活性和纯度等技术指标方面远远优于大肠杆菌表达工艺,因此极具工业化生产价值。(The present invention provides a kind of production technologies using yeast recombinant expression of soluble recombinant trypsin, trypsase height is set to be expressed in supernatant, and it is purified from fermented liquid supernatant using ion-exchange chromatography method and obtains recombinant trypsin original, high activity recombinant trypsin is obtained by autocatalysis, it is far superior to Bacillus coli expression technique, therefore great industrial production value in terms of the technical indicators such as cost, yield, activity and purity.)

一种重组胰蛋白酶的生产工艺

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组胰蛋白酶的纯化生产工艺。

背景技术

胰酶系各国药典收载的助消化药，是从动物胰脏中提取的多种酶的混合物，主要成分为胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶。根据中国药典2015版的规定，本品系自猪、羊或牛胰中提取的多种酶的混合物，主要为胰蛋白酶、胰淀粉酶与胰脂肪酶。按干燥品计算，每lg中含胰蛋白酶活力不得少于600单位，胰淀粉酶活力不得少于7000单位，胰脂肪酶活力不得少于4000单位。目前胰酶的生产主要是由动物胰脏提取，采用现有胰酶生产工艺生产，其产品胰酶收率较低，相关工艺可以参考中国专利CN200910117583.5，CN201310124906.X和CN201310124907.4等，在此全部引入作为参考。

在胰酶组分中，胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，该酶催化在碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸的羧基基团上进行肽的水解切割(Keil B.，1971)，已有多种研究表明胰蛋白酶可以从其他高等脊椎动物中分离，如牛、猪、绵羊等。该酶是作为无活性的前体(胰蛋白酶原)在脊椎动物的胰细胞中合成的，并随后通过对前肽的切割而转变为活性形式。第一个胰蛋白酶原分子是以天然的方式通过在(Asp4)-Lys-↓-Ile间水解肽键从而切除前肽的肠肽酶肠激酶来活化的(Keil，1971))。活化反应也可在生理pH值下自身催化地进行，这是因为有一个赖氨酸位于肠激酶的识别序列的C-末端侧，因此Lys-↓-Ile肽键水解也可通过胰蛋白酶进行(Light等人，1980)。

胰蛋白酶主要用于将多肽切割为用于测序的小段、用于使贴壁细胞从被覆盖的细胞培养物皿上脱离及用于将融合蛋白质切割为目标肽和融合成分、用于活化前肽(如胰蛋白酶原到胰蛋白酶)及用于肽激素的重组生产(如前胰岛素到胰岛素，参见WO99/10503)等。胰蛋白酶由于其易于从多种哺乳动物获得、高特异性(仅在赖氨酸或精氨酸的C-末端进行切割)和高特异活性(～150U/mg)以及其良好的贮藏稳定性，所以始终是生物技术应用中有价值的蛋白酶。

由于动物来源的酶的使用在许多情况下(潜在的病毒污染等)已经不再被允许，因此在工业应用上特别是对于药物的生产过程中需要使用提供来自微生物宿主的重组胰蛋白酶。但是由于胰蛋白酶是活性强的肽链内切酶，可水解任何暴露在蛋白表面的赖氨酸和精氨酸残基的羧基端形成的肽键，包括其自身，所以一般的胰蛋白酶在pH3以上不稳定，会自身水解，而且微量活性胰蛋白酶的存在就可对表达宿主细胞产生毒性。一种解决办法是以胰蛋白酶原的形式表达，例如CN201610005823.2通过在大肠杆菌中表达出牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白的包涵体蛋白，然后进行酸化处理将包涵体蛋白变、复性为折叠好的牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白。但由于该工艺是是不溶性的包涵体形式，包涵体的复性率很低，而且纯化工艺相对复杂，因此其报道的重组胰蛋白酶的收率比较低。

因此，开发新的可溶性重组胰蛋白酶生产工艺，以期获得低成本、高收率且高酶活的重组胰蛋白酶仍然是本领域亟待解决的技术难题。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种利用酵母重组表达可溶性重组胰蛋白酶的生产工艺，使胰蛋白酶能高表达，利用离子交换层析方法从发酵液上清中纯化获得重组胰蛋白酶原，并通过自身催化获得高活性重组胰蛋白酶。

