阅读说明：本技术 皮肤治疗方法 (Skin treatment method ) 是由 C.林施 P.安德勒 A.辛赫 于 2018-03-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种式(I)化合物<Image he="476" wi="700" file="DDA0002234229290000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>其中：A、B、C、D、W、X、Y和Z各自独立地选自H和OH；或其盐；其用于治疗和/或预防受试者的皮肤病状,其中局部施用所述式(I)化合物或其盐。本发明进一步提供式(i)化合物的局部组合物和制备所述组合物的方法。(The invention provides a compound of formula (I) Wherein: A. b, C, D, W, X, Y and Z are each independently selected from H and OH; or a salt thereof; for use in the treatment and/or prevention of a skin condition in a subject, wherein the compound of formula (I) or a salt thereof is administered topically. The invention further provides topical compositions of the compounds of formula (i) and methods of making the compositions.)

皮肤治疗方法

技术领域

本公开涉及用于治疗和预防皮肤病状和病症，如肝斑的方法，其涉及局部施用尿石素。本公开还涉及化妆品用途，如皮肤亮白。还提供了包括尿石素的局部组合物，以及用于制备此类组合物的方法，例如涉及使用微粉化的尿石素。

背景技术

与色素沉着过度相关的皮肤病状，如肝斑，是影响许多人的问题。肝斑往往在面部表现为棕色、棕褐色或灰色斑点，并且最常影响20-50岁年龄段的女性，尽管男性也可能发生情况。可能导致肝斑的可能性和严重程度的因素包含暴露于太阳光/UV辐射、怀孕以及暴露于包含避孕药的激素药物。肝斑也被称为黄褐斑和妊娠面斑。治疗包含亮肤剂，如氢醌或曲酸、皮肤磨削和激光治疗。

然而，含氢醌和曲酸的产品可能与引起刺激、炎症和/或接触性皮炎有关，并且在一些情况下，氢醌可以引起皮肤变黑。为了减轻皮肤刺激，有时需要将类固醇活性成分与亮肤剂一起使用。也可以使用化学换肤(例如基于乙醇酸的)，但是在一些情况下，可能发生瘢痕形成和/或色素减退。因此，仍然需要有效的疗法来治疗肝斑，以及与色素沉着过度相关的其它皮肤病状，例如雀斑/着色斑，并且还需要可以使皮肤免受暴露于太阳光和其它环境条件的破坏性影响的另外药剂。

许多个人出于美容原因选择进行皮肤亮白或皮肤漂白手术，例如以达到肤色均匀。还希望为此类治疗提供改进的或替代性的方法。

尿石素是由例如哺乳动物结肠微生物群产生的一组鞣花单宁和鞣花酸衍生的代谢物。尿石素已经被提议为可用于促进寿命的化合物，参见例如以Amazentis SA名义的WO2014/004902。已经提出了用于口服尿石素的组合物，例如WO2014/004092描述了其中尿石素A与食物混合的动物实验。

发明内容

本公开提供了一种预防和/或治疗受试者的皮肤病状、疾病或病症的方法，其包括：

向所述受试者局部施用有效量的式(I)化合物

其中：

A、B、C、D、W、X、Y和Z各自独立地选自H和OH；

或其盐。

本公开还提供了一种式(I)化合物

其中：

A、B、C、D、W、X、Y和Z各自独立地选自H和OH；

或其盐；

用于治疗和/或预防受试者的皮肤病状，其中局部施用所述式(I)化合物或其盐。

本公开还提供了式(I)化合物的用途

其中：

A、B、C、D、W、X、Y和Z各自独立地选自H和OH；

或其盐；

用于制造用于治疗和/或预防受试者的皮肤病状的药物，其中局部施用所述式(I)化合物或其盐。

本公开还提供一种皮肤漂白和/或亮化受试者的皮肤颜色和/或亮化皮肤色调的方法，其包括：

向所述受试者局部施用有效量的式(I)化合物

其中：

A、B、C、D、W、X、Y和Z各自独立地选自H和OH；

或其盐。

一种皮肤漂白和/或亮化受试者的皮肤颜色(皮肤美白)和/或亮化皮肤色调的方法包括脱色素。

本公开还提供了一种用于局部施用的组合物，其包括：

a)式(I)化合物

其中：

A、B、C、D、W、X、Y和Z各自独立地选自H和OH；

或其盐；

以及

b)至少一种适用于局部施用的赋形剂。

本公开还提供了一种用于获得局部施用的组合物的方法，所述组合物包括：

a)式(I)化合物

其中：

A、B、C、D、W、X、Y和Z各自独立地选自H和OH；

或其盐；

以及

b)至少一种适用于局部施用的赋形剂；

并且所述方法包括：

-提供微粉化的式(I)化合物或其盐；以及

-将所述微粉化的式(I)化合物或其盐与至少一种适用于局部施用的赋形剂混合。

本公开还提供了一种用于获得局部施用的组合物的方法，所述组合物包括：

a)式(I)化合物

其中：

A、B、C、D、W、X、Y和Z各自独立地选自H和OH；

或其盐；

以及

b)至少一种适用于局部施用的赋形剂；

并且所述方法包括：

-提供D₅₀处于0.5μm到50μm的范围内，并且D₉₀处于5μm到100μm的范围内的微粉化的式(I)化合物或其盐；以及

-将所述微粉化的式(I)化合物或其盐与至少一种适用于局部施用的赋形剂混合。

在本发明的另一个实施例中，提供了可通过本发明的方法获得的组合物。

附图说明

图1示出在用25μM、50μM和100μM的水(NC)、DMSO 0.5％、尿石素A(UA)处理96小时之后，在EpiDerm^TM组织中进行的皮肤细胞活力测定的结果。虚线对应于90％的活力，低于阈值的化合物被认为是刺激性的。

图2是用水、2％曲酸、DMSO 0.2％和50μM和100μM下的尿石素A处理14天之后，MelanoDerm^TM组织的顶视图。

图3表示用水、曲酸2％、DMSO 0.2％和50μM和100μM下的尿石素A处理4天、7天、11天和14天之后，从MelanoDerm^TM组织测量的L值。使用双向ANOVA测试计算统计学。**P<0.01；***P<0.001对应于Holm-Sidak事后测试，以针对阴性对照组对每组进行多重比较。

图4表示用水、曲酸2％、DMSO 0.2％和50μM和100μM下的尿石素A处理14天之后，从MelanoDerm^TM组织测量的黑色素含量。使用单向ANOVA进行统计学显著性。***P<0.001对应于Dunnett事后测试，以针对阴性对照对每组进行多重比较。还报道了额外的学生t测试的P值，以比较曲酸2％和尿石素A100μM组。

具体实施方式

本公开提供了治疗和/或预防涉及局部施用式(I)化合物，即尿石素的皮肤病状的方法。虽然尿石素已经口服给药，但是在许多情况下，化合物的生物利用度有限。还发现尿石素化合物是高度不溶于水的。本发明人已经发现，尽管具有上述性质，但是尿石素适合于局部施用，并且在用于色素沉着过度的皮肤病状肝斑的体外测定中显示出意想不到的良好结果。

