阅读说明：本技术 一种抗流感病毒药物 (Anti-influenza virus medicine ) 是由 王雪 王林林 赵军 史玉柱 司丽君 刘燕 马雪萍 姚华 于 2019-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗流感病毒药物,其活性成分为七叶内酯,该抗流感病毒药物为片剂或胶囊剂,其中的七叶内酯为从天山堇菜或者堇菜科植物中提取得到的七叶内酯或由人工合成的七叶内酯。本发明首次提出了七叶内酯具有明确的抗流感病毒作用,可显著抑制流感病毒感染所致的细胞病变,为七叶内酯在治疗流感方面提供了重要思路。(The invention discloses an anti-influenza virus medicament, the active component of which is esculetin, the anti-influenza virus medicament is a tablet or a capsule, wherein the esculetin is esculetin extracted from viola tianschanica or violaceae plants or esculetin artificially synthesized. The invention firstly provides that the esculetin has definite anti-influenza virus effect, can obviously inhibit cytopathia caused by influenza virus infection, and provides an important idea for the esculetin in the aspect of treating influenza.)

一种抗流感病毒药物

技术领域

本发明涉及一种抗流感病毒药物，属于医药领域。

背景技术

流感被认为是迄今为止危害最大的传染性疾病，由于其病原体流感病毒不仅致病力强，而且很容易发生变异，使得预防流感最有效的措施注射流感疫苗难以及时发挥作用。每年在世界各地发生的季节性流感流行，严重影响着人们的生活和工作，甚至危及到生命，给社会造成沉重的经济负担。近年来，H5N1等新型高致病性流感病毒的出现，使人类面临更大的威胁，“人禽流感”、“大流行性流感”、“季节性流感”已成为当今社会高度关注的公共问题。

长期以来，抗流感药物研究主要集中在与流感病毒复制、传播密切相关的组件血凝素(Hemagglutini，HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)、M2蛋白(Matrix protein2，M2)、流感病毒RNA聚合酶等靶点上，批准上市的药物主要有M2蛋白通道阻断剂金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)、NA抑制剂扎米那韦(zanamivir)和奥司他韦(osehamivi)等。还有一类是核苷类抗病毒药物，目前最常用的是利巴韦林(Ribavirin，病毒唑)，具有广谱强效性，在临床上广泛用于治疗流感。虽然目前许多国家的医疗机构都将上述几种药物作为流感大流行时期的储备药物，但临床研究表明，金刚烷胺和金刚乙胺在体内外均可迅速产生耐药和交叉耐药，扎米那韦和奥司他韦也已在临床分离到耐药株，并且流感症状较重时临床疗效也不理想，此外，利巴韦林在临床使用中不仅可引发多种一般性不良反应，还有可能导致溶血性贫血、低血压等严重不良反应。

流感病毒一旦感染机体，机体迅速启动免疫机制。免疫反应引发免疫细胞和炎症因子大量增殖并汇集肺部，导致细胞凋亡、毛细血管通透性增高、白细胞渗出、肺水肿和气道堵塞等炎症连锁反应，导致肺功能受损，甚至最终使人或动物致死，提示过度的宿主免疫反应是介导病理损伤的主要原因之一。

近年有研究发现流感病毒双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)、HA、NP或M1蛋白的过表达可被宿主细胞视黄酸、Toll样受体3识别，激发宿主自身免疫系统的防御功能，尤其是引起抗病毒细胞因子干扰素α/β(IFNα/β)分泌，同时又可激活NF-κB、Raf/MEK/ERK、IRF-3、PI3K-Akt等信号通路。已知流感病毒的转录发生在感染细胞的细胞核中，病毒基因组RNA与核蛋白形成核糖核蛋白体(r-ibonucleoproteins，RNP)，而Raf/MEK/ERK信号通路为RNP运出细胞核和病毒增殖所必需。

NF-κB是TLR7介导的MyD88依赖性信号通路中重要的信号分子，TLR7信号通路活化后，NF-κB抑制物IκB降解，解除对NF-κB的抑制作用，游离的NF-κB转位入核，与DNA结合参与多种炎性因子基因的转录调控。许多研究证实，流感病毒感染后，NF-κB表达增强，同时伴有多种炎性细胞因子如IL-6、IL-1、IL-8和TNF-a等的大量分泌及粘附因子ICAM-1的释放，从而导致机体过度释放炎性因子，引起肺部炎性损伤。目前已明确，NF-κB的活化与流感病毒引起的多种参与肺内炎性反应的细胞因子(如TNF-a)的表达及肺损伤之间有正相关性。NF-κB的激活作为流感病毒在宿主细胞内增殖的标志，在机体抗流感病毒感染信号转导通路中发挥着枢纽的重要作用。研究发现，流感病毒血凝素(HA)也可激活NF-κB与DNA结合和转录过程。NF-κB不仅通过介导促炎因子等的释放间接参与病毒性肺炎的恶化，还能够决定细胞对流感病毒的易感性。