一方面，本发明公开了一种重组胰蛋白酶的生产工艺，包括如下步骤：

(1)将含有重组胰蛋白酶原的发酵液上清进行超滤或稀释后，再上样于离子交换层析柱；

(2)上样后离子交换层析柱先经平衡缓冲液冲洗，所述的平衡缓冲液含有能维持pH为3.0-5.0的5-100mmol/L缓冲液，1-10mM CaCl₂；再平衡后利用洗脱缓冲液进行离子梯度洗脱，所述的洗脱缓冲液为在平衡缓冲液基础上加入0.1-2M钠盐，收集离子层析洗脱目标峰；

(3)将洗脱目标峰溶液调至pH7.0-11.0条件下活化10～30小时，使重组胰蛋白酶原活化为重组胰蛋白酶后，再将pH调至2.5-5.0终止活化；

(4)通过盐析使重组胰蛋白酶沉淀，离心，冷冻干燥后即得重组胰蛋白酶。

在本发明另一优选的实施方案中，所述方法中的胰蛋白酶为重组猪胰蛋白酶、重组牛胰蛋白酶或重组羊胰蛋白酶等。在本发明另一个优选的实施方案中，所述的胰蛋白酶为重组猪胰蛋白酶。

在本发明另一优选的实施方案中，所述方法步骤(1)中，发酵液上清先进行超滤或稀释预处理，优选发酵液上清用纯化用水稀释后再上样。

在本发明另一优选的实施方案中，所述方法步骤(1)中的离子交换填料为强阳离子填料。更优选的，离子交换填料为SP。

在本发明另一优选的实施方案中，所述方法步骤(2)中的平衡缓冲液中能维持pH为3.0-5.0的缓冲液可任选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液或柠檬酸缓冲液等。优选缓冲液浓度为10-80mmol/L，pH为3.5-4.5。在本发明特别优选的实施方案中，平衡缓冲液含有30-60mM NaAc-HAc,2-4mM CaCl₂,pH为3.5-4.5。更优选的，平衡缓冲液含有40mM NaAc-HAc,2mM CaCl₂,pH4.5。所述方法步骤(2)中的离子交换层析柱先经平衡缓冲液冲洗1-3柱体积(CV)，使得电导与pH基线走平；上样后层析柱用平衡缓冲液再平衡1-3CV。

在本发明另一优选的实施方案中，所述方法步骤(2)中，洗脱缓冲液为在平衡缓冲液基础上再加入0.1-2M钠盐，所述的钠盐优选为氯化钠、硫酸钠和磷酸氢二钠等。更优选的，所述的钠盐为0.4M氯化钠。优选的洗脱液为40mM NaAc-HAc,0.4M NaCl,2mM CaCl2,pH4.5。将目标峰取样电泳检测，纯度可在95％以上。

在本发明另一优选的实施方案中，离子梯度洗脱完成后，离子交换层析柱可先用0.5-2M NaOH冲洗1-2CV，再用洗脱缓冲液冲洗1-3CV，然后用平衡缓冲液冲洗1～2CV，以再生离子交换层析柱。

在本发明另一优选的实施方案中，所述方法步骤(3)中，优选将步骤(2)制备得到的离子层析目标峰pH调至8.0-8.5条件下活化15～20h，使重组胰蛋白酶原活化为重组胰蛋白酶后，再将pH调至2.5-3.5终止活化。更优选的，将步骤(2)制备得到的离子层析目标峰用Tris缓冲液调至pH8.0±0.2，搅拌均匀后，在室温条件下活化15～20h；活化后的样品用HCl溶液调pH2.8±0.2以终止活化。

在本发明另一优选的实施方案中，所述方法步骤(4)中，在步骤(3)的溶液中加入中性盐使得胰蛋白酶沉淀，所述的盐可选自硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。优选在活化终止样品中加入硫酸铵固体至0.7～1.5mol/L；搅拌均匀后，室温下静置，用管式离心机离心得到湿固体。将湿固体平铺在托盘中，按照常规冷冻干燥程序得到冻干粉，即为重组胰蛋白酶。在另一优选的实施方案中，测定制备得到猪胰蛋白酶的酶活，结果猪胰蛋白酶活力≥2000-5000USP/mg。

另一方面，本发明提供了一种利用酵母重组表达可溶性重组胰蛋白酶的生产工艺，使胰蛋白酶能高表达，并利用前述的离子交换层析方法从发酵液上清中纯化获得重组胰蛋白酶原，并通过自身催化获得高活性重组胰蛋白酶。

