阅读说明：本技术 一种改善凝乳酶热稳定性的保护剂及方法 (Protective agent and method for improving heat stability of chymosin ) 是由 武彬 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于酶工程技术领域,具体涉及一种改善凝乳酶热稳定性的保护剂及方法。所述保护剂,由以下质量配比的成分组成为葡萄糖：氯化钙：牛血清蛋白为40：0.5-1.0：0.1-0.25。本发明提供了一种改善凝乳酶热稳定性的保护剂,该保护剂各组份间彼此之间存在相互作用,提高凝乳酶热稳定性的作用效果显著。通过调节三种保护剂的比例,凝乳酶10-15min失活的温度从58℃提高到80℃,一共提高了22℃,远高于单一保护剂组分的65-71℃。(The invention belongs to the technical field of enzyme engineering, and particularly relates to a protective agent and a method for improving the thermal stability of chymosin. The protective agent comprises the following components in parts by mass: calcium chloride: bovine serum albumin is 40: 0.5-1.0: 0.1-0.25. The invention provides a protective agent for improving the thermal stability of rennin, and the components of the protective agent interact with each other, so that the effect of improving the thermal stability of the rennin is obvious. By adjusting the proportion of the three protective agents, the inactivation temperature of the rennin within 10-15min is increased from 58 ℃ to 80 ℃, the inactivation temperature is increased by 22 ℃ in total and is far higher than 65-71 ℃ of the single protective agent component.)

一种改善凝乳酶热稳定性的保护剂及方法

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种改善凝乳酶热稳定性的保护剂及方法。

背景技术

凝乳酶是一种酸性蛋白酶，适宜在酸性条件下水解蛋白质，促进蛋白质的凝结。幼龄动物的消化系统发育还不完善，消化酶分泌不充分，对饲料中的营养吸收率较低。饲料中添加蛋白酶制剂，课提高动物特别是幼龄动物对饲料中蛋白成分的消化吸收率，促进其生长。饲料中蛋白质利用率的提高，不仅能节约饲料资源，降低养殖成本，而且还能降低动物粪便的氨氮排放，减轻饲养对环境的污染。

酶的热稳定性和存储稳定性是影响其在食品、药品领域应用的关键因素。因此，有必要开展提高凝乳酶热稳定性研究。有多种方法能够提高酶的热稳定性，包括：固定化、化学修饰和蛋白质工程等方法，固定化需要引入海藻酸钠等包埋剂，用于乳酪生产会引入大量杂质，不适用于乳酪生产。化学修饰会引入不可食用的化学试剂。蛋白质工程方法也存在诸多困难。一是通过对凝乳酶基因与分子结构设计改造，设计得到高热稳定性的酶分子困难很大；二是提高稳定性酶分子结构可能造成凝乳酶催化活性降低等其他问题。三是，凝乳酶是从小牛皱胃提取，获得高的凝乳酶分子结构，还需要对牛胚进行转基因操作。因此，进行乳酪生产的凝乳酶难以通过固定化、化学修饰和蛋白质工程的办法提高热稳定性。而从蛋白酶的热稳定性通常较低，大量文献显示凝乳酶在10-15min失活的热处理温℃通常都在55-70℃，尤其是在一定基础上继续提高酶的耐热性是相当困难的。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种改善凝乳酶热稳定性的保护剂，该保护剂各组份间彼此之间存在相互作用，提高凝乳酶热稳定性的作用效果显著。

为实现上述效果，本发明采用以下技术方案：

一种改善凝乳酶热稳定性的保护剂，由以下质量配比的成分组成： 0.02Mol/LpH6.0 KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液：葡萄糖：氯化钙：牛血清蛋白为58.75-59.4：40：0.5-1.0：0.1-0.25。。

一种上述保护剂处理凝乳酶的方法为：0-20℃下，将1份凝乳酶粉或凝乳酶溶液加入100份以上的保护剂溶液中，适当搅拌，是凝乳酶充分溶解混合均匀即可。

有益效果

本发明提供了一种改善凝乳酶热稳定性的保护剂，该保护剂各组份间彼此之间存在相互作用，提高凝乳酶热稳定性的作用效果显著。通过调节三种保护剂的比例，凝乳酶10-15min失活的温度从58℃提高到80℃，一共提高了22℃，远高于单一保护剂组分的65-71℃。

具体实施方式

下面结合实施例和对比例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

以下实施例中凝乳酶活力的测定方法为

凝乳酶活力测定采用Arima法：凝乳酶溶于0.02Mol/L pH6.0的 K2HPO4-KH2PO4缓冲液(以下试验所有溶液均以采用该缓冲体系)。取凝乳酶液0.5ml在35℃预热5min，加入到5ml含1.0％CaCl2 并充分预热的10％脱脂牛乳中，立即混匀并计时至管壁出现颗粒，记录凝乳时间(T)。以35℃40min凝乳1ml牛乳的酶量为一个酶活力单位(1U)，凝乳酶活力的计算公式如下：