式(I)化合物和其盐

尿石素是由包含人类的哺乳动物、肠道微生物群对鞣花单宁和鞣花酸的作用产生的代谢产物。鞣花单宁和鞣花酸是食物中常见的化合物，如石榴、坚果和浆果。鞣花单宁本身最低限度地被肠道吸收。尿石素是一类具有上述代表性结构(I)的化合物。一些特别常见的尿石素的结构描述于以下表1中，参考结构(I)。

表1：

在实践中，对于商业规模的产品，合成尿石素是方便的。合成途径描述于例如WO2014/004902中。

根据结构(I)的任何结构的尿石素可以用于本公开的方法中。

在本公开的用途和方法的一个方面，合适的化合物是式(I)化合物，其中A、C、D和Z独立地选自H和OH，并且B、W、X和Y都是H。

特别合适的化合物是天然存在的尿石素。因此，Z优选地是OH，并且W、X和Y优选地都是H。当W、X和Y都是H，并且A和B两者都是H，并且C、D和Z都是OH时，然后化合物是尿石素C。当W、X和Y都是H，并且A、B、C和D都是H，并且Z是OH时，然后化合物是尿石素B。当W、X和Y都是H，并且A、B和C都是H，并且D和Z两者都是OH时，然后化合物是尿石素A。优选地，本公开的方法中使用的尿石素是尿石素A、尿石素B、尿石素C或尿石素D。最优选地，所使用的尿石素是尿石素A。

本发明还涵盖式(I)化合物的合适的盐的用途，例如药学上可接受的盐。根据本发明的合适的盐包含由有机碱或无机碱形成的那些盐。药学上可接受的碱盐包含铵盐、碱金属盐，例如钾和钠的那些；碱土金属盐，例如钙和镁的那些；以及具有有机碱的盐，例如二环己胺、N-甲基-D-葡萄糖、吗啉、硫代吗啉、哌啶、吡咯烷；单-、二-或三-低级烷基胺，例如乙基-、叔丁基-、二乙基-、二异丙基-、三乙基-、三丁基-或二甲基-丙基胺；或单-、二-或三羟基低级烷基胺，例如单-、二-或三乙醇胺。

有机化学领域的技术人员将理解，许多有机化合物可以与溶剂形成络合物，在所述溶剂中它们发生反应或从中沉淀或结晶。这些络合物被称为“溶剂化物”。本领域技术人员将理解，本发明还涵盖式(I)化合物的溶剂化物以及其盐的溶剂化物。溶剂化物包含相关溶剂是药学上可接受的那些溶剂化物。水合物(其中相关溶剂是水)是溶剂化物的实例。

组合物

本公开的方法涉及局部施用式(I)化合物或其盐。因此，本公开还涉及用于局部施用的组合物，其包括：

a)式(I)化合物

其中：

A、B、C、D、W、X、Y和Z各自独立地选自H和OH；

或其盐；

以及

b)至少一种适用于局部施用的赋形剂。

在一些优选实施例中，组合物中使用的式(I)化合物是尿石素A。

在一些优选实施例中，用于生产本公开的组合物的式(I)化合物或其盐(例如尿石素A)已经被微粉化。化合物的微粉化导致良好的活性，并且产生易于应用于皮肤的局部组合物。

如果使用微粉化的式(I)化合物或其盐，然后优选地，化合物或盐(例如尿石素A)的D₅₀尺寸小于100μm-也就是说，按质量计50％的化合物或盐的粒径尺寸小于100μm。更优选地，化合物或盐(例如尿石素A)的D₅₀尺寸小于75μm，例如小于50μm，例如小于25μm，例如小于20μm，例如小于10μm。更优选地，化合物或盐(例如尿石素A)的D₅₀处于0.5-50μm的范围内，例如0.5μm到20μm，例如0.5μm到10μm，例如1.0μm到10μm，例如1.5μm到7.5μm，例如2μm到7μm，例如2.8μm到5.5μm。在一些实施例中，化合物或盐(例如尿石素A)的D₅₀是约3.9μm。在一些实施例中，化合物或盐(例如尿石素A)的D₅₀是约7.1μm。优选地，化合物或盐(例如尿石素A)的D₉₀尺寸小于100μm。更优选地，化合物或盐(例如尿石素A)的D₉₀尺寸小于75μm，例如小于50μm，例如小于25μm，例如小于20μm，例如小于15μm。化合物或盐(例如尿石素A)的D₉₀优选地处于5μm到100μm的范围内，例如5μm到50μm，例如5μm到20μm，例如7.5μm到15μm，例如8μm到20μm，例如8.2μm到16.0μm。在一些实施例中，化合物或盐(例如尿石素A)的D₉₀是约11.5μm。在一些实施例中，化合物或盐(例如尿石素A)的D₉₀是约13.5μm。优选地，化合物或盐(例如尿石素A)的D₁₀处于0.5μm到2μm的范围内，或处于0.5–1.0μm的范围内。优选地，化合物或盐(例如尿石素A)的D₁₀尺寸小于50μm。更优选地，化合物或盐(例如尿石素A)的D₁₀尺寸小于25μm，例如小于20μm，例如小于15μm，例如小于10μm，例如小于5μm，例如小于2μm。化合物或盐(例如尿石素A)的D₁₀优选地处于0.1μm到25μm的范围内，例如0.1μm到10μm，例如0.5μm到5μm，例如0.5μm到2μm，例如0.5μm到1.0μm。在一些实施例中，化合物或盐(例如尿石素A)的D₁₀是约1.2μm。在一些实施例中，化合物或盐(例如尿石素A)的D₁₀是约0.7μm。在一些实施例中，式(I)化合物或其盐(例如尿石素A)的D₅₀处于0.5μm到50μm的范围内，并且D₉₀处于5μm到100μm的范围内。在一些实施例中，式(I)化合物或其盐(例如尿石素A)的D₉₀处于8μm到20μm的范围内，D₅₀处于2μm到7μm的范围内，并且D₁₀处于0.5μm到2μm的范围内。在一些实施例中，式(I)化合物或其盐(例如尿石素A)的D₉₀处于8.2μm到16.0μm的范围内，D₅₀处于2.8μm到5.5μm的范围内，并且D₁₀处于0.5μm到1.0μm的范围内。微粉化可以通过本领域中建立的方法实现，例如可以使用压缩力研磨、hamer研磨、通用或针磨、或喷射研磨(例如螺旋喷射研磨或流化床喷射研磨)。喷射研磨特别合适。用于确定粒度的方法是本领域已知的，例如可以使用如BeckmanCounter L3 13 320或Malvern Mastersizer 2000等设备。在一些实施例中，可以使用Malvern Mastersizer 2000测定粒度(例如D₁₀值、D₅₀值和/或D₉₀值)。

在替代性实施例中，化合物或盐(例如尿石素A)的D₅₀尺寸不超过75μm，例如不超过50μm，例如不超过25μm，例如不超过20μm，例如不超过10μm。

在替代性实施例中，化合物或盐(例如尿石素A)的D₉₀尺寸不超过75μm，例如不超过50μm，例如不超过30μm，例如不超过25μm，例如不超过20μm，例如不超过15μm。

在替代性实施例中，化合物或盐(例如尿石素A)的D₁₀尺寸不超过25μm，例如不超过20μm，例如不超过15μm，例如不超过10μm，例如不超过5μm，例如不超过2μm。