因此，另一方面本发明公开了一种重组胰蛋白酶的生产工艺，进一步包括如下步骤：

(a)、在保持各自基因密码子阅读框架不变的前提下，将具有形如A-B-C结构的融合基因连接到酵母表达载体，将表达载体转化导入酵母菌中，经筛选得到重组酵母菌；其中，所述A部分为编码前导肽的核苷酸序列，B为编码肠激酶切位点的核苷酸序列，C为胰蛋白酶基因；

(b)、高密度发酵重组酵母菌，在生长阶段控制pH范围为4.8-5.4，诱导阶段控制pH范围为3.2-3.6，表达后离心收集发酵上清液。

在本发明另一优选的实施方案中，上述制备得到的发酵上清液可利用前述的离子交换层析方法纯化获得重组胰蛋白酶原，经自身活化为重组胰蛋白酶，其纯化工艺参数如前所述。

胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶，该酶催化在碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸的羧基基团上进行肽的水解切割，其来源有牛、猪和羊等。在本发明一个优选的实施方案中，所述的胰蛋白酶为猪胰蛋白酶，构建的猪胰蛋白酶原序列如Seq ID No：1所示，经自身活化后猪胰蛋白酶的氨基酸序列如Seq ID No：2所示。

在本发明另一优选的实施方案中，构建好A-B-C结构的融合基因(其序列如Seq IDNo：3所示)后，可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。不同的融合基因可分别在宿主中表达得到各种融合蛋白。许多表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9和pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)等，动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。优选的方法是将编码本发明中的目标酶的核酸克隆至酵母表达载体pPICZ-α-A，该质粒为酵母整合型质粒，带有醇氧化酶操纵子(AOX1)5’序列和3’序列，用于方便编码基因整合至酵母染色体，和控制编码基因的表达。这些质粒及对应的宿主菌等可以从Invitrogen Corp.San Diego.California.USA构得，优选的启动子为AOX1。

载体可经转化或转染至原核生物或真核生物宿主。转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如：电穿孔，制备感受态的原生质球等。表达目标蛋白的宿主可以是酵母、哺乳动物细胞、细菌、动物、植物等，优选为酵母菌，如酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母等，更优选为毕赤酵母。目标蛋白或酶可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是酵母MFα信号肽。

可以通过培养含有本发明DNA构建体的宿主，如重组酵母、重组哺乳动物细胞、重组细菌等，生产重组胰蛋白酶。在本发明一个优选的实施方案中，将构建完成的基因工程酵母菌进行液体培养和发酵,通过甲醇诱导表达目标蛋白。发酵培养阶段的条件控制为：生长、诱导阶段温度控制在20～30℃；pH控制在4.0～5.0。培养过程中，当溶氧持续上升时，需要补加丙三醇补料培养基。等溶氧及pH上升后，开始流加诱导补料培养基(丙三醇+甲醇)启动诱导程序，一方面补加丙三醇可以提高菌体密度，另一方面补加甲醇诱导蛋白表达。为了让酵母菌适应甲醇，可以分阶段逐步调高甲醇的补料速度，诱导目标蛋白的表达。当发酵液菌OD₆₀₀值≥300时，将发酵液放出，离心收集发酵上清。

可以用各种蛋白分离的方法分离纯化蛋白，如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合，其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术或其组合。优选经离子交换层析方法纯化后获得重组胰蛋白酶原，经自身活化即制备得到重组胰蛋白酶，其纯化工艺参数如前所述。

利用本发明公开的重组胰蛋白酶纯化生产工艺，可以制备得到纯度≥95％、酶活≥2000-5000USP/mg的高品质重组猪胰蛋白酶。本发明公开的方法利用酵母分泌表达重组胰蛋白酶原，避免大肠杆菌表达需要复性的繁琐过程，工艺更简单，而且在成本、收率、活性和纯度等技术指标方面远远优于现有技术，因此极具工业化生产价值。

