阅读说明：本技术 Plekhg5基因甲基化在弱精症诊断剂中的应用及试剂盒 (Application of PLEKHG5 gene methylation in asthenospermia diagnostic agent and kit ) 是由 杜野 薛兴奎 古艳丽 陈晓玲 马晓瑞 于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及人PLEKHG5基因启动子区的甲基化水平在制备检测精子活力的检测剂中的应用,所述人PLEKHG5基因启动子区位于人1号染色体第6545514至6548214位对应的区域。本发明通过基于全基因组甲基化测序结果进行分析和研究并通过验证,发现人PLEKHG5基因启动子区是否存在部分甲基化位点被甲基化在弱精症患者与健康人之间存在着显著性差异,可作为分子标志来诊断受试者是否患有弱精症。当该区域的所有甲基化位点均未被甲基化时,受试者患有弱精症的可能性较大。该分子标志可为弱精症的诊断提供辅助评价信息,结合其他诊断指标一起鉴定受试者是否患有弱精症。(The invention relates to application of methylation level of a promoter region of a human PLEKHG5 gene in preparing a detection agent for detecting sperm motility, wherein the promoter region of the human PLEKHG5 gene is positioned in a region corresponding to 6545514 to 6548214 of a human chromosome 1. According to the invention, through analysis and research based on a whole genome methylation sequencing result and verification, the fact that whether partial methylation sites exist in the promoter region of the human PLEKHG5 gene and are methylated is found to have a significant difference between a patient with asthenospermia and a healthy person, and the promoter region can be used as a molecular marker to diagnose whether a subject suffers from asthenospermia. When all of the methylation sites in this region are unmethylated, the subject is more likely to have asthenospermia. The molecular marker can provide auxiliary evaluation information for diagnosis of asthenospermia, and can be combined with other diagnosis indexes to identify whether a subject suffers from asthenospermia.)

PLEKHG5基因甲基化在弱精症诊断剂中的应用及试剂盒

技术领域

本发明涉及人类生殖健康领域，更特别地，涉及人PLEKHG5基因启动子区的甲基化水平在制备弱精症诊断剂中的应用，以及一种弱精症诊断试剂盒。

背景技术

40％以上的不育男性均检测出患有弱精症。弱精症的病因是多因子的，例如，可能与内分泌紊乱、环境因素、生活经历甚至年纪渐长等都密切相关。对鼠类进行基因敲除和突变的研究显示，一些基因的突变与***活性改变相关，但是这些基因在人类研究中均显示与***活性无关。尽管近50％的不育案例被认为由遗传缺陷所致，但是，在一些男性不育的案例中，遗传因素貌似并非主要因素。越来越多的证据显示，在男性不育中，异常的表观遗传改变也有贡献。

***是具有高度多样性的细胞群，其在DNA和***质量参数上均体现出高度的多样性。有研究者已经开始研究***DNA甲基化的样品内多样性，包括不同***之间的***DNA甲基化多样性和同一次***物中不同质量的***区之间的***DNA甲基化多样性。本申请的发明人在研究过程中发现并报道(杜野等，Human Reproduction,Vol.31,No.1pp.24–33,2016，Promoter targeted bisulfite sequencingreveals DNA methylationprofiles associated with low sperm motility in asthenozoospermia)，一些特定区域上的甲基化在弱精症患者的***与正常对照的***之间存在显著的差异，推测其中某些区域的甲基化可能与弱精症的发病相关联。

然而，目前已报道的可作为弱精症的分子标志物的甲基化区域十分少，难以用来准确诊断受试者是否患有弱精症，因此需要鉴定更多与弱精症相关的甲基化区域，从而为后续诊断和治疗的应用提供更多依据。

