阅读说明：本技术 一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法 (Method for measuring and calculating semi-effective concentration of environmental pollutant ecotoxicity effect ) 是由 王长友 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法,基于单物种的毒性效应实验结果,利用种群间的生态关系构建群落模型,将处于不同营养级的、种群水平上的、多个反应终点结合起来,以一定污染物浓度下简化浮游群落稳态生物量数组(P*,Q*,R*)偏离原稳态生物量数组(P<Sub>0</Sub>,Q<Sub>0</Sub>,R<Sub>0</Sub>)的程度作为判据,计算污染物生态毒性效应半效浓度。本发明考虑了污染物毒性效应的生态相关性,从而提高了测算的准确性、科学性；本发明还能够充分利用现有的大量单物种毒性效应实验数据,节约费用。(The invention discloses a method for measuring and calculating the half-effect concentration of the ecological toxic effect of environmental pollutants, which is based on the experimental result of the toxic effect of a single species, utilizes the ecological relationship among populations to construct a community model, combines a plurality of reaction end points on the population level and at different nutrition levels, and simplifies the deviation of a floating community steady-state biomass array (P, Q, R) from an original steady-state biomass array (P, Q, R) under a certain pollutant concentration 0 ,Q 0 ,R 0 ) The degree of the pollutant is used as a criterion to calculate the ecological toxicity effect half-effect concentration of the pollutant. The invention considers the ecological relevance of the toxic effect of the pollutant, thereby improving the accuracy and the scientificity of the measurement and calculation; the invention can also make full use of the existing large number of sheetsSpecies toxicity effect experiment data and cost saving.)

一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法

技术领域

本发明涉及环境领域，尤其涉及一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法。

背景技术

科学制定水质标准是水生态系统保护和环境管理的基础，水质基准的制定又是水质标准制定的科学依据。水质基准制定的科学基础是具有较完备的土著水生生物的污染物生态毒理学数据和科学判断污染物毒性强度的指标。敏感性高、重复稳定性好的半效浓度是衡量污染物毒性强度的重要指标。根据毒理学数据，由生态学意义显著的反应终点确定半效浓度，是科学的比较污染物生态毒性效应强弱的基本方法。污染物生态毒性效应不仅与水环境中污染物的含量及化学形态有关，受各种环境因素直接或间接的影响，而且与生态毒性效应研究对象有关，随生态区系的变化而变化。国外有影响的机构组织如美国环保局（USEPA）、欧盟联合研究中心（EUC）及世界经济与合作组织（OECD）等，对于污染物生态毒性效应半效浓度所提出的各种计算方法都有其缺陷，还有待进一步完善，事实上，国际众多科研机构也在研究更为完善的污染物生态毒性效应半效浓度测算方法。USEPA、EUC 及OECD等机构组织发布的“技术指南”在计算水质基准时，主要采用了个体水平反应终点的毒性数据。尽管反应终点水平越微观，实验结果的因果关系越强，但生态学意义越不显著，个体水平及以下的反应终点难以满足推导水质基准的需要。既使同一生态受体的多个反应终点，对污染物不利效应的表征能力往往不同。目前通常的做法都是选择最敏感的反应终点做为确定半效浓度的反应终点。然而一个个体水平上最敏感的反应终点所确定的毒性效应并不必然反映种群毒性效应，这是因为种群效应并不必然由最敏感的生命周期特征决定。同样，一个种群水平上最敏感的反应终点所确定的毒性效应并不必然反映群落或生态系统毒性效应，这是因为生态系统中竞争、摄食等生态关系影响污染物的毒性效应。尽管生态受体所处的生命组建层次越高，相应的反应终点综合反映生态系统毒性效应的能力越强，然而由于技术条件限制，目前只有种群水平上的反应终点可以定量测量。因此目前污染物生态毒性效应半效浓度研究多限于单物种毒性实验，缺乏考虑生态系种群间的生态相关性，致使研究结果的真实性、可靠性降低。