因此，在一些实施例中，组合物可通过包括以下的方法获得：

-提供例如D₅₀处于0.5μm到50μm的范围内，并且D₉₀处于5μm到100μm的范围内的微粉化的式(I)化合物或其盐(如尿石素A)；以及

-将所述微粉化的式(I)化合物或其盐与至少一种适用于局部施用的赋形剂混合。

因此，还提供了一种用于获得局部施用的组合物的方法，所述组合物包括：

a)式(I)化合物

其中：

A、B、C、D、W、X、Y和Z各自独立地选自H和OH；

或其盐；

以及

b)至少一种适用于局部施用的赋形剂；

并且所述方法包括：

-使式(I)化合物或其盐微粉化；以及

-将所述微粉化的式(I)化合物或其盐与至少一种适用于局部施用的赋形剂混合。在一些优选实施例中，化合物是尿石素A。

因此，还提供了一种用于获得局部施用的组合物的方法，所述组合物包括：

a)式(I)化合物

其中：

A、B、C、D、W、X、Y和Z各自独立地选自H和OH；

或其盐；

以及

b)至少一种适用于局部施用的赋形剂；

并且所述方法包括：

-使式(I)化合物或其盐微粉化，从而产生D₅₀处于0.5μm到50μm的范围内，并且D₉₀处于5μm到100μm的范围内的微粉化的式(I)化合物或其盐；以及

-将所述微粉化的式(I)化合物或其盐与至少一种适用于局部施用的赋形剂混合。在一些优选实施例中，化合物是尿石素A。

如上所述，式(I)化合物是由哺乳动物肠道微生物群对鞣花单宁和鞣花酸的作用产生的代谢产物，所述鞣花单宁和鞣花酸是通常发现于食物中的多酚化合物，如石榴、坚果和浆果。通常，用于本公开的组合物、方法和用途中的式(I)化合物或其盐呈纯化形式，最通常地通过化学合成和纯化获得。因此，在一些实施例中，用于生产组合物的式(I)化合物或其盐为至少90重量％纯度，至少95重量％纯度，至少97重量％纯度，至少98重量％纯度，至少99重量％纯度，或至少99.5％。在一些实施例中，组合物中存在的小于10重量％、小于5重量％、小于3重量％、小于2重量％、或小于1重量％的多酚不是式(I)化合物或其盐。在一些实施例中，组合物基本上不含除了式(I)化合物或其盐外的多酚。

本公开的组合物用于局部施用，并且含有适用于局部施用的赋形剂，例如其有助于将活性化合物递送到作用部位，其与活性化合物相容，并且提供良好的化学和物理稳定性，以及其是安全的，并且没有刺激性或刺激性低。最常见地，组合物是半固体或液体组合物。在一些实施例中，组合物是液体。在其它实施例中，组合物是半固体。在一些实施例中，组合物呈溶液、悬浮液、乳液、凝胶、固体或脂质体调配物的形式。

通常，组合物(例如乳膏)将含有局部可接受的载剂或媒剂，其可以例如占组合物的重量的50％到99.9995％、或60％到99.9995％、或70％到99.9995％、或80％到99.9995％、或90％到99.9995％、或95％到99.9995％、50％到99.995％、或60％到99.995％、或70％到99.995％、或80％到99.995％、或90％到99.995％、或95％到99.995％、或70％到99.99％、或80％到99.99％、或90％到99.99％、或95％到99.99％、或70％到99.9％、或80％到99.9％、或90％到99.9％、或95％到99.9％、或98％到99.9％、或80％到99％、或90％到99％、或95％到99％、或98％到99％。在一些实施例中，式(I)化合物或其盐以处于0.0005重量％到50重量％、0.0005重量％到40重量％、0.0005重量％到30重量％、0.0005重量％到20重量％、0.0005重量％到10重量％、0.0005重量％到1重量％、0.005重量％到50重量％、0.005重量％到40重量％、0.005重量％到30重量％、0.005重量％到20重量％、0.005重量％到10重量％、0.005重量％到1重量％、0.01重量％到30重量％、0.01重量％到20重量％、0.01重量％到10重量％、0.01重量％到5重量％、0.1重量％到30重量％、0.1重量％到20重量％、0.1重量％到10重量％、0.1重量％到5重量％、0.1重量％到2重量％、1重量％到20重量％、1重量％到10重量％、1重量％到5重量％、或1重量％到2重量％范围内的量存在于组合物中。在一些实施例中，式(I)化合物或其盐以处于1μM到2.5M、1μM到1M、1μM到100mM、1μM到10mM、1μM到100μM、10μM到2.5M、10μM到1M、10μM到100mM、10μM到10mM、10μM到5mM、10μM到1mM、10μM到500μM、10μM到250μM、25μM到2.5M、25μM到1M、25μM到100mM、25μM到10mM、25μM到5mM、25μM到1mM、25μM到500μM、25μM到250μM、100μM到2.5M、100μM到1M、100μM到100mM、100μM到10mM、100μM到1mM、500μM到2.5M、500μM到1M、500μM到100mM、500μM到10mM、或500μM到1mM范围内的浓度存在于组合物中。可以使用例如含有不同浓度的式(I)化合物或其盐的组合物。例如，用于化妆品应用的组合物或用于症状较轻的患者的非处方组合物可以含有较低浓度的活性剂，并且例如仅用于治疗严重症状的处方组合物可以含有更高浓度的活性剂。

在另外的实施例中，式(I)化合物或其盐以处于0.01μM到100mM、0.01μM到10mM、0.01μM到1mM、0.01μM到100μM、0.1μM到500μM、0.1μM到100μM、或1μM到50μM范围内的浓度存在于组合物中。

在一个实施例中，本发明的局部组合物(如乳膏)包括0.0001％到5％；式(I)化合物或其盐，例如，00001％到1％，如0.0001％到0.1％，如0.0001％到0.01％。在另外的实施例中，本发明的局部组合物(如乳膏)包括0.001％到0.5％；式(I)化合物或其盐，例如：0.001％到0.1％，如0.01％到0.1％；在另外的实施例中，本发明的局部组合物(如乳膏)包括0.005％到0.05％式(I)化合物或其盐，例如0.001％到0.01％。

局部组合物的成分的实例包含油、甘油酯(包含甘油三酯、甘油二酯和/或单甘油酯)、有机溶剂(例如醇)、水、蜡、油脂、表面活性剂、润肤剂、保湿剂、皮肤调理剂、增稠剂、乳化剂、胶凝剂、发泡剂、防腐剂、缓冲剂、螯合剂、遮光剂、增香剂、着色剂、香精或香料、额外治疗活性剂和额外美容活性剂。可以使用上述混合物。

在一些实施例中，组合物包括油和/或脂质组分。可以用于局部施用的调配物中的油的实例是本领域熟知的，并且它们包含棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻、大豆、矿物质、芝麻和月见草油。在一些实施例中，组合物包括油，其量是组合物的重量的高达90％、高达80％、高达70％、高达60％、高达50％、高达40％、高达30％、高达20％、高达10％、高达5％、1％到50％、1％到40％、1％到30％、1％到20％、1％到10％、5％到50％、5％到40％、5％到30％、5％到20％、5％到10％、10％到50％、10％到40％、10％到30％、10％到30％。