发明内容

我们在以前研究的基础上，继续深入研究，寻找和分析与弱精有关联的差异甲基化区域。基于此，本发明提供了人PLEKHG5基因启动子区在制备弱精症诊断剂中的应用。

在一个具体实施方案中，所述人PLEKHG5基因启动子区位于人第1号染色体第6545514至6548214位对应的区域。

在一个具体实施方案中，所述人PLEKHG5基因启动子区为如SEQ ID NO:1所示序列对应的区域。

本发明还提供了一种弱精症诊断试剂盒，包括检测人PLEKHG5基因启动子区的甲基化水平的引物。

在一个优选实施方案中，所述诊断试剂盒包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对由序列分别为SEQ ID NO:2和3的两条引物组成，所述第二引物对由序列分别为SEQ ID NO:4和5的两条引物组成。

在一个优选实施方案中，所述检测试剂盒还包括亚硫酸氢盐溶液。

在一个优选实施方案中，所述亚硫酸氢盐溶液为亚硫酸氢钠溶液。

本发明通过基于全基因组甲基化测序结果进行分析和研究并通过验证，发现人PLEKHG5基因启动子区是否存在部分甲基化位点被甲基化在弱精症患者与健康人之间存在着显著性差异，可作为分子标志来诊断受试者是否患有弱精症。当该区域的所有甲基化位点均未被甲基化时，受试者患有弱精症的可能性较大。该分子标志可为弱精症的诊断提供辅助评价信息，结合其他诊断指标一起鉴定受试者是否患有弱精症。

附图说明

图1为全基因组测序研究中8名健康志愿者的级分a中的***(Na)与7名弱精症患者的级分a中的***(Aa)的人PLEKHG5基因启动子区甲基化水平统计图；

图2为验证研究中50名健康志愿者的级分a中的***(Na)与30名弱精症患者的级分a中的***(Aa)的人PLEKHG5基因启动子区甲基化水平统计图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1、***分离

招募7个弱精症志愿者(A组)和8个健康志愿者(N组)，从志愿者获取***样品，进行全基因组甲基化水平测序研究。使用Sperm Class Analyzer进行计算机辅助的***分析(CASA)，进行Diff-Quik快速染色法评价***形态。通过以下方法将具有不同活力的***分离：在300×g下离心20min，制备非连续密度梯度级分(分为47.5、57、76和95％浓度层)，从95％浓度层(级分a)收集高活力***细胞，从57％与76％浓度层之间(级分c)收集低活力***细胞。收集到的***经PBS洗两次后，提取基因组DNA

2、文库构建与甲基化测序

使用试剂盒从***细胞中提取基因组DNA，用于文库构建。将1μg基因组DNA打断成约200-300bp的片段。纯化后将DNA片段用T4 DNA聚合酶、Klenow片段和T4多聚核苷酸激酶处理，形成平端的DNA片段，将平端DNA片段进行3’腺苷化，然后与接头连接，得到文库。对文库定量后，将其用于液相杂交捕获和亚硫酸氢盐测序。

经数据处理分析，我们发现，A组和N组的无论级分a还是级分c的全局DNA甲基化水平几乎相等，没有显著差异。但是，在一些区域上，存在A组与N组之间，或者同一组的不同级分之间，存在着甲基化的差异性。

3、差异甲基化区域的鉴定

对上述差异甲基化区域进行分析，我们发现，第1号染色体第6545514-6548214位(参考基因组：GRCh37/hg19，UCSC Genome Browser)之间的区域存在甲基化水平差异，该区域为PLEKHG5基因的启动子区，覆盖该基因的第-2711至-11位(SEQ ID NO:1)。我们的研究显示，该区域内的甲基化水平在N组的级分a与A组的级分a之间具有显著差异。如表1和图1所示，A组级分a的***中，该区域的所有甲基化位点均未被甲基化，而8份N组级分a的***中，有5份***在该区域存在不同程度的甲基化，极显著性P值为0(<0.01)。因此，我们推测，级分a中的***在该位点的甲基化水平可作为诊断受试者是否患有弱精症的分子标志物。

