阅读说明：本技术 酶组合物及其制备方法 (Enzyme composition and preparation method thereof ) 是由 张小蒙 张莉 杨恒月 周敏 于 2019-11-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于酶活性技术领域,涉及一种酶组合物及其制备方法。该酶组合物包括：酶以及蝉花活性物质。本发明提供的酶组合物能够提高酶的热稳定性,并且不影响酶的活性。(The invention belongs to the technical field of enzyme activity, and relates to an enzyme composition and a preparation method thereof. The enzyme composition comprises: enzymes and cicada fungus active substances. The enzyme composition provided by the invention can improve the thermal stability of the enzyme and does not influence the activity of the enzyme.)

酶组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于酶活性技术领域，更具体地，涉及一种酶组合物及其制备方法。

背景技术

酶作为催化剂广泛应用在各种生产过程中。在应用过程中，催化剂通常伴随着高温处理，尤其是在工业制造上，但是高温处理会破坏酶的结构，导致酶失去催化活性，例如在饲料制备过程中，当温度达到90℃时，2～5分钟酶就会失活。

现有的提高酶的热稳定性的方法主要包括：第一是筛选具有天然热稳定性的酶；第二是使用分子技术的方法改良酶的热稳定性；第三是使用添加剂。

发明人在实现本发明的过程中发现，第一种提高酶的热稳定性的方法的缺点是：天然存在的具有热稳定性的酶通常无法大规模大量生产，不具有经济效益。第二种提高酶的热稳定性的方法的缺点是：以分子生物技术手段进行改良的酶需要自身发生突变，然后再对发生突变的酶进行大量筛选，得到热稳定性高的酶，该方法需要大量实验，操作繁琐，并且筛选得到的酶活性相对较低。不仅如此，突变还会影响酶的专一性。第三种提高酶的热稳定性的方法的缺点是：现有的添加剂通常盐浓度高，影响酶的活性。此外，通过固定化方法提高酶的热稳定性，也会影响酶的活性。

因此，需要一种提高酶的热稳定性而不影响酶活性的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶组合物及其制备方法，提高酶的热稳定性，并且不影响酶活性。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种酶组合物，该酶组合物包括：酶以及蝉花活性物质。

在本发明的一种优选实施方式中，所述蝉花活性物质为蝉花菌丝体的发酵液。

具体地，所述蝉花菌丝体的发酵液由包括以下步骤的方法制得：

(a)获取所述蝉花菌丝体；

(b)对所述蝉花菌丝体依次进行纯化培养和活化培养；

(c)将活化后的所述蝉花菌丝体接种于发酵罐内，进行发酵，获得所述蝉花菌丝体的发酵液。

更具体地，步骤(b)对所述蝉花菌丝体依次进行纯化培养和活化培养包括以下步骤：

(b1)将所述蝉花菌丝体接种于平板培养基上，在23-28℃条件下，培养15-20天；

(b2)将步骤(b1)培养获得的蝉花菌丝体接种于液体培养基中，在23-28℃条件下，培养15-20天。

本发明不对所述蝉花菌丝体接种的平板培养基和液体培养基作具体限定，只要蝉花菌丝体在其上能够快速生长繁殖即可。例如，平板培养基可以为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其配方详见表1；液体培养基可以为改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其配方详见表2。

表1马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基组成

表2改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基组成

更具体地，在步骤(c)中，所述发酵罐内的压力为0.7-0.9kg/cm²，通气速率为0.8-1.5VVM。

更具体地，在步骤(c)中，所述发酵的温度为23-28℃，所述发酵的时间为15-20天。

在本发明中，该酶组合物中的酶与蝉花活性物质可以按任意比例配比。本领域技术人员可以理解的是，随着蝉花活性物质的增加，酶的耐温性能会相应地提高，当达到一定比例时，酶的耐温性能几乎不变。对本发明而言，所述酶与所述蝉花活性物质的质量比为1:1～1:500；例如1:5～300、1:5～200、1:5～100、1:5～50、1:5～50、1:5～30、1:5～20、1:5～10、或1:10。