由此可见，宿主因子在流感发病过程中也具有重要作用。已有报道显示同时具有直接抗病毒活性和免疫调节作用的药物较单纯抗病毒药物能有效地保护A/H5N1感染小鼠。在流感病毒感染致病过程中，若能在给予抗病毒药物的同时应用免疫调节和抗炎药物，纠正免疫系统的失常，干预肺炎进程，最大限度地减少免疫过度导致的肺损害，则可显著减缓病毒感染引起的症状，减少人或动物的死亡。

中药具有多成分、多环节的作用特点，不仅具有直接抗病毒作用，还能调节病毒引起免疫病理损伤的复杂过程，在流感的治疗中具有独特的优势。回顾上世纪九十年代以来中医药防治流感的实验研究，在众多研究中，中医药促进机体抗病毒免疫方面的机理探索成为人们普遍关注的课题。其中，越来越多的研究探讨中医药对流感免疫调控网络中的关键环节——炎性细胞因子的干预作用，从而在一定程度上揭示中医药对流感病毒感染机体免疫调节作用方面的机理。而在对免疫机制的影响方面，也不只偏重药物对免疫功能的增强作用，越来越多的研究重视中医药抗免疫炎性损伤方面的作用，即对促炎性细胞因子的抑制及对抗炎性细胞因子的提升方面得到了重视。

七叶内酯又名秦皮乙素或七叶亭，是一种香豆素类化合物，在堇菜科植物天山堇菜中含量较高，本课题组已经完成了天山堇菜七叶内酯分离纯化，其化学式结构如下：

据以往的研究报道，七叶内酯具有抗菌、止咳、祛痰、平喘、抗肿瘤等药理作用。但有关七叶内酯的抗流感病毒作用及其在制备抗流感病毒药物中的应用在国内外均未见报道，也未检索到相关文献。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种抗流感病毒药物，具体采用如下技术方案：

一种抗流感病毒药物，活性成分为七叶内酯。

优选的，抗流感病毒药物为片剂或胶囊剂；

上述的片剂或胶囊剂中，含有人体可接受量的七叶内酯，其中，片剂每片的七叶内酯按重量计为10-100毫克，胶囊剂每粒中七叶内酯按重量计为10-100毫克。

七叶内酯具有较好的直接抗流感病毒活性，同时又可以通过抑制NF-κB、MAPK信号通路的活化减轻病毒感染中炎症反应的发生发展、并通过免疫调节作用起到间接抗病毒作用，因此，将七叶内酯应用于制备抗流感病毒药物有良好的前景。

本发明首次提出了七叶内酯具有明确的抗流感病毒作用，可显著抑制流感病毒感染所致的细胞病变，对流感病毒A/H1N1/京防/262/95(A 262/95)、A/H3N2/粤防/243/72(A243/72)、A/H3N2/济防15/90(A 15/90)、B/济防/13/97(B 97/13)的半数抑制浓度IC50分别为：18.3、17.3、18.9、22.8，说明七叶内酯具有抗流感病毒活性。

此外，七叶内酯能够明显抑制LPS诱导RAW264.7细胞内促炎症因子TNF-α、IL-6和炎症介质NO的释放，减少iNOS的表达以及p-p65、p-p38、p-ERK1/2蛋白由细胞质向细胞核转位，并减少IκBα蛋白降解，因此，七叶内酯可能通过抑制NF-κB、MAPK信号通路的活化减轻病毒感染引发的炎症反应；七叶内酯还可显著抑制ConA诱导T淋巴细胞增殖、并抑制T淋巴细胞分泌TNF-a，IL-6，IL-2，对LPS诱导的B淋巴细胞增殖也具有显著抑制作用，说明七叶内酯可能通过免疫调节作用发挥间接抗病毒作用。

进一步，七叶内酯为从天山堇菜或者堇菜科植物中提取得到的七叶内酯或由人工合成的七叶内酯。

进一步，上述的抗流感病毒药物中还包括药学上可接受的药物赋形剂，药物赋形剂为助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂和抗氧化剂中的任一种或几种的混合，如微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁。