在一些实施例中，组合物包括有机溶剂。有机溶剂的实例包含醇溶剂(例如乙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇)、吡咯烷酮(例如N-甲基吡咯烷酮)和DMSO。在一些实施例中，组合物包括有机溶剂，其量是组合物的重量的高达90％、高达80％、高达70％、高达60％、高达50％、高达40％、高达30％、高达20％、高达10％、高达5％、高达3％、高达2％、高达1％、0.1％到20％、0.1％到15％、0.1％到10％、0.1％到5％、0.1％到3％、0.1％到2％、0.1％到1％、1％到50％、1％到40％、1％到30％、1％到20％、1％到10％、5％到50％、5％到40％、5％到30％、5％到20％、5％到10％、10％到50％、10％到40％、10％到30％、10％到20％。

在一些实施例中，组合物包括中链甘油三酯。中链甘油三酯是式CH₂(OR¹)-CH(OR²)-CH₂(OR³)的化合物，其中R¹、R²和R³是中链脂肪酸基团，通常为式–C(＝O)(CH₂)_nCH₃，其中n处于4到10的范围内，例如6到8。中链脂肪酸是具有6-12个碳原子的脂肪族尾部的脂肪酸。脂肪族尾部主要是饱和的。特定的中链脂肪酸包含己酸(己酸，C6:0)、辛酸(辛酸，C8:0)、癸酸(癸酸，C10:0)和月桂酸(十二烷酸，C12:0)。肉豆蔻酸(十四烷酸，C14:0)也可以少量存在。最常用的中链甘油三酯通常具有辛酸和癸酸的甘油三酯的混合物，并且含有95％或更多的饱和脂肪酸。本发明的组合物中的中链甘油三酯组分可以由均相的单中链甘油三酯化合物类型组成；更常见地，本发明的组合物中的中链甘油三酯组分是两种或更多种不同中链甘油三酯化合物的混合物。

欧洲药典将中链甘油三酯描述为从可可椰子L.(椰子)的胚乳的坚硬干燥部分或从油棕雅克(非洲油棕)的干燥胚乳提取的固定油。欧洲药典和USPNF两者均具有中链甘油三酯的规格，其要求特定的脂肪酸如下存在：己酸(C6)≤2.0％；辛酸(C8)50.0-80.0％；癸酸(C10)20.0-50.0％；月桂酸(C12)≤3.0％；和肉豆蔻酸(C14)≤1％。

具体地，用于本发明的组合物中的中链甘油三酯包括甘油三酯与脂肪酸链的混合物，所述脂肪酸链以下列比例存在：C6≤5％；C8 50-70％；C10 30-50％；和C12≤12％，例如C6≤0.5％；C8 55-65％；C10 35-45％；和C12≤1.5％。

用于本发明的组合物中的中链甘油三酯可以从任何合适的来源获得。在一些实施例中，组合物包括中链甘油三酯，其量是组合物的重量的高达90％、高达80％、高达70％、高达60％、高达50％、高达40％、高达30％、高达20％、高达10％、高达5％、1％到50％、1％到40％、1％到30％、1％到20％、1％到10％、5％到50％、5％到40％、5％到30％、5％到20％、5％到10％、10％到50％、10％到40％、10％到30％、10％到30％。

在一些实施例中，组合物包括润肤剂，其是用于预防和/或缓解干燥的材料。润肤剂的实例包含植物油、矿物油、硅油、脂肪酸酯和醇，如1-十六烷醇。

在一些实施例中，组合物包括乳化剂。乳化剂的实例包含PPG-1-PEG-9月桂基乙二醇醚(商品名称：Eumulgin L)、PEG-60氢化蓖麻油(商品名称：Cremophor CO 60)、十六烷醇和硬脂酸甘油酯以及PEG-75硬脂酸酯和Ceteth-20和Steareth-20(商品名称：EmuliumDelta)、十六硬脂酸酯(商品名称：Nafoi 1618)、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰基二甲基硫酸钠共聚物和水和角鲨烷和聚山梨醇酯60和脱水山梨糖醇异硬脂酸酯(商品名称：Simulgel NS)。

在一些实施例中，组合物包括增稠剂。增稠剂的实例包含交联丙烯酸酯(例如Carbopol 982)、疏水改性丙烯酸酯(例如Carbopol 1382)、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素)和天然树胶(例如瓜尔胶、黄原胶、菌核、角叉菜胶、果胶)。当使用时，通常增稠剂以组合物的重量的高达5％、或高达1％的量使用。

金属螯合剂或螯合剂的实例是EDTA(乙二胺四乙酸)的盐。

在使用表面活性剂的情况下，其通常以组合物的重量的高达40％、或高达30％、或高达20％、或高达10％的量使用。

在一些实施例中，除了式(I)化合物或其盐外，组合物含有另外的活性剂。例如，它可以含有额外的活性剂，其可用于治疗或预防皮肤病状，如melisma，如例如氢醌或曲酸。

合适类型的组合物的实例包含乳膏、糊剂、软膏、溶液、洗剂、泡沫、摩丝、凝胶、口红和喷雾剂。合适的组合物的另外实例包含乳膏、分散液、乳液、凝胶、软膏、洗剂、乳、摩丝、喷雾剂或滋补剂。

在一些实施例中，组合物呈乳膏或洗剂的形式，例如护肤霜。乳膏通常采用油和水乳液的形式，分类为水包油(o/w)或油包水(w/o)乳液。在一些实施例中，组合物是乳膏，其是水包油乳液。在一些实施例中，组合物是包括5％到50％的油(例如润肤剂)和45％到85％的水的乳膏。局部乳膏通常额外含有乳化剂和/或增稠剂。

洗剂通常是指含有悬浮或溶解在液体载剂中的活性成分的液体制剂。洗剂可以例如是基于水性和/或有机溶剂(例如醇)的调配物。

在一些实施例中，组合物呈软膏的形式。软膏通常是烃的半固体制剂(如凡士林、矿物油、石蜡、合成烃)，并且通常是粘稠的和/或油腻的。在许多情况下，软膏可能含有很少或不含水。在一些实施例中，软膏包括烃/油基、润肤剂(例如约2重量％到10重量％)和增稠剂(例如约1重量％到2重量％)。在一些实施例中，组合物呈凝胶形式。凝胶通常含有胶凝剂(如天然树胶、丙烯酸酯聚合物/共聚物或纤维素衍生物)和合适的液体组分(例如有机溶剂，如醇)。在一些实施例中，组合物呈糊剂形式。糊剂通常是粉末和液体或半固体载剂，如软膏的混合物。

本公开涉及例如保护皮肤免受由环境引起的损害，例如涉及使用式(I)化合物作为营养物，以防止由太阳光/UV辐射引起的损害。因此，在一些实施例中，包括式(I)化合物的局部组合物是防晒组合物，例如乳膏、洗剂或喷雾剂。除了式(I)化合物或其盐外，此类组合物通常含有物理和/或化学防晒剂，如UV阻挡剂。在一些实施例中，防晒组合物包括物理防晒剂，例如如二氧化钛或氧化锌。在一些实施例中，防晒组合物包括化学防晒剂，例如如羟苯甲酮、阿伏苯宗、辛水杨酯、奥克立林、胡莫柳酯和/或桂皮酸盐。

