一种防治老年性痴呆的药物
阅读说明：本技术 一种防治老年性痴呆的药物 (Medicine for preventing and treating senile dementia ) 是由 王昊 戴好富 陈志宝 梅文莉 魏艳梅 于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,尤其涉及一种防治老年性痴呆的药物。本发明研究表明式I所示的化合物能够抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性,并可以保护神经细胞。因此表明该化合物能够用于制备治疗和/或预防老年性痴呆的食品和/或药品。该化合物来源于药用真菌桦褐孔菌,经验证,其副作用小,10倍剂量灌胃未表现出生理毒性。(The invention relates to the technical field of medicines, in particular to a medicine for preventing and treating senile dementia. The research of the invention shows that the compound shown in the formula I can inhibit the activity of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase and can protect nerve cells. Therefore, the compound can be used for preparing food and/or medicines for treating and/or preventing senile dementia. The compound is derived from medicinal fungus inonotus obliquus, has small side effect, and shows no physiological toxicity after being perfused by 10 times of dosage.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种防治老年性痴呆的药物。
背景技术
随着社会的进步和人民生活水平的提高，人们的寿命越来越长。然而一些老年高发病如神经退行性疾病的发病率也逐年增高。老年性痴呆，又名阿尔茨海默症(AD)，是退行性疾病中的一种，主要表现为大脑功能退化，如学习和记忆力减退，视空间机能损害(患者容易出现迷路的情况)，性格转变(情感淡漠或急躁不安)。随着人类预期寿命的增加，AD在发达国家已成为首要的几个致死原因之一。在发展中国家，随着人口老龄化的加剧，AD患者的比例也逐年提高，给家庭和社会带来很大的负担。药物治疗的主要目的是延缓或阻止痴呆程度的加重，提高患者的日常生活能力，减少并发症，从而改善生存质量，延长存活期。目前用于治疗的药物主要是胆碱酯酶抑制剂类药物，如盐酸多奈哌齐、他克林、重酒石酸卡巴拉汀等。这类药物虽然有效，但是副作用大。如他克林是非选择性可逆性的胆碱酷酶抑制剂，口服后可透过血脑屏障进入大脑，对治疗或延缓病情有明显作用。但其生物利用度低，个体吸收差异大，使其疗效波动很大，药物的毒性大，使一些病人不能接受有效的治疗量。
从中药里面分离纯化化合物用于老年性痴呆的治疗已有成功的案例。如石杉碱甲从石杉科千层塔中提取的一种生物碱，是一种可逆性胆碱脂酶抑制剂，具有促进记忆再现和增强记忆保持的作用，且口服活性高，作用时程长，副作用小。
桦褐孔菌又名桦树茸，主要生于白桦、银桦、榆树和赤杨等的树皮下或活立木树皮下或砍伐后树木的枯干上。研究表明，其具有治疗胃肠病、帮助肿瘤康复、抗氧化、降三高等作用。但目前尚未发现其在防治AD方面的作用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种防治老年性痴呆的药物，式I化合物来自药用真菌桦褐孔菌，能有效抑制关键酶、保护神经细胞、改善模型动物的记忆力，具有防治老年痴呆的作用，且具有良好的安全性。
本发明提供了式I化合物在制备乙酰胆碱酯酶和/或丁酰胆碱酯酶活性抑制剂中的应用；
本发明还提供了式I化合物在制备保护神经细胞的制剂中的应用；
在本发明实施例中，所述保护神经细胞为在氧化条件下保护神经细胞。
具体实施例中，所述氧化为过氧化氢引起的氧化。
在本发明实施例中，所述神经细胞为人骨髓神经母细胞。
具体实施例中，用于验证式I化合物活性的是人骨髓神经母细胞瘤细胞。具体细胞株为SH-SY5Y。
本发明还提供了式I化合物在制备预防和/或治疗阿尔兹海默症的药物中的应用；
本发明中，所述预防和/或治疗包括改善学习能力。
所述改善学习能力包括改善动物定位航行能力和/或改善动物空间探索能力。本发明中，用以验证式I化合物功效的动物是鼠，具体为大鼠。
本发明实施例中，所述阿尔兹海默症为氧化导致的阿尔兹海默症。