附图说明

附图1：酵母表达载体构建示意图。

附图2：胰蛋白酶原离子交换层析图(波峰锯齿状为UV280吸收值，阶梯状为溶液电导值)。

附图3：胰蛋白酶电泳图(12％SDS-PAGE)，其中条带1：分子量marker；条带2:01批胰蛋白酶；条带3:02批胰蛋白酶。

具体实施方式

实施例1

首先根据猪胰蛋白酶原序列(其序列如Seq ID No：1所示)翻译成基因序列(其序列如Seq ID No：3所示)，在其5’端含有EK酶切位点对应的核酸序列以及5’XhoⅠ(ctcgag)酶切位点，在其3’端添加终止子以及3’NotⅠ(gcggccgc)酶切位点。由基因合成服务公司合成上述序列，并克隆到于pGEM-T(promega公司)载体中，经测序验证，基因的序列完整、正确。然后分别抽提质粒，用XhoⅠ/NotⅠ双酶切PGEMT回收猪胰酶基因；用XhoⅠ/NotⅠ双酶切pPICZαA酵母表达基因回收大片段，然后连接上述的两个片断，形成含有编码酵母α-factor前导肽-肠激酶切位-猪胰蛋白酶基因形式的重组酵母表达质粒pPICZαA,测序验证阅读框架正确，构建好的质粒如图1所示。将重组酵母表达载体体外酶切线性化，以原生质体转化法转化毕氏酵母受体菌GS115菌株。转化子涂板MD培养基上，30℃培养48h后，挑选MD培养基上长出的转化子为猪胰酶工程表达菌株。

实施例2猪胰酶的表达发酵

用接种环挑取猪胰酶工程表达菌株，放入YPG培养基(胰蛋白胨6克，酵母粉3克，丙三醇6克于5升的玻璃烧杯中，用纯化水定容至300毫升，装于1个1000mL三角烧瓶中)中。将已接种的YPG摇瓶放到摇床中，220rpm培养约18-24小时，使得OD600≥5，作为种子液。

将种子液倒入发酵罐中，补充酵母培养基，调节通气流量为不低于10L/min。发酵培养阶段的条件控制为：温度控制在20～30℃；pH控制在4.0～5.0。每隔0.5-2小时检查并记录1次，记录内容包括：温度、pH、溶氧PO2、搅拌Stirr、通气Air、碱量、通气量、补料量。当培养至搅拌速度已经开到最大，此时打开氧气阀门。

培养约24小时以后，当溶氧持续上升时，开始以20-25ml/L/h的速度补加丙三醇补料培养基(丙三醇50％v/v，纯化水50％v/v)。当丙三醇补料结束后，等溶氧及pH上升后，降温至25℃，设定PH至3.2，启动诱导程序。开始流加诱导补料培养基(50％丙三醇+50％甲醇)，一方面补加丙三醇可以提高菌体密度，另一方面补加甲醇诱导蛋白表达。为了让酵母菌适应甲醇，分阶段逐步调高甲醇的补料速度：0～2小时2mL/L/h，2～4小时4.0mL/L/h，之后6.0mL/L/h。共诱导约118-125小时，发酵液菌浓OD₆₀₀≥300时，将发酵液放出，离心收集发酵上清。

实施例3猪胰酶的纯化

1)样品预处理：发酵上清中加入1倍的纯化用水，最终上样液的电导约7.0ms/cm；pH控制在约4.5。

2)层析柱平衡：直径25cm的层析柱，填料为离子交换柱SP Bestarose FF(博格隆(上海)生物技术有限公司)。用平衡缓冲液(50mM NaAc-HAc,2mM CaCl2,pH4.5；)平衡3CV，电导与pH基线走平。

3)上样：取预处理发酵液上样。

4)层析柱再平衡：用平衡缓冲液平衡2CV。

5)样品洗脱：用洗脱液(50mM NaAc-HAc,0.4M NaCl,2mM CaCl2,pH4.5)洗脱目标峰。

6)层析柱再生：先用1mol/L NaOH冲洗1CV，再用洗脱液冲洗1CV，再用平衡液冲1～2CV。

7)检测：取样，电泳检测，纯度在97％以上。

8)样品保存：室温存放。

胰蛋白酶原离子交换层析如附图2所示。

实施例4猪胰酶的活化

将实施例3制备得到的离子层析目标峰用1mol/L Tris调至pH8.0±0.2，搅拌均匀后，在室温条件下活化15～20h。活化后的样品用50％HAc调至pH4.0±0.2，再用1mol/L HCl调pH2.8±0.2终止活化。

按体积比1:2.8，将3.3M硫酸铵溶液加入到活化样品中；搅拌均匀后，室温下静置3h后，用管式离心机离心14000rpm，4℃，进样速度为60L/h离心，得到湿固体。将湿固体平铺在托盘中，在-40℃以下预冻2h，再升温-4℃，保持10h，最后升温至25℃，保持8h，得到冻干粉，即为猪胰蛋白酶(其序列如Seq ID No：2所示)。