UV阻挡剂可以是吸收处于290纳米(nm)到400nm的一个或多个波长下的UV区域中的光的有机化合物。例如，对于290nm到400nm的范围内的至少一个波长，UV阻挡剂可以表现出至少10,000mol^-1L cm^-1(例如，至少25,000mol^-1L cm^-1、至少50,000mol^-1L cm^-1、至少75,000mol^-1L cm^-1、或至少100,000mol^-1L cm^-1)的摩尔消光系数。

在一些实施例中，UV阻挡剂可以是吸收处于290nm到320nm的一个或多个波长下的UV-B区域中的光的有机化合物(即，UV-B阻挡剂)。例如，对于290nm到320nm的范围内的至少一个波长，UV阻挡剂可以表现出至少10,000mol^-1L cm^-1(例如，至少25,000mol^-1L cm1、至少50,000mol^-1L cm^-1、至少75,000mol^-1L cm^-1、或至少100,000mol^-1L cm^-1)的摩尔消光系数。在一些情况下，UV阻挡剂在290nm到320nm的范围内的所有波长下可以表现出至少10,000mol^-1L cm^-1的摩尔消光系数。

在一些实施例中，UV阻挡剂可以是吸收处于320nm到400nm的一个或多个波长下的UV-A区域中的光的有机化合物(即，UV-A阻挡剂)。例如，对于320nm到400nm的范围内的至少一个波长，UV阻挡剂可以表现出至少10,000mol^-1L cm^-1(例如，至少25,000mol^-1L cm^-1、至少50,000mol^-1L cm^-1、至少75,000mol^-1L cm^-1、或至少100,000mol^-1L cm^-1)的摩尔消光系数。在一些情况下，UV阻挡剂在320nm到400nm的范围内的所有波长下可以表现出至少10,000mol'1L cm'1的摩尔消光系数。

合适的UV阻挡剂的实例包含，例如，对氨基苯甲酸、

padiate O、苯基苯并咪唑磺酸、西诺沙酯、二羟苯宗、氧苯酮、胡莫柳酯、氨基苯甲酸胺、奥克立林、甲氧基肉桂酸辛酯、水杨酸辛酯、磺异苯酮、水杨酸三乙醇酯、阿伏苯宗、依莰舒、4-甲基苯亚甲基樟脑、二氧化钛、bemotrizinol、bisdisulizole二钠、三-联苯三嗪、甲酚曲唑、三硅氧烷、二苯甲酮-9、乙基己基三嗪酮、二乙胺基羟基苯甲酰基己基苯甲酸酯、二乙基己基丁酰胺基三嗪酮、聚硅氧烷-15、阿米洛酯和其组合。在一些实施例中，UV阻挡剂可以是对氨基苯甲酸、padiate O、苯基苯并咪唑磺酸、西诺沙酯、二羟苯宗、氧苯酮、胡莫柳酯、氨基苯甲酸胺、奥克立林、

甲氧基肉桂酸辛酯15、水杨酸辛酯、磺异苯酮、水杨酸三乙醇酯、阿伏苯宗、依莰舒、或其组合。在某些实施例中，UV阻挡剂可以是阿伏苯宗、羟苯甲酮或其组合。

按组合物的总重量计，防晒剂可以以0.5重量％到10重量％的量存在于组合物中。如使用国际标准ISO 24444：2010(E)所测量的，可以将组合物的SPF调配成至少15(例如，至少30)。

本公开还涉及例如化妆品皮肤漂白和/或皮肤亮白。因此，在一些实施例中，包括式(I)化合物的局部组合物是化妆组合物，例如粉底组合物。

令人惊讶地发现，尿石素A尤其可溶于包含亲脂性赋形剂的局部乳膏组合物中，例如油和/或中链甘油三酯，此类组合物在外观上是均匀的，在混合之后没有可见的固体尿石素A，并且在皮肤上具有光滑感。当微粉化的尿石素A与护肤霜混合时，它形成一种颜色变深的光滑混合物，表明尿石素已经溶解在乳膏的组分中或悬浮在乳膏基质中。

因此，在一些实施例中，局部组合物包括适于局部施用的有机溶剂。在一些实施例中，组合物包括油和/或脂质组分。

在一些实施例中，局部组合物包括甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯。在一些实施例中，组合物包括中链甘油三酯。

在一些实施例中，组合物的水含量低，例如组合物可以含有小于20重量％、小于10重量％、小于5重量％、小于2重量％、或小于1重量％的水。在一些实施例中，组合物基本上不含水。然而，在一些其它实施例中，组合物可能含有显著比例的水，例如其中组合物含有水和油或水和有机溶剂的混合物，例如与乳化剂一起。

本公开涉及用于局部施用的组合物。先前已经口服施用式(I)化合物。应当理解，一些适合局部调配活性成分的赋形剂不适于口服施用，并且本公开包含包含一种或多种不适于口服施用的赋形剂的调配物。

在一些实施例中，组合物包括皮肤渗透增强剂，以帮助将活性成分递送到皮肤中和/或通过皮肤递送。皮肤渗透增强剂的实例包含亚砜(如DMSO)、吡咯烷酮、萜烯、脂肪酸、醇、二醇、二醇醚和甘油酯。

在一些实施例中，组合物(例如乳膏)包括1ml份的组合物(例如，包括亲脂性组分，如油和/或中链甘油三酯的外用乳膏组合物)中高达100mg的水平的式(I)化合物或其盐，因此每ml高达100mg。因此，组合物可以以处于组合物的0.001mg/ml到100mg/ml、0.01mg/ml到100mg/ml、0.05mg/ml到100mg/ml、0.1mg/ml到100mg/ml、5mg/ml到100mg/ml、10mg/ml到100mg/ml、0.01mg/ml到50mg/ml、0.05mg/ml到50mg/mL、0.1mg/ml到50mg/ml、0.5mg/ml到50mg/ml、1mg/ml到50mg/ml、5mg/ml到50mg/ml、0.001mg/ml到0.1mg/ml、0.01mg/ml到10mg/ml、0.05mg/ml到10mg/ml、0.1mg/ml到10mg/ml、0.5mg/ml到10mg/ml、1mg/ml到10mg/ml、0.01mg/ml到5mg/ml、0.05mg/ml到5mg/ml、0.1mg/ml到5mg/ml、0.5mg/ml到5mg/ml、1mg/ml到5mg/ml、0.01mg/ml到1mg/ml、0.05mg/ml到1mg/ml、0.1mg/ml到1mg/ml、0.5mg/ml到1mg/ml、0.01mg/ml到0.5mg/ml、或0.05mg/ml到0.5mg/ml的范围内的量含有例如式(I)化合物或其盐(例如尿石素A)。

本发明的示例局部组合物包含：

用途

已经提出式(I)化合物作为与线粒体功能不足相关的各种病状的治疗。线粒体是中心细胞器，其可以驱动细胞生命，即通过在呼吸链中产生能量，以及死亡，即通过引发细胞凋亡两者。最近，已经证明功能障碍的线粒体可以被特异性靶向通过自噬消除，所述自噬已经被称为线粒体自噬过程。认为增加线粒体自噬(去除功能障碍的线粒体)使线粒体恢复活力，并且改善线粒体功能。已经发现尿石素A诱导线粒体自噬，并且增加啮齿动物的寿命，参见Ryu等人，《自然医学(Nature Medicine)》2016,22,p879-888。

