阅读说明：本技术 葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法 (Preparation method of glucose oxidase freeze-dried powder ) 是由 罗同阳 高庆华 董聪 王玥 王庆庆 马清河 秦艳梅 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于酶制剂的制备,特别是指葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法。按照公开号CN107937360A中的方法制备含有葡萄糖氧化酶的发酵液；将含有葡萄糖氧化酶的发酵液高速离心去除发酵液中的菌体,将离心后上清液用无水乙醇纯化后用磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活；加入PEG2000作为冻干保护剂使其充分溶解并在酶液中分布均匀；预冻后置于真空冷冻干燥剂内冷冻干燥得到淡黄色葡萄糖氧化酶冻干粉。本发明解决了目前葡萄糖氧化酶直接进行冷冻干燥导致的酶活回收率低的问题,具有葡萄糖氧化酶冻干粉酶活回收率高、易于保存和运输、为葡萄糖氧化酶应用于生物医药、饲料及食品加工等领域提供了便利等优点。(The invention belongs to preparation of enzyme preparations, and particularly relates to a preparation method of glucose oxidase freeze-dried powder. Preparing a fermentation broth containing glucose oxidase according to the method of publication No. CN 107937360A; centrifuging the fermentation liquor containing glucose oxidase at high speed to remove thalli in the fermentation liquor, purifying the centrifuged supernatant with absolute ethyl alcohol, and diluting with phosphate buffer solution to obtain the required enzyme activity; adding PEG2000 as freeze-drying protective agent to make it fully dissolved and uniformly distributed in enzyme solution; and after pre-freezing, placing the mixture in a vacuum freezing drying agent for freeze-drying to obtain the faint yellow glucose oxidase freeze-dried powder. The invention solves the problem of low enzyme activity recovery rate caused by direct freeze drying of the existing glucose oxidase, and has the advantages of high enzyme activity recovery rate of glucose oxidase freeze-dried powder, easy storage and transportation, convenience for applying the glucose oxidase to the fields of biological medicine, feed, food processing and the like.)

葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法

技术领域

本发明属于酶制剂的制备，特别是指葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶应用范围广泛，在医药行业中，葡萄糖氧化酶由于对β-D-葡萄糖具有严格的底物专一性，因此通常将葡萄糖氧化酶制备成试纸或试剂盒，用于检测血糖浓度，诊断糖尿病。饲料行业中，该酶作为饲料添加剂，有利于动物的营养吸收，减少腹泻率。葡萄糖氧化酶还可作为食品添加剂用于食品保鲜，对果酒护色也有一定效果。

真空冷冻干燥技术，简称为冻干技术，广泛应用于食品、医药、生物等各个领域，是将样品预先冻成固体，然后在低温低压的条件下，从冻结状态不经过液态而直接升华除去水分的一种干燥方法。葡萄糖氧化酶干粉制剂在生物医药领域具有非常广泛的应用前景，但是目前国内企业葡萄糖氧化酶制剂产品与国外企业相比仍有很大差距。葡萄糖氧化酶作为一种蛋白质，遇高温易导致失活变性，冻干技术的操作过程均处于低温状态，更适用于其干粉制剂的制备。由于冻干是一个复杂的相变过程，在冻结、冻融、干燥和储存过程中，存在多种诱导酶变性的因素，因此需在冻干过程中添加保护剂。加入的冻干保护剂能够取代水与蛋白结合，使蛋白的结构免遭破坏，保证了葡萄糖氧化酶的稳定性。葡萄糖氧化酶经过冷冻干燥后不易变质、可长期储存，易复水再生，有利于活性的保持。真空冷冻干燥方法制备葡萄糖氧化酶制剂与喷雾干燥相比回收率高，但相关技术还不够完善，葡萄糖氧化酶直接进行冷冻干燥，酶活回收率仅能达70％左右，因此选择合适的葡萄糖氧化酶冻干保护剂至关重要。

在医药行业中，生物技术产品常用的剂型为固态，因此葡萄糖氧化酶作为关键酶常以固体的形式被制成血糖试纸或诊断试剂盒来使用。在其他应用行业中，固态葡萄糖氧化酶相比液态更有利于运输和保存，使用更为便利。

申请人检索的背景文献情况如下：

公开号为CN1060026A的专利文献中公开了一种葡萄糖氧化酶冷干粉制造工艺，该专利的目的是采用新的纯化工艺对葡萄糖氧化酶进行冻干，并未提及使用何种保护剂及添加量；公开号为CN101481680A的专利文献中公开了一种葡萄糖氧化酶生产方法，该专利利用青霉菌制备葡萄糖氧化酶发酵液，经纯化脱盐后冻干制成固体制剂，但该专利也未提及使用何种保护剂以及添加剂量；公开号为CN109825483A的专利文献中公开了一种高产葡萄糖氧化酶生产工艺，该专利利用发酵毕赤酵母生产制备出液体发酵液，再经过喷雾干燥制得葡萄糖氧化酶粉末，未提及使用冻干的方法制备葡萄糖氧化酶干粉。