附图说明

图1为本发明实施例2中七叶内酯对RAW264.7细胞活性的影响结果图；

图2为本发明实施例2中七叶内酯对LPS诱导RAW264.7急性炎症时分泌TNF-α的影响结果图；

图3为本发明实施例2中七叶内酯对LPS诱导RAW264.7急性炎症时分泌IL-6的影响结果图；

图4为本发明实施例2中七叶内酯对LPS诱导RAW264.7急性炎症时iNOS蛋白表达表达量和产生NO的影响结果图；

图5为本发明实施例2中七叶内酯对LPS诱导RAW264.7 30min时p-p65蛋白表达的影响结果图；

图6为本发明实施例2中七叶内酯对LPS诱导RAW264.7 15min时IκBα蛋白表达的影响结果图；

图7为本发明实施例2中七叶内酯对LPS诱导RAW264.7 45min时p-p38蛋白表达的影响结果图；

图8为本发明实施例2中七叶内酯对LPS诱导RAW264.7 45min时p-ERK1/2蛋白表达的影响结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

七叶内酯对流感病毒(A/H1N1/京防/262/95、A/H3N2/济防15/90、A/H3N2/粤防/243/72、B/济防/13/97)的抑制作用

实验原理：以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，测定样品对病毒致细胞病变程度(CPE)的抑制作用。

实验材料：样品七叶内酯，由新疆药物研究所植物化学室自天山堇菜中提取，批号20180926。流感甲型病毒株(A/H1N1/京防/262/95、A/H3N2/济防15/90、A/H3N2/粤防/243/72)以及流感乙型病毒株(B/济防/13/97)在鸡胚尿囊腔内传代培养，收集病毒液于-80℃保存备用。阳性对照药利巴韦林Ribavirin(RBV)片，规格100mg/片，成人一次0.15g，3次/d，即0.45g·d^-1，重庆科瑞制药有限公司，国药准字H20073882，批号247001。

实验步骤：MDCK细胞接种于96孔板，细胞密度为2×10⁴个/孔，待其长成单层后，吸弃培养液，设细胞空白对照组、病毒对照组、阳性对照药利巴韦林组，七叶内酯组，每种药物设5个(取TC0及TC0以下4个倍比稀释浓度)不同浓度，每个浓度4个复孔。除细胞对照组外，各组分别接种100TCID₅₀的病毒液100μL，置35℃、5％CO₂培养箱中吸附1小时后，吸弃病毒液，用维持液洗细胞表面2次，给药组分别加入不同浓度的药液，细胞对照组和病毒对照组加维持液，100μL/孔，将培养板置35℃、5％CO₂条件培养，每日观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达4级时记录实验结果。按Reed-Muench法计算半数抑制浓度IC₅₀，选择指数SI＝TC₅₀/IC₅₀。实验结果见表1-2所示。

表1MDCK细胞TC₀和TC₅₀的测定

受试药	七叶内酯	利巴韦林
			TC<sub>0</sub>(μg·mL<sup>-1</sup>)	3.12	312.5
TC<sub>50</sub>(μg·mL<sup>-1</sup>)	36.6	1233.2

注：TC₅₀：药物半数有毒浓度；TC₀：药物最大无毒浓度。

表2七叶内酯对病毒致细胞病变CPE的影响

注：IC₅₀：药物对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，SI＝TC₅₀/IC₅₀。

从表1-2可以看出，本次实验条件下，七叶内酯对流感病毒A/H1N1/京防/262/95、A/H3N2/济防15/90、A/H3N2/粤防/243/72、B/济防/13/97有较好的抑制活性，阳性对照药的结果与本实验室以往的结果一致，实验系统成立，实验结果可信。

实施例2

七叶内酯抗炎作用及机制的研究

实验原理：炎症反应是常见的一种病理生理过程，参与多种疾病的发生与发展。炎症反应是一种复杂的防御反应，由多种细胞因子参与，如TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ、NO等。在免疫反应发生过程中，巨噬细胞扮演着重要的角色，许多细胞因子即来源于活化的巨噬细胞，其中，NO、TNF-α、IL-6为评价炎症反应发生较敏感的指标，NF-κB、MAPK信号通路是重要的炎性信号通路。本实验为在体外模拟炎症发生过程，采用脂多糖(LPS)诱导小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)模型，采用Griess试剂法检测七叶内酯(QYNZ)对细胞分泌NO的抑制作用，采用ELISA方法检测提取物对细胞分泌的TNF-α、IL-6的抑制作用，应用细胞免疫荧光的方法评价对NF-κB、MAPK信号通路的抗炎作用机制。

