阅读说明：本技术 一类来源于桦剥管孔菌的降二萜化合物管孔菌醇的应用 (Application of diterpene-reducing compound poriferol derived from birch tube-peeling pore fungus ) 是由 刘吉开 赵珍珠 陈贺平 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及微生物药物化学技术领域,具体涉及从一株桦剥管孔菌(<I>Piptoporus </I><I>betulinus</I>)菌株的发酵产物中分离获取的六种降二萜化合物的医药用途。本发明通过免疫抑制活性筛选试验证实这六种化合物具有显著的抑制由刀豆蛋白A刺激的T淋巴细胞和由细菌脂多糖刺激的B淋巴细胞增殖的活性,并且对T、B淋巴细胞无毒性,具有作为制备新的免疫抑制类药物的用途。(The invention relates to the technical field of microbial medicine chemistry, in particular to a birch tube-peeling hole bacterium (A) Piptoporus betulinus ) The six diterpenoid reducing compounds separated and obtained from the fermentation products of the bacterial strains have medical application. The inventionThe six compounds are proved to have remarkable activity of inhibiting the proliferation of T lymphocytes stimulated by the concanavalin A and B lymphocytes stimulated by bacterial lipopolysaccharide by an immunosuppressive activity screening test, have no toxicity to T, B lymphocytes, and have application in preparing novel immunosuppressive medicaments.)

一类来源于桦剥管孔菌的降二萜化合物管孔菌醇的应用

技术领域

本发明涉及微生物药物化学技术领域，特别是涉及六种来源于桦剥管孔菌的降二萜化合物在免疫抑制活性的药物开发中的应用。

背景技术

人体免疫系统是由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，是机体执行免疫应答及发挥免疫功能的重要系统。免疫系统分为固有免疫和适应性免疫，其中适应性免疫又分为体液免疫和细胞免疫。固有免疫应答中，位于淋巴液、血液和***中的T细胞主要参与细胞免疫应答，B细胞主要参与体液免疫应答，它们既有各自独特的作用，又能相互配合，共同发挥免疫效应。正常机体的免疫系统对“非己”的抗原能产生免疫应答，对自身抗原则处于无应答或微弱应答状态，这种状态称为“免疫耐受”。这时候一定量的自身反应性T细胞和自身抗体普遍存在于外周免疫系统中，协助清除衰老变异的自身成分，对维持免疫系统的自身稳定具有重要的生理学意义，该过程称为自身免疫。

免疫耐受与多种临床疾病的发生、发展及转归密切相关。免疫系统丧失对自身抗原的生理性耐受是自身免疫性疾病发生的根本原因。临床实践中，如果免疫系统不攻击自身组织或器官，就可以不发生自身免疫性疾病；不攻击供体器官，就可以避免器官移植产生的排斥反应。目前来说，通过药物抑制免疫系统对自身抗原或移植抗原产生免疫应答是主要的治疗手段。

目前临床一线治疗自身免疫性疾病的药物，如环孢菌素、他克莫司(tacrolimus,FK506)、芬戈莫德等，和治疗器官移植排异反应的药物，如霉酚酸、环孢菌素、他克莫司和雷帕霉素(rapamycin)等，都是作用于T细胞而发挥免疫抑制作用。然而，这些药物均具有严重的副反应，例如环孢菌素的肾毒性发生率为50％～70％，肝损害发生率10％～50％(中国综合临床.2003,19,101-102)。霉酚酸能导致腹泻、胃肠功能失调、白细胞减少等(上海第二医科大学学报.2005,25,714–717)。雷帕霉素能导致难治性高脂血症及相关的脑血管意外(南方医科大学学报.2007,27,1924–1926)。同时，临床上还急需治疗风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的有效药物。因此，开发能够抑制T、B细胞增殖的药物，就能应用于器官移植手术和自身免疫性疾病，具有非常广阔的市场前景。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一类、六种从桦剥管孔菌(Piptoporus betulinus)的发酵产物中制备的降二萜化合物在制备具有免疫抑制活性的药物中的应用。