在实验过程中，发明人发现蝉花活性物质对现有的很多酶均具有提高热稳定性的作用，例如植酸酶、纤维素酶和α-淀粉酶中的至少一种。

本发明第二方面提供一种上述酶组合物的制备方法，将所述酶与所述蝉花活性物质混合，即可得到所述酶组合物。

具体地，所述将所述酶与所述蝉花活性物质混合为，将所述酶与所述蝉花活性物质溶解于能够使酶保持构型的缓冲液中。使酶保持构型的缓冲液的选取可以根据酶的活性来确定，进一步确定缓冲液的pH值。对于不同的酶所需的使其保持构型的缓冲液可能不同。举例说明，植酸酶、纤维素酶和α-淀粉酶可以使用醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液将其溶解。醋酸盐缓冲液可以为醋酸钠或醋酸钾缓冲液，其浓度可以为20-100mmol/L。磷酸盐缓冲液可以为磷酸钠或磷酸钾缓冲液，其浓度可以为50-150mmol/L。

本发明提供的酶组合物能够提高酶的热稳定性，并且不影响酶的活性。

本发明的其它特征和优点将在随后

具体实施方式

部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了实施例2中植酸酶的热稳定性的结果图。

图2示出了实施例3中纤维素酶的热稳定性的结果图。

图3示出了实施例4中α-淀粉酶的热稳定性的结果图。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例1蝉花活性物质(CAF)的制备

取蝉花菌丝体接种到平板培养基上，25℃培养18d，然后再接种至三角瓶内，25℃培养7d，最后将培养得到的蝉花菌丝体接种至发酵罐内，25℃培养3d，最终形成含有蝉花活性物质的发酵液，即为蝉花菌丝体的发酵液。

将蒸馏过的蝉花活性物质的发酵液在60℃下，干燥24h，然后进行研磨，最后使用0.5cm的筛网进行过筛处理，得到的CAF粉末。每克CAF粉末加入10mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液即得到CAF适用液。

实施例2植酸酶热稳定性的测试

1)植酸酶CAF组合物的制备以及处理

将1g植酸酶加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液，得到植酸酶溶液。取三份1mL植酸酶溶液，分别加入2g，5g，10g实施例1制备的CAF粉末即可得到1:2、1:5、1:10的植酸酶CAF组合物，将其放置在烘箱中，60℃下，干燥1h，即可得到1:2，1:5，1:10的植酸酶CAF组合物测试样品。

2)对照组合物的制备以及处理

将1g植酸酶加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液，得到植酸酶溶液，取1mL植酸酶溶液，放置在烘箱中，60℃下，干燥1h，即可得到植酸酶对照组样品。

3)植酸酶活性测试

取1g植酸酶CAF组合物测试样品和植酸酶对照组样品加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液做成测试液，然后分别在37℃、50℃、60℃、70℃、80℃以及90℃下，处理30min，记录700nm处吸光值。一个单位植酸酶活性定义为在37℃下，每分钟释放出1mmol磷酸，活性设置为100％。经不同温度热处理之后，植酸酶CAF组合物测试样品活性请参见图1。

如图1所示，不含CAF的对照组测试样品，在50℃下，处理30min后，其植酸酶活性仅存75％及40％，而在60℃下，处理30min后，即检测不出植酸酶活性。然而1:2混合的植酸酶CAF组合物测试样品，经过50℃处理30min后，活性仍然有90％，经60℃处理30min后，活性剩下70％，而经过70℃处理后，仍有20％的活性。以1:5混合的植酸酶CAF组合物测试样品，经过50℃处理30min后，活性有82％，经过60℃处理30min后，活性有80％，经过70℃处理30min后，活性有40％。以1:10混合的植酸酶CAF组合物测试样品在50℃、60℃以及70℃处理后，其活性均在80％以上，在80℃处理后，仍然有55％的活性，且经过90℃处理之后仍有20％的活性。

由上述结果可知添加有CAF的植酸酶，经高温热处理之后仍具有活性，CAF明显改善植酸酶的热稳定性。

实施例3纤维素酶热稳定性的测试

1)纤维素酶CAF组合物的制备以及处理

将1g纤维素酶加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液，得到纤维素酶溶液。取1mL纤维素酶溶液，加入2g实施例1制备的CAF粉末即可得到1:2的纤维素酶CAF组合物，将其放置在烘箱中，60℃下，干燥1h，即可得到1:2的纤维素酶CAF组合物测试样品。