表1 N组的8个健康人的PLEKHG5基因启动子区的甲基化水平

4、临床验证

我们另外招募了50个健康志愿者和30名弱精症志愿者，收集这他们的的***样品，用于临床验证。

通过以下方法将具有不同活力的***分离：在300×g下离心20min，制备非连续密度梯度级分(分为47.5、57、76和95％浓度层)，从95％浓度层(级分a)收集高活力***细胞，从57％与76％浓度层之间(级分c)收集低活力***细胞。收集到的***经PBS洗两次后，提取基因组DNA。

设计引物，采用位点特异性亚硫酸氢盐测序(locus specific bisulfitesequencing，LBS)检测1染色体第6545514-6548214位之间的区域内的甲基化率。方法如下：

采用EZ DNA Methylation-Direct Kit(Zymo Research)进行亚硫酸氢盐处理。基因组DNA经过99℃变性8min，随后立即加入亚硫酸氢盐溶液于64℃孵育3.5h进行转换；转换后的基因组DNA通过回收柱回收后作为模板用于PCR。

采用HotStarTaq Master Mix(Qiagen)进行位点特异性PCR。根据待测区域，分别设计了两对引物(表2)进行扩增和测序，每对引物扩增片段长度在2kb左右，扩增产物经回收后用ABI3730测序仪完成，甲基化状态通过比较C-T转换来检测。

表2 PCR引物

结果如图2所示，50个健康人级分a的***中，有38份该区域存在不同程度的甲基化，占所有健康人样品级分a样品的76％，30个弱精症患者级分a的***该区域的所有甲基化位点均未被甲基化，极显著性P值为0(<0.01)。因此，当受试者该区域的所有甲基化位点均未被甲基化，其患有弱精症的概率较大。由此可见，PLEKHG5基因的启动子区(-2711至-11位)是否发生甲基化可用作诊断受试者是否患有弱精症的辅助标准。

需要说明的是，本文中以GRCh37/hg19作为参考基因组定位相关区域，本领域还有其他参考基因组，对于相关区域的标示可能与本文中不同，但是，只要通过blast等比对工具最终比对到与本研究中所标示区域对应，均应落在本发明的保护范围之内。同样的，本文中虽然仅列出了SEQ ID NO:1作为一个实例，但是，本领域技术人员应当清楚，基因组中的序列不是完全保守的，有可能有变异存在，不需要所检测的序列与SEQ ID NO:1完全相同，仅需要通过blast等比对工具最终比对到与SEQ ID NO:1对应，即可认为落在本发明的保护范围内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳市龙华区人民医院

<120> PLEKHG5基因甲基化在弱精症诊断剂中的应用及试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2701