与之前专注于口服施用的方法不同，现在已经发现，当与皮肤样品接触时，在用于色素沉着过度的皮肤病状肝斑的体外测定中，尿石素A显示出意想不到的良好结果。在测试的较高浓度，例如100μM下，尿石素产生更快的皮肤亮白效果，并且导致黑色素含量的更大降低，而不是使用2％曲酸，所述曲酸是目前用于治疗和美容皮肤亮白的药剂。

因此，本公开提供了预防和/或治疗受试者的皮肤病状、疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者局部施用有效量的式(I)化合物或其盐(例如尿石素A)。本公开还包含预防和/或治疗受试者的皮肤病状、疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者局部施用包括a)式(I)化合物或其盐(例如尿石素A)；和b)至少一种适用于局部施用的赋形剂的组合物。

在一些实施例中，与使用现有疗法，如曲酸施用相比，方法对皮肤色素沉着产生更快的影响。

在一些实施例中，皮肤病状、疾病或病症是与色素沉着过度相关的皮肤病状、疾病或病症。在一些实施例中，皮肤病状、疾病或病症是与线粒体活性不足相关的皮肤病状、疾病或病症。

在一些实施例中，皮肤疾病、病症或病状选自由以下组成的组：肝斑、黄褐斑、妊娠面斑、色素沉着过度、皮肤老化、雀斑、着色斑、皮肤炎症、皮肤刺激、皮肤感染、疣、牛皮癣、以及保护皮肤免受由环境和/或治疗引起的损伤。皮肤疾病、病症或病状也选自黑变病、皮炎、黑线和内分泌疾病，如艾迪生氏和库欣氏综合征。

在一些实施例中，皮肤疾病、病症或病状是肝斑。肝斑也被称为黄褐斑和妊娠面斑。肝斑是成人常见的皮肤病状，尤其是处于20-50岁的年龄范围内的女性，其中棕色、棕褐色或灰色色素沉着，主要发生在脸部。在夏季，肝斑经常变得更加明显，而在冬季期间则不太明显。许多因素可能导致患有肝斑的可能性和肝斑的严重程度，包含暴露于太阳光和/或紫外光、压力、怀孕、甲状腺功能减退和某些活性成分的施用，特别是激素活性成分，如口服避孕药。可以导致的其它因素包含某些化妆品。因此，在一些实施例中，皮肤病状、疾病或病症是肝斑，所述肝斑选自由以下组成的组：与压力相关的肝斑、与妊娠相关的肝斑、与甲状腺功能减退相关的肝斑、与施用活性成分相关的肝斑、与暴露于太阳光和/或紫外光相关的肝斑、以及与暴露于化学剂相关的肝斑。

用于确定识别皮肤亮白和皮肤变黑剂的测试是本领域已知的，参见例如US2008/0249029和US2012/0128613。例如，如US2012/0128613中所述，可用于进行这些类型研究的一种表皮等同系统是MelanoDerm^TM系统，可从MatTek(亚什兰(Ashland)，MA)商购获得。此系统含有人正常黑素细胞，以及正常的人源性表皮角质形成细胞，其已经被培养以形成人表皮的多层高度分化模型。

本公开的化合物和组合物还可用于治疗和/或预防与色素沉着过度相关的其它病状、疾病或病症，例如与年龄有关的皮肤色素沉着过度、或炎症后色素沉着过度。因此，在一些实施例中，皮肤疾病、病症或病状是皮肤老化、雀斑或着色斑。在一些实施例中，方法用于保护皮肤免受由环境引起的损害，例如由太阳光/紫外线引起的损害。在一些实施例中，方法用于保护皮肤免受由辐射，例如UV、β或γ辐射引起的损害，包含在如癌症的病状的医学治疗期间。

本公开的化合物还可用于治疗和/或预防皮肤病状，其中增强的线粒体自噬和/或自噬导致有益效果。在一些实施例中，方法用于治疗和/或预防疾病、病症或病状，所述疾病、病症或病状选自由以下组成的组：皮肤炎症、皮肤刺激、皮肤感染、疣和牛皮癣。

在一些实施例中，本公开的方法用于治疗和/或预防医学病状，即，受试者是患有疾病状态或医学病状或病症的个体。如本文所提及的，患有皮肤疾病、病状或病症的受试者是具有症状的受试者，所述受试者已经被医疗从业者诊断为患有皮肤疾病、病症或病状，或者如果呈现给医疗从业者，将被诊断为患有皮肤疾病、疾症或病状。

然而，在其它实施例中，设想了向未患特定疾病或病症的受试者施用式(I)化合物或其盐。例如，受试者可以是健康个体，即没有皮肤病症、疾病或病状的个体，其希望局部施用式(I)化合物或其盐，以漂白其皮肤或使其皮肤颜色和/或色调变亮，例如出于美观的原因，如提供更平滑和/或更均匀的皮肤色调或颜色。因此，在一些实施例中，受试者是健康的，和/或局部施用式(I)化合物或其盐的方法是美容方法。如本文所提及的，健康受试者是没有症状，如果呈现给医疗从业者，则其将被诊断为患有皮肤疾病、病症或病状的受试者。

取决于施用方式、受试者的年龄、体重和一般健康状况，式(I)化合物或其盐或含有化合物的组合物的有效量将有所不同。如受试者的疾病状态、年龄和体重等因素可能是重要的，并且可以调整剂量方案以提供最佳反应。

受试者是将受益于局部施用根据本发明的式(I)化合物的任何生物。在一些实施例中，受试者是哺乳动物，例如非人哺乳动物，例如猫、狗、山羊、马和牛，但是更优选地，受试者是人。在一些实施例中，受试者是男性。在一些实施例中，受试者是女性。虽然在某些实施例中，受试者可以是儿童，但是在其它更优选的实施例中，受试者是成年人。在一些实施例中，受试者可以是至少20岁、至少25岁、至少30岁、至少35岁、至少40岁、至少45岁、至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁或至少75岁。在其它实施例中，受试者可以例如处于18岁到50岁、18岁到40岁、或18岁到30岁的范围内。

通常，将含有化合物的组合物施用于受影响的一处或多处皮肤区域，例如它可以在表面上铺展和/或摩擦。优选地通过一系列施用进行治疗。例如，化合物的局部施用可以在一段时间内每天进行一次、两次或三次或根据需要进行。还应理解，化合物的有效剂量可以在特定治疗过程中增加或减少。

如上所述，如通过光学分光光度法测定，以100μM浓度施用尿石素A导致更快的皮肤亮白效果，并且导致黑色素含量比2％曲酸更大的降低。因此，在一些实施例中，方法涉及比目前疗法如曲酸更少的给药。例如，在一些实施例中，可以仅每2天、3天或4天施用一次，或者例如每周一次。