所述的六种降二萜化合物为管孔菌醇A-F，它们的化学结构式为：

进一步，所述具有免疫抑制活性的药物是以免疫抑制为目的的药物，例如器官移植后的排异反应、自身免疫疾病(系统性红斑狼疮等)。

所述的六种降二萜化合物为管孔菌醇A-F均具有抑制T、B淋巴细胞增殖的活性，可以作为免疫抑制先导化合物用于制备免疫抑制药物。

本所述的六种降二萜化合物为管孔菌醇A-F均溶解于二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲醇、吡啶、二甲亚砜等，但不溶于石油醚、水。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1、目前临床使用的免疫抑制药物药物主要是环肽类、大环内酯类和甾体类。本发明提供目前临床使用的免疫抑制药物骨架类型完全不同的二萜化合物。基于此类化合物进一步开发成的免疫抑制药物可完全避开现有上市药物专利，为市场提供更多选择。

2、本发明是首次揭示二萜化合物还具有免疫抑制活性，将来可使科学界将目光投入从二萜化合物中寻找具有免疫抑制活性的先导化合物。

3、本发明中的六种化合物的免疫抑制活性，其中一个比上市药物(***)还强，其他化合物也具有一定的活性，极具开发成上市临床使用药物的潜力；并且它们对T、B淋巴细胞增殖均不具有非特异性毒性。

4、本发明拟保护的管孔菌醇，可通过微生物发酵手段来获取。全部生产过程无化学污染，绿色环保。

5、本发明中的六种化合物具有能显著抑制由刀豆蛋白A刺激的T淋巴细胞和由细菌脂多糖刺激的B淋巴细胞增殖的活性，并且对T、B淋巴细胞均无毒性，具有作为制备新的免疫抑制类药物的用途。

附图说明

图1为管孔菌醇A-F对刀豆蛋白A刺激的T淋巴细胞增殖产生的抑制作用。

图2为管孔菌醇A-F对细菌脂多糖刺激的B淋巴细胞增殖产生的抑制作用。

具体实施方式

为使本申请的发明目的、发明内容呈现得更加清楚，下面申请人将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。

以下实施例中未注明具体条件者，均按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为常规市售产品。

以下实施例中的动物实验均已获得中南民族大学实验动物与生物医学伦理委员会批准(编号2019-SCUEC-AEC-021)。

本发明的应用所研究的六种化合物管孔菌醇A-F均来源于桦剥管孔菌(Piptoporus betulinus)的发酵产物。它们的结构式分别为：

这些化合物属于现有技术，见陈贺平、2017年中国科学院昆明植物研究所博士学位论文《褐盖韧革菌等四种高等真菌萜类成分研究》中第三章内容，具体的，本发明中研究的六种化合物与该博士学位论文中提取分离得到的化合物对应关系分别是：

管孔菌醇A对应化合物4；

管孔菌醇B对应化合物6；

管孔菌醇C对应化合物7；

管孔菌醇D对应化合物12；

管孔菌醇E对应化合物17；

管孔菌醇F对应化合物2。

生产菌株桦剥管孔菌(Piptoporus betulinus)已保存到中国科学院昆明植物研究所高等真菌化学研究组，地址为：云南省昆明市盘龙区蓝黑路132号，公众可从该单位获得该菌株。

本所述的六种降二萜化合物为管孔菌醇A-F均溶解于二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲醇、吡啶、二甲亚砜等溶剂，但不溶于石油醚、水。

应用试验例1

1、采用细胞活力测定法(MTT法)，对实施例中所得的管孔菌醇A-F进行T、B淋巴细胞非特异性毒性筛选。

2、试验原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)，而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在570nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，可用于细胞毒性分析。采用细胞活力测定法(MTT法)，检测化合物对小鼠脾脏淋巴细胞毒性。

3、本实施例的细胞活力测定法(MTT法)具体步骤为：脊椎法处死小鼠，无菌取其脾脏，磨碎制成单细胞悬液，红细胞裂解液去除红细胞，调节细胞浓度。将小鼠脾脏淋巴细胞悬液8×10⁵个/孔接种于96孔板，同时加入不同浓度管孔菌醇A-F，采用免疫抑制剂***作为阳性对照药物，另设相应的溶媒(DMSO)对照及培养液本底(RMPI 1640)对照(空白对照)，使每孔终体积为200μL。于37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时。结束培养前4小时加入MTT溶液，使MTT终浓度为5mg/mL。至培养结束，吸弃上清，每孔加入200μLDMSO溶解紫色结晶，于酶标仪570nm处测定OD值。计算出细胞存活率。