一些具体实施例中，所述氧化导致的阿尔兹海默症为由D-半乳糖引起的阿尔兹海默症。
本发明还提供了一种防治阿尔兹海默症的药物，其包括式I化合物；
本发明中，所述式I化合物的制备方法包括：
步骤1：将桦褐孔菌子实体粉碎后，以体积分数不低于95％的乙醇水溶液浸提3次，所得浸提液过滤后合并浓缩成浸膏A；
步骤2：将所述浸膏A加水制成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩制成浸膏B；
步骤3：取浸膏B，过减压柱，经石油醚、乙酸乙酯的混合液以及氯仿、甲醇的混合液梯度洗脱，获得20个流分，记为Fr.1～Fr.20；
步骤4：取Fr.6和Fr.7合并，过反相柱，以50％～100％甲醇水溶液梯度洗脱，得到25个流份，记为Fr.(6、7)-1～Fr.(6、7)-25；
步骤5：取Fr.(6、7)-22，过普通硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯的混合液进行梯度洗脱，得到17个流份，记为Fr.(6、7)-22-1～Fr.(6、7)-22-17；
步骤6：合并Fr.(6、7)-22-13～Fr.(6、7)-22-14，经析晶得到式I化合物。
在本发明中，所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
所述药学上可接受的辅料包括水果粉、食用香精、甜味剂、酸味剂、填充剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、食用色素、稀释剂、乳化剂、崩解剂或增塑剂中的一种或两者以上的混合物。
作为优选，所述药物为口服制剂。优选的，其剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
更优选的，所述胶囊剂为硬胶囊剂或软胶囊剂。更优选的，片剂为口服片剂或口腔片剂。更优选的，口服片剂指供口服的片剂，多数此类片剂中的药物是经胃肠道吸收而发挥作用，也有的片剂中的药物是在胃肠道局部发挥作用。在本发明提供的一些实施例中，口服片剂为普通压制片、分散片、泡腾片、咀嚼片、包衣片或缓控释片。
本发明还提供了一种治疗阿尔兹海默症的方法，其为给予本发明所述的药物。
本发明研究表明式I所示的化合物能够抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性，并可以保护神经细胞。因此表明该化合物能够用于制备治疗和/或预防老年性痴呆的食品和/或药品。该化合物来源于药用真菌桦褐孔菌，经验证，其副作用小，10倍剂量灌胃未表现出生理毒性。
具体实施方式
本发明提供了一种防治老年性痴呆的药物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例
1.化合物的制备
取桦褐孔菌子实体粉碎成粉末后，采用95％以上的乙醇水溶液浸提3次，所得浸提液过滤后合并浓缩成浸膏。之后加水搅拌制成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，各萃取层萃取至萃取液无色。各萃取层蒸发浓缩制成浸膏待用。
取乙酸乙酯层浸膏，过减压柱(硅胶H)，采用石油醚：乙酸乙酯(1:0→1:1)→氯仿：甲醇(20:1→0:1)系统梯度洗脱，并将所得馏分分别点板浓缩合并，得到20个流份(Fr.1～Fr.20)。
将其中Fr.6和Fr.7合并(17.086g)过反相柱，以50％～100％甲醇水梯度洗脱，得到25个流份(Fr.(6、7)-1～Fr.(6、7)-25)。Fr.(6、7)-22经普通硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝100:1～4:1)得到17个馏份(Fr.(6、7)-22-1～Fr.(6、7)-22-17)。其中(Fr.(6、7)-22-13～Fr.(6、7)-22-14)合并经洗晶得式I化合物：
2.式I化合物对阿尔兹海默症的关键酶的抑制作用
2.1化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性
待测样品溶液的配制：取675μL配置好的PBS溶液(pH为8.0)于EP管中，将待测化合物溶解于DMSO后(浓度为1mM)，取45μL的该溶液加至EP管中，最后吸取90μL 0.2U/mL的乙酰胆碱酯酶溶液，摇匀，分别取4次180μL混合均匀的待测溶液于96孔板中；(阴性与空白：取675μL配好的PBS溶液于EP管中，再取45μL的DMSO溶液加至EP管中，最后吸取90μL乙酰胆碱酯酶溶液，摇匀，分别取4次180μL混合均匀的待测溶液于96孔板中)
将96孔板于37℃放置15分钟后，各组均加入20μL(10μL(10mM)AICI(碘代硫代乙酰胆碱)+10μL(2mM)DTNB(5,5'-二硫-双-2-硝基苯甲酸))底物；(空白：加入10μL PBS+10μL(1mM)DTNB)溶液)
将96孔板于37℃放置30分钟后，设置酶标仪于412nm波长下测量每孔的OD值吸光度.