例如，当向受试者每天施用式(I)化合物或其盐(例如尿石素A)时，其量可以例如处于每天0.1mg到5g、例如每天1mg到5g、例如每天10mg到5g、例如每天20mg到2500mg、例如每天50mg到1500mg、例如每天100mg到1,500mg、例如每天150mg到1,500mg、例如每天200mg到1,500mg、例如每天250mg到1500mg、例如每天50mg到1000mg、例如每天250mg到1000mg、例如每天10mg到1000mg、例如每天10mg到750mg、例如每天20mg到500mg、例如每天50mg到500mg、例如每天50mg到250mg的范围内。在一些实施例中，剂量为250mg/天，在另一个实施例中，剂量为500mg/天，在另外的实施例中，剂量为750mg/天，在另外的实施例中，剂量为1000mg/天。在一些实施例中，式(I)化合物或其盐(例如尿石素A)的剂量可以例如处于0.01mg/kg/天到100mg/kg/天的范围内。例如，尿石素的剂量可以处于0.1mg/kg/天到100mg/kg/天、0.2mg/kg/天到100mg/kg/天、0.2mg/kg/天到50mg/kg/天、0.2mg/kg/天到40mg/kg/天、0.2mg/kg/天到25mg/kg/天、0.2mg/kg/天到10mg/kg/天、0.2mg/kg/天到7.5mg/kg/天、0.2mg/kg/天到5mg/kg/天、0.25mg/kg/天到100mg/kg/天、0.25mg/kg/天到25mg/kg/天、0.25mg/kg/天到25mg/kg/天、0.25mg/kg/天到10mg/kg/天、0.25mg/kg/天到7.5mg/kg/天、0.25mg/kg/天到5mg/kg/天、0.5mg/kg/天到50mg/kg/天、0.5mg/kg/天到40mg/kg/天、0.5mg/kg/天到30mg/kg/天、0.5mg/kg/天到25mg/kg/天、0.5mg/kg/天到20mg/kg/天、0.5mg/kg/天到15mg/kg/天、0.5mg/kg/天到10mg/kg/天、0.5mg/kg/天到7.5mg/kg/天、0.5mg/kg/天到5mg/kg/天、0.75mg/kg/天到50mg/kg/天、0.75mg/kg/天到25mg/kg/天、0.75mg/kg/天到20mg/kg/天、0.75mg/kg/天到15mg/kg/天、0.75mg/kg/天到10mg/kg/天、0.75mg/kg/天到7.5mg/kg/天、0.75mg/kg/天到5mg/kg/天、1.0mg/kg/天到50mg/kg/天、1mg/kg/天到40mg/kg/天、1mg/kg/天到25mg/kg/天、1mg/kg/天到20mg/kg/天、1mg/kg/天到15mg/kg/天、1mg/kg/天到10mg/kg/天、1mg/kg/天到7.5mg/kg/天、1mg/kg/天到5mg/kg/天、2mg/kg/天到50mg/kg/天、2mg/kg/天到25mg/kg/天、2mg/kg/天到20mg/kg/天、2mg/kg/天到15mg/kg/天、2mg/kg/天到10mg/kg/天、2mg/kg/天到7.5mg/kg/天、或2mg/kg/天到5mg/kg/天的范围内。

含有式(I)化合物或其盐的组合物通常施用于受影响的一处或多处皮肤区域。因此，在一些实施例中，在每次施用(例如每天)时，以处于经处理的皮肤的0.001mg/cm²到100mg/cm²的范围内的量局部施用化合物，例如经处理的皮肤表面的0.005mg/cm²到100mg/cm²、0.01mg/cm²到100mg/cm²、0.05mg/cm²到100mg/cm²、0.1mg/cm²到100mg/cm²、0.5mg/cm²到100mg/cm²、1mg/cm²到100mg/cm²、5mg/cm²到100mg/cm²、10mg/cm²到100mg/cm²、0.001mg/cm²到50mg/cm²、0.005mg/cm²到50mg/cm²、0.01mg/cm²到50mg/cm²、0.05mg/cm²到50mg/cm²、0.1mg/cm²到50mg/cm²、0.5mg/cm²到50mg/cm²、1mg/cm²到50mg/cm²、5mg/cm²到50mg/cm²、10mg/cm²到50mg/cm²、0.001mg/cm²到10mg/cm²、0.005mg/cm²到10mg/cm²、0.01mg/cm²到10mg/cm²、0.05mg/cm²到10mg/cm²、0.1mg/cm²到10mg/cm²、0.5mg/cm²到10mg/cm²、1mg/cm²到10mg/cm²、0.001mg/cm²到5mg/cm²、0.005mg/cm²到5mg/cm²、0.01mg/cm²到5mg/cm²、0.05mg/cm²到5mg/cm²、0.1mg/cm²到5mg/cm²、0.5mg/cm²到5mg/cm²、1mg/cm²到5mg/cm²、0.001mg/cm²到1mg/cm²、0.005mg/cm²到1mg/cm²、0.01mg/cm²到1mg/cm²、0.05mg/cm²到1mg/cm²、或0.1mg/cm²到1mg/cm²。

本公开提供了涉及式(I)化合物或其盐、式(I)化合物或其盐用作药物、式(I)化合物或其盐用于制造用于治疗受试者的皮肤病状、疾病或病症的药物的用途、以及包括式(I)化合物或其盐的组合物的施用方法。以上讨论和其中描述的实施例(例如关于式(I)化合物的性质、剂量方案、施用和组合物)主要在讨论本公开的方法和组合物的背景下进行，所述讨论同样适用于本公开的所有方面，包含与用作药物的式(I)化合物或其盐，以及式(I)化合物或其盐用于制造用于治疗受试者的病状、疾病或病症的药物的用途有关的那些方面。

实例

以下实例示出本发明。

实例1：尿石素A的制备

尿石素A(4)分两步制备，从2-溴-5-甲氧基苯甲酸1和间苯二酚2开始。得到呈浅黄色粉末的纯化合物。

步骤1：

将2-溴-5-甲氧基苯甲酸1(27.6g；119mmol；1.0当量)、间苯二酚2(26.3g；239mmol；2.0当量)和氢氧化钠(10.5g；263mmol；2.2当量)在水(120mL)中的混合物在回流下加热1小时。然后加入5％硫酸铜水溶液(50mL水中3.88g CuSO₄·5H₂O；15.5mmol；0.1当量)，并且将混合物再回流30分钟。允许混合物冷却到室温，并且在布赫纳过滤器上过滤固体。将残余物用冷水洗涤，得到浅红色固体，将其在热MeOH中研磨。将悬浮液在4℃下放置过夜。过滤所得沉淀物，并且用冷MeOH洗涤，得到呈浅棕色固体的标题化合物3。

步骤2：

在0℃下，向3(10.0g；41mmol；1.0当量)在干燥的二氯甲烷(100mL)中的悬浮液滴加1M三溴化硼在干燥的二氯甲烷中的溶液(11.93mL纯BBr₃在110mL无水二氯甲烷中；124mmol；3.0当量)。将混合物在0℃下放置1小时，并且然后使其温热到室温。将溶液在所述温度下搅拌17小时。然后将冰完全加入混合物中。过滤黄色沉淀物，并且用冷水洗涤，得到黄色固体，将其在乙酸中加热回流3小时。快速过滤热溶液，并且用乙酸洗涤沉淀物，然后用***洗涤，得到呈黄色固体的标题化合物4。¹H和¹³C NMR与4的结构一致。