式中：A为凝乳酶活力；T为凝乳时间，n为稀释倍数。

以下各实施例和对比例中的改善凝乳酶热稳定性的保护剂，由含有以下质量百分比的葡萄糖、氯化钙和牛血清蛋白组成，其余为 0.02Mol/L pH6.0 KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液，将该保护剂加入到3mg凝乳酶中，开始酶活力均为600IU/ml，各实施例和对比例所用保护剂的配比及其在75℃水浴保温15min后的残余酶活力见表1。

表1

由上表可知：采用葡萄糖浓度在40％，氯化钙浓度在0.5％-1.0％，牛血清浓度在0.1-0.25％，上述三种保护剂作为酶的保护剂，彼此之间存在相互作用。三种保护剂混合后对凝乳酶热稳定剂的保护效果并非都随其浓度线性增加，部分条件下会出现提高保护剂浓度热保护作用降低的情况，因此，该保护剂的组合是不易被发现的。

保护剂组合与各自单独成分的保护效果对比

因为不同保护剂对凝乳酶热稳定性的影响差别极大，因此，选择不同保温温度，尽量控制接近热处理时间(10-15min)测定酶的失活时间过程曲线，复合热保护剂对凝乳酶热稳定性的提升极其显著，具体结果见表2、表3和表4。

表2空白对照组与牛血清白蛋白组对凝乳酶热稳定剂的影响

牛血清白蛋白对凝乳酶的热保护作用较弱，根据表2的结果， 0.25％的牛血清白蛋白溶液对凝乳酶的热保护作用不强，0.5-1.0％浓度下，仅能使凝乳酶热稳定性提高2℃左右。因此，通常进行热稳定剂筛选时，可能不会选择牛血清白蛋白作为保护剂组分。尤其是牛血清白蛋白单因素实验结果显示0.5％以上的浓度才能有效，而表1的结果显示，牛血清最佳浓度范围是0.1％-0.25％，这更容易使牛血清白蛋白被忽略。然而表1中对比例3和实施例1的结果显示牛血清白蛋白作为热稳定剂的成分是有效果的，残余酶活力提高了超过 20％。

表3不同浓度氯化钙对凝乳酶热稳定性的影响

表3的结果显示氯化钙对凝乳酶热保护作用与其浓度相关性不大，0.1％-2％浓度的氯化钙溶液，都能使凝乳酶的失活温度从58℃提高至约65℃。然而，氯化钙在和葡萄糖以及牛血清白蛋白复配为保护剂时，钙离子与葡萄糖之间、钙离子与牛血清白蛋白之间存在相互作用，对复合保护剂的最佳浓度具有显著的影响。表1的结果显示，复合保护剂中氯化钙的最佳浓度为0.5％-1.0％；氯化钙浓度为1.5％的对比例8、11和16，热处理后残余酶活力低于0.5％和1.0％的实施例。氯化钙浓度为0.1％和0.25％时，牛血清白蛋白会与氯化钙相互作用，不足以对凝乳酶产生足够的保护作用。在复合保护剂配方优化时，通常会在保证保护效果的情况下，尽量选择较低浓度的保护剂。因此，通常会将氯化钙浓度选定为0.1％-0.25％。如前所述，保护剂配方优化不易发现和选用牛血清白蛋白，本部分优化过程中，更难以发现牛血清白蛋白对氯化钙有效浓度的影响，因此，很可能会直接选择浓度0.1％-0.25％的氯化钙，而非所述保护剂要求的0.5％-1.0％。

表4葡萄糖和热保护剂对凝乳酶热稳定性的影响

表4结果显示，凝乳酶10-15min失活的温度，保护剂组可达80℃，而40％葡萄糖组只能在71℃维持7分钟。根据表2、表3和表4的结果，所述保护剂的作用效果极显著，对凝乳酶失活温度的提升极大，是葡萄糖或者氯化钙纯组分做保护剂难以媲美的。

表5 65℃下，凝乳酶在不同溶液中保温不同时间的残余酶活力结果

巴氏消毒条件通常为62-65℃保温30min，或75-90℃保温15-16s。65℃下，凝乳酶在牛血清溶液和氯化钙溶液中均快速失活，在40％的葡萄糖溶液中保温30min凝乳酶活力损失43％，而同样条件下保护剂中凝乳酶活力损失不到20％。保护剂使凝乳酶热稳定性大幅提高，完全能够满足巴氏消毒对热稳定性的要求。同时，由于通常饲料制粒温度在 80℃左右，而调制时间在1min以内，因此，使用所述保护剂还能使凝乳酶的热稳定性达到饲料制粒的要求，极大地拓展了凝乳酶在颗粒饲料上的应用空间。