4、试验结果：管孔菌醇A-F在40μM浓度下，T、B淋巴细胞均存活率80％以上，说明管孔菌醇A-F对T、B淋巴细胞均无非特异性毒性。

应用试验例2

1、采用³H-TdR掺入法检测各化合物对小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖功能的影响。

2、试验原理：T、B淋巴细胞表面具有识别抗原和有丝***原受体，在特异性抗原刺激下相应淋巴细胞可发生增殖与分化。刀豆蛋白A(ConA)和细菌脂多糖(LPS)是两种有丝***原，可分别刺激T、B淋巴细胞发生增殖和分化，这一过程与体内淋巴细胞的活化过程相似。因此，丝裂原诱导的淋巴细胞增殖常被用作评价淋巴细胞功能的指标。³H-胸腺嘧啶脱氧核苷(³H-TdR)掺入法是指在细胞培养基中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷，则³H-TdR被作为合成DNA的原料被摄入细胞，掺入到新合成的DNA中。该方法可以反映细胞DNA的合成情况，进而检测细胞有无增殖。根据同位素掺入细胞的量可推测淋巴细胞对刺激物的应答水平。掺入的同位素³H，经液体闪烁测量法测出，计算³H每分脉冲数(cpm)，可反映淋巴细胞增殖的程度。

3、配制待测样品：将管孔菌醇A-F分别溶解于DMSO配制成1mM的储备液。

4、小鼠脾脏淋巴细胞悬液4×10⁵个/孔接种于96孔板，加入ConA(终浓度5μg/mL)或LPS(终浓度10μg/mL)代表细胞增殖的情况，计算出细胞增殖抑制率。淋巴细胞增殖实验：小鼠小鼠脾脏淋巴细胞悬液4×10⁵个/孔接种于96孔板，加入ConA(终浓度5μg/mL)或LPS(终浓度10μg/mL)，待测化合物的储备液，使药物测试的浓度为0.01～100μM范围内的5种浓度(0.1，1.0，10.0，40.0，80.0μM)。并设相应的无ConA、LPS对照孔以及无药物对照孔。在37摄氏度，5％(v/v)CO₂培养箱中培养48小时。培养结束前8小时，每孔加入25μL ³H-TdR。继续培养至实验结束。将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta记数仪读取掺入细胞DNA的³H-TdR量，以cpm值代表细胞增殖的情况，计算出细胞增殖抑制率。根据剂量-效应曲线，计算出半数抑制浓度(IC₅₀)。

5、试验数据计算方法：

6、试验结果如图1、图2所示，具体为管孔菌醇A抑制T淋巴细胞增殖的IC₅₀＝11.1μM，抑制B淋巴细胞增殖的IC₅₀＝35.1μM；管孔菌醇B抑制T淋巴细胞增殖的IC₅₀＝21.1μM，抑制B淋巴细胞增殖的IC₅₀＝51.8μM；管孔菌醇C抑制T淋巴细胞增殖的IC₅₀＝14.9μM，抑制B淋巴细胞增殖的IC₅₀＝49.4μM；管孔菌醇D抑制T淋巴细胞增殖的IC₅₀＝1.0μM，抑制B淋巴细胞增殖的IC₅₀＝16.1μM；管孔菌醇E抑制T淋巴细胞增殖的IC₅₀＝4.0μM，抑制B淋巴细胞增殖的IC₅₀＝46.0μM；管孔菌醇F抑制T淋巴细胞增殖的IC₅₀＝13.6μM，抑制B淋巴细胞增殖的IC₅₀＝22.4μM。

7、阳性对照药***抑制T淋巴细胞增殖的IC₅₀＝1.6μM，抑制B淋巴细胞增殖的IC₅₀＝0.8μM。

8、承上所述，管孔菌醇A-F对刀豆蛋白A刺激的T淋巴细胞增殖和细菌脂多糖刺激的B淋巴细胞增殖均具有一定的抑制作用。其中管孔菌醇D和管孔菌醇E对T淋巴细胞增殖具有显著的抑制活性，管孔菌醇D的活性比阳性对照药***还要显著。

9、综上所述，本发明提供的从一株桦剥管孔菌(Piptoporus betulinus)的发酵提取物中分离得到的管孔菌醇A-F具有不同程度的抑制T、B淋巴细胞增殖的活性，可作为免疫抑制药物先导化合物候选分子用于制备免疫抑制药物。

以上所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详述并非旨在限制本发明要求保护的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。