实例2：尿石素A的微粉化

使用已过滤的氮气、240g/hr的进料速率、12巴的文丘里压力、12巴的研磨压力，使用MC50 Spiral 20Jetmill(Valortecs SAS，Blodelsheim，France)使尿石素A微粉化。使尿石素A微粉化，得到尿石素A，其粒度分布为D₉₀＝9μm到15μm，以及D₅₀＝2μm到9μm。使用Malvern Mastersizer 2000测量的实际粒度分布为D₉₀＝11.5μm，D₅₀＝3.9μm，D₁₀＝0.7μm。

实例3：尿石素A护肤霜组合物

将150mg微粉化的尿石素A与一勺(约5ml)市售护肤霜混合。使用的护肤霜是以名称Avene XeraCalm AD^TM销售的护肤霜，可从Pierre Fabre S.A.获得。根据制造商，乳膏含有雅漾温泉水(漾温水性)、甘油、矿物油(液体中的石蜡)、十六硬脂酸酯、夜来香(月见草)油(夜来香油)、辛酸/癸酸甘油三酯、鲸蜡硬脂基葡糖苷、白藜芦醇提取物、精氨酸、卡波姆、月见草油/棕榈油氨基丙二醇酯、甘氨酸、氢氧化钠、生育酚和水(水性)。

混合之后，得到均匀的混合物。组合物具有比护肤霜起始产品稍暗的颜色。组合物是光滑的并且具有规则的颜色。尿石素的存在对护肤霜产品的质地没有可辨别的影响。

实例4：EpiDerm^TM培养物中尿石素A对皮肤活力的体外测试

预筛选处理条件：良好的皮肤亮白剂应该抑制黑色素合成，但是不会对组织造成细胞毒性。使用EpiDerm组织(EPI-200)进行尿石素A对皮肤细胞活力的影响。重建的人表皮模型EpiDerm^TM(EPI-200，MatTek，Ashland，USA)由正常的人源性表皮角质形成细胞组成，其已经被培养以形成人表皮的多层高度分化模型。

组织在维持培养基(可从MatTek Corporation获得的EPl-100-LLMM)中生长。在基底外侧进行治疗，即，将测试化合物溶解在维持培养基中，共持续96小时。每种条件使用两个EpiDerm^TM组织(n＝2)，其为1)水，2)DMSO 0.5％，3)尿石素A25μM，4)尿石素A 50μM和5)尿石素A 100μM。添加或不添加到尿石素A或DMSO中的维持培养基在48小时时更新。

细胞活力通过以下测量：使存在于细胞线粒体中的MTT[(3-4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基四唑鎓]脱氢酶转化成从组织提取之后定量测量的蓝色甲盐。

通过将组织转移到含有MTT培养基(1mg/ml)的24孔板进行MTT测定。在3hr MTT温育之后，用2.0ml/组织的异丙醇(提取剂溶液，部分#MTT-100-EXT)提取由细胞线粒体形成的蓝色甲盐，并且使用570nm处的分光光度计测定提取的甲的光密度。计算每种组织的相对细胞活力，作为阴性对照组织平均值的％。

图1示出了在EpiDerm^TM组织中进行的活力测定的结果。所有条件下的活力均高于90％，表明没有细胞毒性。这意味着尿石素A在测试浓度下不会损害皮肤细胞活力。

实例5：MelanoDerm^TM培养物中尿石素A对黑素生成的体外测试

来自MatTek Corporation(美国马萨诸塞州阿什兰)的MelanoDerm^TM培养物是有色3D活体皮肤等效模型。通过用黑素细胞接种角质形成细胞获得MEL-300组织。MEL-300-B培养物含有衍生自黑色供体组织的黑素细胞，并且用于评价皮肤亮白潜力。MEL-300-B在长寿命维持培养基(可从MatTek Corporation获得的EPl-100-LLMM)中制备，并且培养共14天。每组使用总共四个组织重复(n＝4)。

未处理的组织用作阴性对照。维护培养基每2天更新一次。

通过添加到50μM和100μM的终浓度的维持培养基，将尿石素A施用于样品，所述维持培养基由50mM DMSO储备溶液制备。使用维持培养基中0.2％的DMSO制备载剂对照。添加到尿石素A或DMSO中的维持培养基每2天更新一次。

在50:50丁二醇:水中使用2％的曲酸作为阳性对照，并且局部施用(即在MelanoDerm^TM样品的角质层、表皮的最外层)。曲酸是众所周知的酪氨酸酶抑制剂，所述酪氨酸酶是导致黑素瘤和黑素细胞中黑素生成的关键酶，并且用于治疗化妆品中的色素沉着过度、肝斑和皱纹。在50:50丁二醇:水中加入2％的新鲜曲酸制剂之前，用无菌PBS每2天冲洗组织一次，以除去曲酸。维持培养基同时更换。

a.在第14天，通过顶视图拍摄所有组织，使用Nikon Eclipse Ti显微镜对色素沉着进行宏观分析。图2示出了获得的图片。从宏观的角度来看，显然用50μM和100μM下的尿石素A处理的组织始终比阴性对照和DMSO 0.2％组轻。还可以看出，用50μM和100μM下的尿石素A处理的组织与用以2％局部施用的阳性对照曲酸处理的组织一样轻。

b.通过在第0天、第4天、第7天、第11天和第14天使用柯尼卡美能达颜色分光光度计(CM-700d)测量L值来评估样品的亮度。L值表示颜色的亮度或暗度，黑色对应L＝0，并且白色对应L＝100。图3表示在差异样品中测量的L值。从第4天直到第14天，用50μM和100μM下的尿石素A处理的组织中的L值显著高于阴性对照组。这不是预期50μM或100μM的尿石素A将具有比曲酸0.2％更快的组织亮白效果。这在第4天和第7天特别明显，其中尿石素A处理的组织具有比用曲酸处理的组织更高的L值。在处理结束时，用尿石素A和曲酸处理的组织的L值相等，证实了图2中可见的内容。在50μM和100μM处观察到显著效果，从这些结果外推表明，在本发明的另一个实施例中，处于1μM到50μM的范围内的较低浓度的尿石素A可以用于本发明的方法和组合物中。

c.每组三个组织用于黑色素的定量。首先将组织在PBS中温育，以除去维持培养基中剩余的任何酚红。将组织置于具有500μL可溶解^TM(组织和凝胶增溶剂0.5M-帕卡德生物科技有限公司(Packard BioScience Co.)目录号6NE9100)的1.7ml离心管中，并且在95℃下与黑色素标准品一起温育过夜。通过将黑色素(Sigma目录号M8631)以1mg/ml溶解于可溶解^TM中，以制备储备溶液来制备黑色素标准品。表1中给出了使用储备溶液的标准曲线的稀释液。

过夜温育后，将样品以13000rpm离心5分钟，以沉淀任何不溶物质。将200μl每种样品转移到96孔板中，并且在490nm处读数。图4表示以μg表示的黑色素含量的结果。使用单向ANOVA进行统计学显著性，然后进行Dunnett事后测试，以针对阴性对照对每组进行多重比较。与阴性对照相比，50μM和100μM下的尿石素A两者分别使黑色素含量显著降低65％和67％。2％的曲酸也使黑色素含量显著降低62％。此外，用100μM下的尿石素A处理之后的黑色素含量显著低于用2％的曲酸处理的黑色素含量，根据额外的学生t测试来比较这两组。这些结果与亮度的视觉评价以及图2和3中分别呈现的L值一致。