实验材料：样品七叶内酯(QYNZ)，由新疆药物研究所植物化学室自天山堇菜中提取，批号20180926。RAW264.7细胞(小鼠腹腔巨噬细胞)购于北京协和医学院基础医学院细胞中心。脂多糖(LPS Escherichia Coli 055：B5)，美国Sigma公司，货号：L2880；CellTiterAQueous One Solution Cell Proliferation Assay，美国Promega公司，货号：G3581；Griess试剂盒，碧云天公司，货号：S0021；Mouse TNFαELISA Ready-SET-GO，货号：88-7324-88，Mouse IL-6 ELISA Ready-SET-Go，货号：88-7064-88，Thermo Fischer Scientific公司；TritonX-100购于Thermo Fischer Scientific公司，货号：8511；BSA购于美国Sigma公司，货号：A1933；p-p44/42(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体，货号：4370S，p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)抗体，货号：9211S，美国CST公司；p-NF-κB p65(Ser536)抗体，货号：3033S，IκBα(E130)抗体，货号：ab32518，美国abcam公司；Hoechst 33342核染料，日本东仁化学公司，货号：H342；荧光二抗Alexa Fluor 546goat anti-mouse IgG或Alexa Fluor546goat anti-rabbit IgG，Thermo Fischer Scientific公司，货号：A11035或A11030；吲哚美辛，美国Sigma公司，货号：I7378。

实验步骤：RAW264.7细胞于37℃、5％CO₂及饱和湿度环境下培养于含10％胎牛血清1640培养基，细胞呈对数增长时进行传代，调整细胞浓度至6×10⁵个/mL，接种100μL于96孔培养板，37℃、5％CO₂及饱和湿度环境下孵育，待细胞长满约90％时随机分为7组：空白对照组、模型组、化合物QYNZ处理组(终浓度为0.16μM、0.8μM、4μM、20μM)、阳性药吲哚美辛组(10μM)，以上各给药组均按设定剂量加入相应浓度的药液，除空白对照组外每孔加入终浓度为1μg/mL的LPS，终体积均为100μL，细胞于37℃、5％CO2培养箱内孵育24h后进行相关检测。

①取细胞上清，按照ELISA试剂盒说明书分别检测TNF-α和IL-6水平；

②采用Griess试剂检测细胞上清中NO的浓度。

③检测QYNZ对iNOS表达水平的影响。

孵育24h后，按照100μL/孔加入4％多聚甲醛室温固定20min，弃去并用PBS清洗；100μL/孔加入0.25％Triton X-100打孔液室温作用15min，PBS清洗；再加入100μL/孔3％BSA封闭45min，弃去封闭液，加入Anti-iNOS抗体，4℃孵育过夜，次日用PBS清洗，加入含Hochest 33342的山羊抗兔荧光二抗，室温避光孵育2h，PBS清洗，于Cellomics Arrayscan高内涵细胞分析系统检测分析。

④QYNZ对NF-κB通路、MAPK信号通路的作用机制。提前加入化合物QYNZ(0.16μM、0.8μM、4μM、20μM)和阳性药吲哚美辛(10μM)孵育4h，其它组别平行加入10μL/孔PBS；向细胞中加入1μg/mL LPS孵育15min检测IκBα的降解、孵育30min检测p-p65核内表达，孵育45min检测p-p38、p-ERK1/2核内的表达。

细胞处理结束后，按照100μL/孔加入4％多聚甲醛室温固定20min，PBS清洗；再按照100μL/孔加入0.25％Triton X-100打孔液室温作用15min，PBS清洗；再加入100μL/孔3％BSA封闭45min，弃去封闭液，分别加入anti-IκBα抗体、anti-p-p65抗体、anti-p-p38抗体、anti-p-ERK1/2抗体，4℃孵育过夜；次日用PBS清洗后加入含Hochest 33342的山羊抗兔(或抗鼠)荧光二抗，室温避光孵育2h，于Cellomics Arrayscan高内涵细胞分析系统检测分析。

结果如图1-8所示：

七叶内酯对RAW264.7细胞活性的影响如图1，七叶内酯对LPS诱导RAW264.7急性炎症时分泌TNF-α的影响如图2，七叶内酯对LPS诱导RAW264.7急性炎症时分泌IL-6的影响如图3，图1-3中，LPS模型组与空白对照组比较，###P<0.001；给药组与LPS模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