实施例5猪胰酶的纯度分析

将实施例2-4制备得到的猪胰蛋白酶进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测纯度。将待检样品与5×还原加样缓冲液按4:1的比例混合，混匀后于99.9℃金属恒温加热器上加热，然后10000rpm离心，离心后上样，每个样品上样5-10μl。其中各泳道样品为条带1：分子量marker；条带2：01批胰蛋白酶；条带3：02批胰蛋白酶。

加样后，接通电源，以80V电压条件下电泳30分钟，然后再将电压调至150V电压条件下继续电泳，当染料前沿到达距分离胶底部0.5cm处时停止电泳。将卸下的凝胶加入适量固定液固定10min后，加入适量染色液，平缓摇动染色1小时。用自来水冲洗残留的染色液，加入适量脱色液于脱色摇床上摇动1～2小时，期间更换数次脱色液，直到凝胶空白背景基本无色，凝胶进行拍照，如附图3所示。用ImageLab软件分析泳道和条带，根据标准品计算分子量。其中，泳道2和3的猪胰蛋白酶的分子量为20-30kDa，纯度大于97％。

实施例6猪胰酶的活性分析

胰蛋白酶能水解底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(简称BAEE)生成紫外A253nm处吸收值更高的N-苯甲酰-L精氨酸(简称BA)。在一定条件下，随着催化反应的进行，BAEE逐渐减少，产物BA逐渐增多，反应体系的紫外吸收值逐渐增加，最后以每分钟使⊿A253nm增加0.001酶量为1个BAEE单位(1USP/mg等于3 BAEE/mg)。

取光程为1cm的带盖石英比色杯，加入25℃预热的6.0ml 0.25mM BAEE底物工作液，在A253nm处立即调零。再加入5ul 1mg/ml待测酶液，立即混匀，开始读数。每隔30s读数一次，共持续6min。测得的吸光值⊿253nm/min值保持在0.02～0.03之间为宜，且加入的酶量应使⊿253nm/min在3～4min内保持一致。以时间(t)为横坐标，光吸收值(⊿253nm)为纵坐标作图，在直线部分任选一个时间间隔(至少3～4分钟数值稳定)与相应光吸收值变化(⊿253nm)，求斜率，即得到⊿253nm/min。共测定3次，取3次平均值计算待测胰酶的活性。

胰蛋白酶活力单位(USP/mg pro)＝⊿253nm/min/(0.003*酶液加入体积)/蛋白含量

根据上述步骤，取实施例2-4制备得到猪胰蛋白酶测定其酶活，结果猪胰蛋白酶活力≥5000USP/mg pro。

序列表

<110> 杭州浦泰生物科技有限公司

<120> 一种重组胰蛋白酶的生产工艺

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Leu Glu Lys Arg Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Pro Lys Glu Phe

1 5 10 15

Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser

20 25 30

Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu

65 70 75 80

Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn

85 90 95

Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser

100 105 110

Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg

115 120 125

Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn

130 135 140

Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys

145 150 155 160

Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln

165 170 175

Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp

180 185 190

Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu

195 200 205

Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro

210 215 220

Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr

225 230 235 240

Ile Ala Ala Asn

<210> 2

<211> 223

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu

85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala

100 105 110

Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met

145 150 155 160

Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn

210 215 220

<210> 3

<211> 746

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ctcgagaaaa gagaagaagc tgaagctgaa gctgaaccaa aggaattcga cgacgacgac 60

aagatcgttg gtggttacac ttgtgctgct aactctatcc cataccaagt ttctttgaac 120

tctggttctc acttctgtgg tggttctttg atcaactctc aatgggttgt ttctgctgct 180

cactgttaca agtctagaat ccaagttaga ttgggtgaac acaacatcga cgttttggaa 240

ggtaacgaac aattcatcaa cgctgctaag atcatcactc acccaaactt caacggtaac 300

actttggaca acgacatcat gttgatcaag ttgtcttctc cagctacttt gaactctaga 360

gttgctactg tttctttgcc aagatcttgt gctgctgctg gtactgaatg tttgatctct 420

ggttggggta acactaagtc ttctggttct tcttacccat ctttgttgca atgtttgaag 480

gctccagttt tgtctgactc ttcttgtaag tcttcttacc caggtcaaat cactggtaac 540

atgatctgtg ttggtttctt ggaaggtggt aaggactctt gtcaaggtga ctctggtggt 600

ccagttgttt gtaacggtca attgcaaggt atcgtttctt ggggttacgg ttgtgctcaa 660

aagaacaagc caggtgttta cactaaggtt tgtaactacg ttaactggat ccaacaaact 720

atcgctgcta actaatgagc ggccgc 746