计算化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，计算公式如下：
抑制率＝(ODDMSO-OD样)/(ODDMSO-ODPBS)×100％
将化合物倍半稀释几个梯度后，以相同的检测方法检测不同浓度样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率，利用GraphPad Prism 7软件计算其IC50值。
2.2化合物对丁酰胆碱酯酶的抑制活性
待测样品溶液的配制、检测方法及酶活性的计算方法同上，将乙酰胆碱酯酶换成丁酰胆碱酯酶即可。
结果如表1所示，化合物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶都有一定程度的抑制活性，其中化合物2的抑制活性最强。
表1化合物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制活性
3.神经保护检测方法
选取SH-SY5Y(人骨髓神经母细胞瘤细胞株)细胞，在96孔平底细胞培养板上接种100μL浓度为5×104个/mL的细胞，培养于37℃，5％CO2，90％以上湿度的条件下，24h后加入100μL配制好的待测化合物溶液(终浓度40μM)，继续在该条件下培养，5h后加入50μL稀释过的H2O2(终浓度1000μM)溶液，3h后向每孔中加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，反应4h后吸走上清液，再向每孔加入100μL DMSO使其充分溶解。于酶标仪490nm波长下测定并记录每孔的吸光度，按下面公式计算肿瘤细胞生长抑制率。对照组为吲哚美辛，阴性对照组为DMSO，把待测化合物倍半稀释6个浓度梯度。用横坐标表示待测化合物浓度，纵坐标表示抑制率，作图求出待测化合物的IC50值。结果如表2所示，化合物能促进SH-SY5Y神经细胞的增值，且效果显著好于阳性对照维生素E。
表2化合物对SH-SY5Y的保护作用
4.Morris水迷宫实验
SPF级健康成年SD大鼠70只，体质量(220+20)g，雌雄各半，购于海南医学院大学实验动物中心。在标准环境适应性饲养1周后，Morris水迷宫试验淘汰反应过于迟钝(在2min内没有找到平台)或敏感(找到平台10s内)的大鼠将选出的50只大鼠随机分为空白组、模型组、化合物低高2个剂量组和以及阳性药物他克林对照组，每组10只。
各组处理如下：
模型组：大鼠腹腔注射D-半乳糖120mg/kg，一天一次，连续6周，构建痴呆模型；
空白组：大鼠皮下注射等量生理盐水；
他克林组：大鼠腹腔注射D-半乳糖120mg/kg，一天一次，连续6周。从第一天开始予以他克林组灌胃，均为1次/d，剂量5mg/kg，连续8周；
式I化合物低剂量组：大鼠腹腔注射D-半乳糖120mg/kg，一天一次，连续6周。从第一天开始予以50mg/kg化合物灌胃，均为1次/d，连续8周；
式I化合物高剂量组：大鼠腹腔注射D-半乳糖120mg/kg，一天一次，连续6周。从第一天开始予以72mg/kg化合物灌胃，均为1次/d，连续8周；
各组正常饮食，为了保持实验条件一致，空白组和模型组每天均给予等剂量(与化合物灌胃的溶液剂量相等)的等渗盐水灌胃，连续8周。
8周处理结束后，进行水迷宫实验，水迷宫主要由两大部分构成，一个圆形水池(直径为120cm、高为50cm)和一个平台(可以移动位置，直径为10cm、高为22cm)。水池外表面有一支架外搭遮光布，防止外界光线、人员等干扰。水池内水温升温到23℃左右，平台放置在圆形水池某一象限的中心并且水面要比平台高1cm。测试过程当中保持物品等空间参照物摆放位置固定，以排除干扰因素。
①定位航行实验(place navigation)用于反映大鼠的学***台，电脑自动存储大鼠爬上平台的时间，即逃避潜伏期(EL，escapelatency)，如果在一分钟内，大鼠还未找到平台，则用一棍棒类物品诱导爬上平台。大鼠连续游泳中间有两分钟休息时间。
②空间探索实验(spatial probe test)第六天大鼠的记忆能力撤掉平台，让大鼠从原始平台相对位置返回池内，并记录大鼠穿越平台数。(我们在进行行为学测试时应当保持避光，安静，使参照物位置不变)
结果如表3所示，随着训练时间的延长，大鼠的逃避潜伏期越来越短，大鼠在接受定位航行实验的第四天和第五天，他克林组及化合物的各个剂量组的逃避潜伏期均明显低于模型组。第六天他克林组及化合物的各个剂量组大鼠穿越平台次数也显著高于模型组。表明三种化合物可以增强大鼠的学习记忆能力。
表3化合物对大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数的影响(
**示与模型组相比存在显著性差异，p<0.05
5.安全性实验
给小鼠一次灌胃化合物，剂量为720mg/kg，对其饮食和行为均未造成影响，因此该化合物急性毒性甚小，口服安全。给药组大鼠毛发光泽和精神状态好，正常饮水饮食，给药一周后体重开始持续增加。表明三种化合物在有效剂量范围内可以安全使用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。