阅读说明：本技术 己糖激酶喷干粉的制备方法 (Preparation method of hexokinase spray-dried powder ) 是由 刘春卯 曹倩荣 郑翔 秦艳梅 马清河 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明属于酶制剂的制备,特别是指一种己糖激酶喷干粉的制备方法。按照公开号为CN106479992A中的方法制备己糖激酶纯酶液；在己糖激酶纯酶液中加入山梨醇、硫酸钠作为喷干保护剂,置于4℃保存3h,使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；以进风口80℃、出风口65℃、进样速度为12转/分钟的条件对加有保护剂的酶液喷雾干燥得到白色己糖激酶喷干粉。本发明解决了目前己糖激酶直接进行喷雾干燥导致的失活率高的问题,具有己糖激酶喷干粉酶活保存率高、相对液态己糖激酶酶性质较稳定、符合国标中对于试剂盒的使用要求且更利于保存等优点。(The invention belongs to preparation of enzyme preparations, and particularly relates to a preparation method of hexokinase spray-dried powder. Preparing a hexokinase pure enzyme solution according to the method disclosed in the publication number CN 106479992A; adding sorbitol and sodium sulfate into pure hexokinase enzyme solution as spray-drying protective agent, and storing at 4 deg.C for 3 hr to make the protective agent fully dissolved and uniformly distributed in the enzyme solution; and carrying out spray drying on the enzyme solution added with the protective agent under the conditions that an air inlet is 80 ℃, an air outlet is 65 ℃ and the sample injection speed is 12 r/min to obtain white hexokinase spray dry powder. The invention solves the problem of high inactivation rate caused by directly carrying out spray drying on the hexokinase at present, and has the advantages of high enzyme activity preservation rate of the hexokinase spray-dried powder, relatively stable property of the liquid hexokinase, accordance with the use requirements of the kit in the national standard, more favorable preservation and the like.)

己糖激酶喷干粉的制备方法

技术领域

本发明属于酶制剂的制备，特别是指一种己糖激酶喷干粉的制备方法。

背景技术

己糖激酶是生物糖酵解代谢途径的第一个酶，催化葡萄糖磷酸化，生成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸继续参与反应，完成糖代谢。依据此原理配制的己糖激酶法血糖检测试剂盒具有特异性强、准确度高的优点，适用于全自动分析仪，特别适用于急诊检验使用，利用己糖激酶法测定血糖含量也是国际上推荐的葡萄糖测定方法。

己糖激酶在生产和使用的过程中，需要长期保存，液体状态下4℃保存时间短，-20℃冻存会因反复冻融导致聚集、修饰、降解、污染等不良后果。喷雾干燥是通过喷雾装置将酶液喷成直径仅为几十微米的雾滴，分散于热气流中，水分迅速蒸发而得到粉末状的干燥酶制剂。加入喷干保护剂能够取代水与蛋白结合，使蛋白的结构免遭破坏，保证了己糖激酶的稳定性。己糖激酶的干粉在生物医药领域具有非常广泛的应用前景，但是目前国内己糖激酶的喷雾干燥技术还不够完善，己糖激酶直接进行喷雾干燥，失活率达99％以上，因此选择合适的己糖激酶喷干保护剂至关重要。

在己糖激酶法血糖试剂盒配制中，使用较多的是固态己糖激酶，固态己糖激酶较液态己糖激酶酶性质较稳定，而且也利于保存。己糖激酶作为诊断试剂盒配制中的关键酶，其酶性质决定了试剂盒品质的好坏，特别是己糖激酶的稳定性，直接影响诊断试剂盒的稳定性。在临床化学体外检测试剂(盒)的检测标准中(GB/T 26124-2011)规定，稳定性是检验诊断试剂盒合格与否的重要指标，因此，将液态己糖激酶制备成固态己糖激酶能更好的应用于试剂盒的配制中。

申请人检索到的专利文献包括：

查阅国内外相关专利，未曾查询到关于己糖激酶喷干粉的制备方法的相关专利。公开号为CN106932353A的专利文献中公开了一种稳定的酶法肌酸激酶检测诊断试剂盒，通过R1和R2两种试剂来完成诊断试剂盒的配制，其中己糖激酶是试剂R1的组成部分，但上述专利文献未提及己糖激酶喷干粉的制备；公开号为CN110038523A的专利文献中公开了一种用于分离纯化己糖激酶的亲和层析介质的制备方法，该专利文献公开了一种用于分离纯化己糖激酶的亲和层析介质的制备方法，该专利文献未提及己糖激酶喷干粉的制备。目前国内对己糖激酶的研究相对较少，公开号为CN106479992A的专利文献中公开了一种诊断用己糖激酶的制备方法，该专利是利用微生物菌株生产制备出了液态己糖激酶，但未涉及己糖激酶干粉的制备。公开号为CN108048441A的专利文献中公开了一种己糖激酶冻干粉的制备方法，该专利文献是利用冻干的手段制备己糖激酶冻干粉。

发明内容

本发明的目的在于提供一种己糖激酶喷干粉的制备方法，所制备的己糖激酶喷干粉相比现有方法制备的产品失活率低且性质稳定。

本发明的整体技术构思是：

己糖激酶喷干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号为CN106479992中的方法制备酶活为200-300U/ml的己糖激酶纯酶液；