七叶内酯对LPS诱导RAW264.7急性炎症时iNOS蛋白表达表达量和产生NO的影响分别如图4(a)和图4(b)，图中，LPS模型组与空白对照组比较，###P<0.001；给药组与LPS模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

七叶内酯对LPS诱导RAW264.730min时p-p65蛋白表达的影响如图5，图中LPS模型组与空白对照组比较，###P<0.001；给药组与LPS模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

七叶内酯对LPS诱导RAW264.715min时IκBα蛋白表达的影响如图6，图中LPS模型组与空白对照组比较，###P<0.001；给药组与LPS模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

七叶内酯对LPS诱导RAW264.745min时p-p38蛋白表达的影响如图7，图中LPS模型组与空白对照组比较，###P<0.001；给药组与LPS模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

七叶内酯对LPS诱导RAW264.745min时p-ERK1/2蛋白表达的影响如图8，图中LPS模型组与空白对照组比较，###P<0.001；给药组与LPS模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

由图1-8可知，七叶内酯QYNZ能够明显抑制LPS诱导RAW264.7细胞内TNF-α、IL-6和NO的释放，减缓iNOS的表达以及p-p65、p-p38、p-ERK1/2蛋白由细胞质向细胞核转位，并减少IκBα蛋白降解，因此，QYNZ可能通过抑制NF-κB、MAPK信号通路的活化减轻炎症反应的发生。

实施例3

七叶内酯对T、B淋巴细胞增殖作用的影响

实验材料：样品七叶内酯，由新疆药物研究所植物化学室自天山堇菜中提取，批号20180926。刀豆蛋白A(ConA)，Sigma公司；LPS，Escherichia coli 0111:B4，Sigma公司；NH₄Cl，GIBCO 1640培养基，Gibco胎牛血清，MTS，天山堇菜七叶内酯10mg，将其溶于200μLDMSO得到浓度为50mg/mL的母液。采用不完全1640将母液2倍倍比稀释至一系列浓度梯度，取100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56μg/mL的系列浓度。

实验步骤：制备脾淋巴细胞悬液：将200目尼龙网置于小培养皿中，从筛网上加入适量不完全1640培养基。处死3只小鼠，用75％酒精消毒后，取脾脏置于筛网上，研磨过200目筛，吸取脾细胞悬液，1500r/min离心后弃上清加入NH₄CL轻轻振摇，1500r/min离心后弃上清，加入不完全1640培养液重悬细胞，1500r/min离心后收集细胞，加入完全1640培养液混悬并调整脾细胞密度为200×10⁴/mL，接种96孔板，100μL/孔。

对T、B淋巴细胞增殖的影响：T淋巴细胞增殖实验：设置细胞对照组、Con A对照组、七叶内酯不同浓度给药组。B淋巴细胞增殖实验：设置细胞对照组、LPS对照组、七叶内酯不同浓度给药组。各给药组依次加入不同浓度的药液10μL，然后每孔依次加入160μg/mL的ConA或100μg/mL的LPS，最后用完全1640培养液补足200μL体系，将细胞置于37℃5％CO2培养箱培养48h，收集细胞上清用于检测细胞因子TNF-α、IL-2和IL-6的含量。此外，细胞对照组、Con A或LPS对照组以及各给药组每孔加入10μLMTS，37℃5％CO₂培养箱孵育2h，用M2酶标仪检测OD490，即：检测药物对ConA诱导T淋巴细胞增殖以及LPS诱导B淋巴细胞增殖的影响，结果如表3-5所示，。

表3天山堇菜七叶内酯对ConA诱导小鼠T淋巴细胞增殖的影响

注：与空白对照组比较，^##P<0.01；与ConA诱导组比较，^＊＊P<0.01。

表4天山堇菜七叶内酯对LPS诱导小鼠B淋巴细胞增殖的影响

注：与空白对照组比较，^##P<0.01；与LPS诱导组比较，^＊P<0.05，^＊＊P<0.01。

表5天山堇菜七叶内酯对ConA诱导小鼠T淋巴细胞分泌细胞因子的影响

注：与空白对照组比较，^##P<0.01；与ConA诱导组比较，^＊＊P<0.01。

由上表3-5可知，七叶内酯可显著抑制ConA诱导T淋巴细胞增殖、并抑制T淋巴细胞分泌TNF-a，IL-6，IL-2，对LPS诱导的B淋巴细胞增殖也具有显著抑制作用，说明天山堇菜七叶内酯具有一定的免疫调节作用。