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

agttatctgc ctacaggaca gtatgggggt ggaggtctgg ggcaagacca cccgatttga 60

agtaggaact cacctgccca gggccagcag gcccaaggtc atggatacta ggaggaggaa 120

gagaccttcg gtctggcagt ggggaaggct ctgttgactg tcggccacag gaagggatat 180

cctggccgag ccctttcctg tccccatgtc cttctgtggc atgaaggccc ttctgccttc 240

atctgttcac tgatctcatc cccaccaagc gcacctactg tgcaccagga ctgttctaag 300

tgccgaggac acagtgagat gcagacggcc aaggcgctgg cttctggaga ggacagtctg 360

gtagggaaga atgatgataa aaaagtgaac aaagaaatga attacaggta gtaataaaca 420

ctaagaagga aataatttaa cttaaaggaa ttgagagtgg gagggtaagg gtggtttatt 480

ttaagatgag ggaaaaggac gtcttagagg taacatttaa gttggggccc ggtgtcagct 540

gtttcaagat agggtgcgtg gaattccaga cagaaaatac agaggagaag gccctgagct 600

tggcgagctg tagggagaga aggaagaccg gcaggtggac cctgtgcgga ccagctggga 660

gggaggcggg agcccggcca tggtgggatt tcactataag caagatggga agttttagtt 720

ttcaaaactc tgcctgttgg ccgggtgtgg tggctcatgc ctgtaatctc agcactttgg 780

gaggccaagg tgggggtgga tcacttgaga tcaggagtta gtgaccagcc tggtcaacat 840

ggcgaaaccc catctctact aaaatacaaa aagtagctgg gtgtagtggc gggcgcctgt 900

aatcccagct actggggagg ctgaggcaga agaatcactt gaacctggga ggtggaggtc 960

gtagtgagct gggatcatgc cactgcactc caacgtgagt gacagagcaa gattccgtct 1020

caaaaacaaa caaacaaaaa acaaaaacac aactctgcct gtggtgtaga cagtgggtga 1080

cctgggcttt gggagtggag acagccctgg aagtctccca gcctctaata aaacgctgct 1140

gccctcccaa agccatctca cggaccctgg cccccttccc accctctttc cccatggaac 1200

caggtggagg aggagcaatt aggggtgggt gggctgatga cagacagcat ggccacctca 1260

cccccatggg ttctgaggag tgtcccaagg aggccatccc agaatcccag agccacagtc 1320

tgagtttcag tcttgcctgt agacttttgt ctctttatgt cactttatcc cccacgccgt 1380

gaatggggct aatggtgcct gccctgcctt cctgggaatc agtgtaaaag cgctttgaca 1440

gccgtgtagt ggtgactcca gcaccagagt ctgggcgttt gcgtcctctc aggctttgct 1500

gagtgccccc tggcggtggg gacctggcct agaactgcag ggacctgggc tgctgtgcca 1560

tgtgggtcgc cagggtttcc tgatgcctcc acctcaccca gctcctgggg gctgccaagg 1620

atagcctctc agagcagccc gccttctgcc cacggccctt tccagaggcc accggccttt 1680

ggctctcggc ctctgccgta cctgggcagt gagcagtcgg tgtgaggggg tgtccctggg 1740

gctcaggctc tcgggcaggg gtctccaggt tgatgggagg ggctgagatg agagctggtt 1800

gtgaggttgg ggtgggtgtg tgactggggc tcaaagctgg tgttggagca gagaggggtg 1860

tccctggggc tagatggaga gccggaccaa ggaccctgag gggagtgtgc cccatcctgg 1920

cctccccctt ctggtgcctg tattctaaga gctcccttgc tgggagtaag aaggggtccc 1980

ctgggctgag gctccgaggc gggggtgggg gtctccagga ggaagggagg agggaaggta 2040

cccttctggc tgggagggac cgtgcgtgtt ggcgctgagg gtgaggtggg gaccacagca 2100

gagtgggcac ccccagggct gggcggggat cgagtcaccc aggggagggg ctccacagtc 2160

tccaaggtgg gggggggtgt caccagcgcc ccctgcctcc agcattcaag gagctcccca 2220

ggagaaagag caagttctga ggagccctct gagcccggca ttggtgttga ggagggagtc 2280

agagaagaga ggggcccggg gccgcgcaga ggcgcagagg tgggggtacc ccgggccagg 2340

cagaggtggg aaggtggggg tcccggggac tgggcggagg cggggctgtg ggggtccccc 2400

ggccgggcag aggtaggggt gtggagtccc cgggtctggg cagaggcggg gaggcggggg 2460

gtcgcccggg caggcggagg cgggggtgta ggggttcccg ggcggggagg cggggatccc 2520

cggggctggg tggcgagggc ccgggcggga gggaggtgtc cgccttcctg gggggctggg 2580

ggctgttccg ggcccggccc tccccggggt ccccgcgctc ggcgggggcg ggcgcggccg 2640

cacaatggca ggaagcgggg ctccgcgctt tgtccggcgg gcggcgcaga ccgcggcttc 2700

c 2701

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggtggtata tggaatgttt agtga 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccttcttact cccaacaaaa aaact 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtttaaagt tggtgttgga gtaga 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctacccacc atatcctacc tctat 25