B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入2％-5％(m/v)山梨醇、1％-2％(m/v)硫酸钠作为喷干保护剂，置于4℃保存1-3h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

C、以进风口70℃-80℃、出风口55℃-65℃、进样速度为12转/分钟的条件对步骤B中制备的物料喷雾干燥，得到白色己糖激酶喷干粉，低温保存。

目前国内对于己糖激酶酶活的检测方法在国标及行业技术规范中未见说明，为验证本发明所制备的己糖激酶喷干粉的酶活，申请人参照Sigma己糖激酶的测定方法进行酶活的检测，具体步骤如下：

测定方法：分别添加0.05mol/L的TEA-HCL1ml，0.555mol/L的D-葡萄糖1ml，0.019mol/L的ATP0.1ml，0.1mol/L的MgCl₂0.2ml，0.014mol/L的NADP+0.2ml，125U/mL的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶0.02ml到试验管和空白管。混匀后于25℃水浴1min，于340nm处读取吸光值A₁。然后试验管加入0.05mL待测酶液，空白管加入ddH₂O0.05mL，于25℃继续反应5min，后读取吸光值A2。

酶活计算公式(U/mL)＝(ΔA试验管-ΔA空白管)×2.57×Df÷6.22÷0.05

公式中

2.57：反应液总体积；

Df：稀释倍数；

6.22：β-NADPH在340nm处的吸光系数；

0.05：比色皿体积。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

本发明通对喷干保护剂进行筛选、优化组合，最终得到了一种酵母产己糖激酶的喷干保护剂，喷干后酶活保存率可达50％(未加保护剂进行喷干处理后酶活损失率高达99％)。这为己糖激酶应用于生物医药领域提供了便利，采用本发明的方法制备出的己糖激酶喷干粉符合试剂盒的使用要求，提高了诊断试剂盒的稳定性。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。

实施例1

己糖激酶喷干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号为CN106479992中的方法制备酶活为300U/ml的己糖激酶纯酶液；

B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入5％(m/v)山梨醇、2％(m/v)硫酸钠作为喷干保护剂，置于4℃保存3h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

C、以进风口80℃、出风口65℃、进样速度为12转/分钟的条件对步骤B中制备的物料喷雾干燥，得到白色己糖激酶喷干粉，-20℃保存。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

己糖激酶喷干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号为CN106479992中的方法制备酶活为200U/ml的己糖激酶纯酶液；

B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入2％(m/v)山梨醇、1％(m/v)硫酸钠作为喷干保护剂，置于4℃保存1h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

C、以进风口70℃、出风口55℃、进样速度为12转/分钟的条件对步骤B中制备的物料喷雾干燥，得到白色己糖激酶喷干粉，-20℃保存。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：

己糖激酶喷干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号为CN106479992中的方法制备酶活为250U/ml的己糖激酶纯酶液；

B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入4％(m/v)山梨醇、1.5％(m/v)硫酸钠作为喷干保护剂，置于4℃保存2h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

C、以进风口75℃、出风口60℃、进样速度为12转/分钟的条件对步骤B中制备的物料喷雾干燥，得到白色己糖激酶喷干粉，-20℃保存。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：

己糖激酶喷干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号为CN106479992中的方法制备酶活为230U/ml的己糖激酶纯酶液；

B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入3％(m/v)山梨醇、1.2％(m/v)硫酸钠作为喷干保护剂，置于4℃保存1.3h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

C、以进风口72℃、出风口58℃、进样速度为12转/分钟的条件对步骤B中制备的物料喷雾干燥，得到白色己糖激酶喷干粉，-20℃保存。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：

己糖激酶喷干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号为CN106479992中的方法制备酶活为280U/ml的己糖激酶纯酶液；

B、在步骤A中制备的己糖激酶纯酶液中加入4％(m/v)山梨醇、1.8％(m/v)硫酸钠作为喷干保护剂，置于4℃保存1.8h，使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

C、以进风口78℃、出风口62℃、进样速度为12转/分钟的条件对步骤B中制备的物料喷雾干燥，得到白色己糖激酶喷干粉，-20℃保存。

申请人采用Sigma己糖激酶的测定方法对实施例1-5中制备的己糖激酶喷干粉进行酶活的检测，其结果如下：

	酶活(U/ml)	失活率(％)
			实施例1制备的己糖激酶冻干粉	156	48％
实施例2制备的己糖激酶冻干粉	96	52％
			实施例3制备的己糖激酶冻干粉	127	49％
实施例4制备的己糖激酶冻干粉	113	51％
			实施例5制备的己糖激酶冻干粉	143	49％

申请人需要说明的是：

目前sigma官网有己糖激酶固态酶在售，产品货号H4502，其单位酶活要比本发明中得到的己糖激酶喷干粉高，申请人认为主要原因在于发酵所用的菌株及对酶液处理的技术手段不同有关。申请人利用公开号为CN106479992A的专利文献中产己糖激酶酵母菌株(产己糖激酶菌株来源：安琪酵母股份有限公司生产的酿酒酵母，产品标准代码为GB/T20886)经发酵提纯得到己糖激酶纯酶液，进行喷雾干燥制备己糖激酶喷干粉，相比直接对己糖激酶纯酶液进行喷雾干燥，己糖激酶喷干粉酶活失活率由99％降为50％左右。