2)对照组合物的制备以及处理

将1g纤维素酶加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液，得到纤维素酶溶液。取1mL纤维素酶溶液，放置在烘箱中，60℃下，干燥1h，即可得到纤维素酶对照组样品。

3)纤维素酶活性测试

取1g纤维素酶CAF组合物测试样品和纤维素酶对照组样品加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液做成测试液，然后分别在37℃、50℃、60℃、70℃、80℃以及90℃下，处理30min，记录700nm处吸光值。一个单位纤维素酶活性定义为在37℃下，每分钟释放出1mmol磷酸，活性设置为100％。经不同温度热处理之后，纤维素酶CAF组合物测试样品活性请参见图2。

如图2所示，不含CAF的对照组测试样品，在50℃、60℃、70℃下，处理30min后，其纤维素酶活性可保持在90％左右，而在80℃下，处理30min后，纤维素酶活性急剧下降，只有90％，在90℃下，处理30min后，即检测不出纤维素酶活性。然而1:2混合的纤维素酶CAF组合物测试样品，无论在经过50℃、60℃、70℃、80℃甚至90℃，处理30min后，纤维素酶的活性均保持在90％以上。

由上述结果可知添加有CAF的纤维素酶，经高温热处理之后仍具有活性，CAF明显改善纤维素酶的热稳定性。

实施例4α-淀粉酶热稳定性的测试

1)α-淀粉酶CAF组合物的制备以及处理

将1gα-淀粉酶加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液，得到α-淀粉酶溶液。取1mLα-淀粉酶溶液，加入2g CAF粉末即可得到1:2的α-淀粉酶CAF组合物，将其放置在烘箱中，60℃下，干燥1h，即可得到1:2的α-淀粉酶CAF组合物测试样品。

2)对照组合物的制备以及处理

将1gα-淀粉酶加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液，得到α-淀粉酶溶液。取1mLα-淀粉酶溶液，放置在烘箱中，60℃下，干燥1h，即可得到α-淀粉酶对照组样品。

3)α-淀粉酶活性测试

取1gα-淀粉酶CAF组合物测试样品和α-淀粉酶对照组样品加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液做成测试液，然后分别在37℃、50℃、60℃、70℃、80℃以及90℃下，处理30min，记录700nm处吸光值。一个单位α-淀粉酶活性定义为在37℃下，每分钟释放出1mmol磷酸，活性设置为100％。经不同温度热处理之后，α-淀粉酶CAF组合物测试样品活性请参见图3。

如图3所示，不含CAF的对照组测试样品，在50℃下，处理30min后，α-淀粉酶活性为90％，而在60℃下，处理30min后，即检测不出α-淀粉酶活性。而1:2混合的α-淀粉酶CAF组合物测试样品，在50℃下，处理30min后，α-淀粉酶活性为95％，在60℃下，处理30min后，α-淀粉酶活性为70％，在70℃下，处理30min后，α-淀粉酶活性为50％，在80℃下，处理30min后，α-淀粉酶活性仍然有10％的活性。

由上述结果可知添加有CAF的α-淀粉酶，经高温热处理之后仍具有活性，CAF明显改善α-淀粉酶热稳定性。

实施例5CAF不影响酶活性实验

1)植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶CAF组合物的制备以及处理

分别取1g植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液，分别得到植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶溶液。分别取1mL上述植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶溶液，分别加入2g CAF粉末即可得到1:2的植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶溶液CAF组合物，将其放置在烘箱中，60℃下，干燥1h，即可得到1:2的植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶CAF组合物测试样品。

2)对照组合物的制备以及处理

分别将1g植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液，得到植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶溶液。分别取1mL植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶溶液，放置在烘箱中，60℃下，干燥1h，即可得到植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶对照组样品。

3)植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶活性测试

取1g植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶CAF组合物测试样品和植酸酶、纤维素酶、α-淀粉酶对照组样品加入4mL，100mmol/L醋酸钠缓冲液做成测试液，37℃下，处理30min，记录700nm处吸光值。一个单位α-淀粉酶活性定义为在37℃下，每分钟释放出1mmol磷酸，活性设置为100％。

结果显示，经30min处理之后，所有测试样品相对活性均为100％，结果表明：CAF的加入并不影响酶本身的活性。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。