《点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究》(生物技术通报2016，32(7):152-159)中公开了克隆点青霉菌(Penici l l ium notatum)中的葡萄糖氧化酶基因(GOD)，在毕赤酵母(Phchia pastoris)中异源表达，纯化并研究其酶学性质。利用PCR技术从点青霉No.8312菌株的基因组DNA中克隆得到GOD基因，将该基因克隆到穿梭载体pMD-AOX上并在毕赤酵母X33中表达，对纯化后的葡萄糖氧化酶的酶学性质进行分析。结果显示，X33-GOD可高表达具有活性的GOD，在30℃、pH＝6.5的条件下，其培养液上清GOD酶活可达496U/mL，比活123.0U/mg；重组表达的葡萄糖氧化酶最适温度为40-45℃，最适pH＝6.0，酶的稳定性研究表明，该酶在pH3.5-7.0区间和温度低于50℃下稳定。1mmol/L Zn2+对其有激活作用；Ag+对该酶活性有较大抑制作用。构建出GOD的高产毕赤酵母工程菌株，与点青霉GOD相比具有更高的发酵酶活和比活。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法，所制备的葡萄糖氧化酶冻干粉失活率低且性质稳定，利于保存。

本发明的整体技术构思是：

葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号CN107937360A中的方法制备含有葡萄糖氧化酶的发酵液；

B、在步骤A中制备的含有葡萄糖氧化酶的发酵液高速离心去除发酵液中的菌体；将离心后上清液用无水乙醇纯化后用磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活；

C、在步骤B所制备的纯酶液中加入体积质量比为2％-6％的PEG2000作为冻干保护剂，混匀使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

D、在预冻温度为-20℃的条件下预冻12-14h，预冻后置于真空冷冻干燥机内冷冻干燥16-20h，得到淡黄色葡萄糖氧化酶冻干粉，低温保存。

本发明的具体技术构思还有：

所述的步骤B中去除发酵液中菌体的条件为：在4℃、6000-8000转/分钟的条件下离心20-30分钟。

步骤B中采用无水乙醇纯化的工艺条件为：在离心后上清液中加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为20％-25％，4℃静置过夜，6000-8000转/分钟离心20-30分钟；取上清液，再加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为60％-65％，4℃静置过夜，6000-8000转/分钟离心20-30分钟，将得到的沉淀用浓度为0.1-0.15mol/L、pH＝7.1-7.5的磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活。

目前国内对于葡萄糖氧化酶酶活的检测方法在国标及行业技术规范中未见说明，为验证本发明所制备的己糖激酶冻干粉的酶活，本发明中测定方法依照已公开发表文献：高庆华，胡美荣，吴芳彤等.点青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶学性质研究[J].生物技术通报，2016，32(7):152-159。

具体测定方法：在3mL的反应体系中，包含0.5mol/L醋酸缓冲液(pH5.1)，0.17mmol/L邻-联茴香胺溶液、1.72％葡萄糖溶液及0.1mg/mL辣根过氧化物酶，35℃震荡混匀，加入0.1mL葡萄糖氧化酶溶液，使用分光光度计于A＝500nm记录1分钟变化的吸光度值ΔA500。

酶活计算公式

X＝(ΔA500×3.1×Df)÷7.5÷0.1

公式中

X：样品酶活(U/mL)；

3.1：反应体积；

Df：稀释倍数；

7.5：葡萄糖内酯在500nm处的消光系数；

0.1：加入酶液体积。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

毕赤酵母基因工程菌产葡萄糖氧化酶不添加任何保护剂进行冻干处理后，其酶活回收率为70％左右。本发明通对冻干保护剂进行筛选，最终得到了一种葡萄糖氧化酶冻干保护剂，采用本发明中的方法冻干后酶活回收率可达90％以上。本发明制备的葡萄糖氧化酶冻干粉酶活回收率高，易于保存和运输，为葡萄糖氧化酶应用于生物医药、饲料及食品加工等领域提供了便利。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。

实施例1

葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号CN107937360A中的方法制备含有葡萄糖氧化酶的发酵液；

B、在步骤A中制备的含有葡萄糖氧化酶的发酵液高速离心去除发酵液中的菌体；将离心后上清液用无水乙醇纯化后用磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活；

C、在步骤B所制备的纯酶液中加入体积质量比为2％的PEG2000作为冻干保护剂，混匀使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

D、在预冻温度为-20℃的条件下预冻12h，预冻后置于真空冷冻干燥机内冷冻干燥16h，得到淡黄色葡萄糖氧化酶冻干粉，低温保存。

所述的步骤B中去除发酵液中菌体的条件为：在4℃、6000转/分钟的条件下离心20分钟。

步骤B中采用无水乙醇纯化的工艺条件为：在离心后上清液中加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为20％，4℃静置过夜，6000转/分钟离心20分钟；取上清液，再加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为60％，4℃静置过夜，6000转/分钟离心20分钟，将得到的沉淀用浓度为0.1mol/L、pH＝7.1的磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活350U/mL。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号CN107937360A中的方法制备含有葡萄糖氧化酶的发酵液；

B、在步骤A中制备的含有葡萄糖氧化酶的发酵液高速离心去除发酵液中的菌体；将离心后上清液用无水乙醇纯化后用磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活；

C、在步骤B所制备的纯酶液中加入体积质量比为6％的PEG2000作为冻干保护剂，混匀使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

D、在预冻温度为-20℃的条件下预冻14h，预冻后置于真空冷冻干燥机内冷冻干燥20h，得到淡黄色葡萄糖氧化酶冻干粉，低温保存。

所述的步骤B中去除发酵液中菌体的条件为：在4℃、8000转/分钟的条件下离心30分钟。

步骤B中采用无水乙醇纯化的工艺条件为：在离心后上清液中加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为25％，4℃静置过夜，8000转/分钟离心20-30分钟；取上清液，再加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为65％，4℃静置过夜，8000转/分钟离心30分钟，将得到的沉淀用浓度为0.15mol/L、pH＝7.5的磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活407U/mL。

其余内容同实施例1。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：

葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号CN107937360A中的方法制备含有葡萄糖氧化酶的发酵液；

B、在步骤A中制备的含有葡萄糖氧化酶的发酵液高速离心去除发酵液中的菌体；将离心后上清液用无水乙醇纯化后用磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活；

C、在步骤B所制备的纯酶液中加入体积质量比为4％的PEG2000作为冻干保护剂，混匀使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

D、在预冻温度为-20℃的条件下预冻13h，预冻后置于真空冷冻干燥机内冷冻干燥18h，得到淡黄色葡萄糖氧化酶冻干粉，低温保存。

所述的步骤B中去除发酵液中菌体的条件为：在4℃、7000转/分钟的条件下离心25分钟。

步骤B中采用无水乙醇纯化的工艺条件为：在离心后上清液中加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为23％，4℃静置过夜，7000转/分钟离心25分钟；取上清液，再加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为63％，4℃静置过夜，7000转/分钟离心25分钟，将得到的沉淀用浓度为0.12mol/L、pH＝7.3的磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活132U/mL。

其余内容同实施例1。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：

葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号CN107937360A中的方法制备含有葡萄糖氧化酶的发酵液；

B、在步骤A中制备的含有葡萄糖氧化酶的发酵液高速离心去除发酵液中的菌体；将离心后上清液用无水乙醇纯化后用磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活；

C、在步骤B所制备的纯酶液中加入体积质量比为3％的PEG2000作为冻干保护剂，混匀使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

D、在预冻温度为-20℃的条件下预冻12.5h，预冻后置于真空冷冻干燥机内冷冻干燥17h，得到淡黄色葡萄糖氧化酶冻干粉，低温保存。

所述的步骤B中去除发酵液中菌体的条件为：在4℃、6500转/分钟的条件下离心23分钟。

步骤B中采用无水乙醇纯化的工艺条件为：在离心后上清液中加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为21％，4℃静置过夜，6500转/分钟离心22分钟；取上清液，再加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为62％，4℃静置过夜，6500转/分钟离心22分钟，将得到的沉淀用浓度为0.11mol/L、pH＝7.2的磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活267U/mL。

其余内容同实施例1。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：

葡萄糖氧化酶冻干粉的制备方法，由如下工艺步骤组成：

A、按照公开号CN107937360A中的方法制备含有葡萄糖氧化酶的发酵液；

B、在步骤A中制备的含有葡萄糖氧化酶的发酵液高速离心去除发酵液中的菌体；将离心后上清液用无水乙醇纯化后用磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活；

C、在步骤B所制备的纯酶液中加入体积质量比为5％的PEG2000作为冻干保护剂，混匀使保护剂充分溶解并在酶液中分布均匀；

D、在预冻温度为-20℃的条件下预冻13.5h，预冻后置于真空冷冻干燥机内冷冻干燥19h，得到淡黄色葡萄糖氧化酶冻干粉，低温保存。

所述的步骤B中去除发酵液中菌体的条件为：在4℃、7500转/分钟的条件下离心20-30分钟。

步骤B中采用无水乙醇纯化的工艺条件为：在离心后上清液中加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为24％，4℃静置过夜，7500转/分钟离心28分钟；取上清液，再加入无水乙醇至体系中乙醇终浓度为64％，4℃静置过夜，7500转/分钟离心28分钟，将得到的沉淀用浓度为0.14mol/L、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液稀释至所需酶活312U/mL。

其余内容同实施例1。

申请人采用本发明说明书记载的葡萄糖氧化酶的测定方法对实施例1-5中制备的葡萄糖氧化酶冻干粉进行酶活的检测，其结果如下：

申请人需要说明的是：

目前s igma官网有葡萄糖氧化酶固态酶在售，产品货号为G6766，其单位酶活比依据本发明方法得到的葡萄糖氧化酶冻干粉高，申请人认为这与发酵所用的菌株不同以及对酶液处理的技术手段不同有关。申请人以毕赤酵母基因工程菌为出发菌株，经发酵提纯得到葡萄糖氧化酶纯酶液，利用该方法进行冷冻干燥制备葡萄糖氧化酶冻干粉，相比直接对葡萄糖氧化酶纯酶液进行冷冻干燥，葡萄糖氧化酶冻干粉酶活回收率由70％提高到90％以上。