目前还没有应用单物种种群水平上的毒性效应数据科学测算反映生态关系的水环境污染物生态毒性效应半效浓度的相关报道。然而这样的测算方法能够进一步提高生态毒性效应半效浓度的生态相关性，有助于完善污染物生态毒性效应强度的比较方法，有助于夯实水质标准制定的科学基础，有助于提高污染物排放标准及排放控制优先次序制定的科学性，促进经济和生态环境和谐发展。因此，在水环境综合治理体系中，有必要引入新的、更科学的反映生态关系的水环境污染物生态毒性效应半效浓度分析技术，建立一套更为科学的污染物生态毒性效应半效浓度测算方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对背景技术中所涉及到的缺陷，提供一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法。

本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：

一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法，基于单物种的毒性效应实验结果，利用种群间的生态关系构建群落模型，将处于不同营养级的、种群水平上的、多个反应终点结合起来，以一定污染物浓度下简化浮游群落稳态生物量数组(P*,Q*,R*)偏离原稳态生物量数组(P₀,Q₀,R₀)的程度作为判据，计算污染物生态毒性效应半效浓度；具体包括以下步骤：

步骤1），进行单藻培养体系毒性效应实验，计算不同污染物浓度下微藻种群的内禀增长率、环境容纳量；

步骤2），进行浮游动物种群毒性效应实验，计算不同污染物浓度下浮游动物的存活率、繁殖速率、内禀增长率、世代时间、以及不同污染物浓度下浮游动物种群的雌体抱卵率和种群增殖率，并以此为反应终点分析污染物对浮游生物种群的毒性效应；

步骤3），基于浮游生物种群毒性效应实验结果，计算各反应终点下的EC₁₀、EC₅₀、EC₉₀ 及其95%置信区间，分析不同反应终点下生态毒性效应的敏感性、可靠性和稳定性，确定测算生态毒性效应半效浓度即EC₅₀的反应终点，构建种群毒性效应模型；

步骤4），进行双藻竞争实验，计算微藻的竞争抑制参数；

步骤5），进行浮游动物摄食实验，计算浮游动物对于微藻的滤水率和摄食率；

步骤6），进行浮游动物选食行为实验，计算浮游动物对于微藻的摄食选择性系数；

步骤7），构建具有竞争-摄食效应的简化浮游群落模型；

步骤8），进行浮游生物群落—毒性效应耦合模型的构建，计算稳态生物量数组(P*,Q*,R*)，并以此为反应终点进行半效浓度的测算。

作为本发明一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法进一步的优化方案，所述步骤1）的具体步骤如下：

步骤1.1），以实验室繁育的微藻为对象，过滤海水添加适量营养盐作为培养液，置于培养瓶中，按照预设的培养温度、盐度、光照强度、微造初始密度、光周期在光照培养箱中培养；

步骤1.2），根据预设的污染物浓度间隔，每组设置3 个平行样；每天在显微镜下进行种类鉴定和计数，并在实验对象种群出现衰亡时结束实验；

步骤1.3），利用Logistic 生长模型拟合获得微藻内禀增长率和环境容纳量，分析污染物对微藻种群的毒性效应。

作为本发明一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法进一步的优化方案，所述步骤2）的具体步骤如下：

步骤2.1），进行浮游动物单体培养：

步骤2.1.1），选择健康活泼的浮游动物成熟雌体，每个盛有培养液的产卵瓶放1 只；

步骤2.1.2），根据预设的污染物的浓度间隔，每组设置10个平行样，根据预设的培养温度在恒温下培养；每天检查计数产卵个数、孵化出的幼体数和母体存活情况，并移去幼体，同时按约1/2 的比例换培养液水，并添加饵料藻；实验到雌体死亡为止；

步骤2.1.3），计算浮游动物存活率、繁殖速率、内禀增长率、世代时间，分析污染物对浮游动物种群的毒性效应；

步骤2.2），进行浮游动物群体累计培养：

步骤2.2.1），定量移取活泼健壮、相同条件下预培养的浮游动物若干只置于盛有培养液的烧杯中；

步骤2.2.2），根据预设的污染物的浓度间隔，每组设3 个平行样，在恒温下培养，培养时间到种群增长达到高峰并开始下降为止；在实验期间每隔24h 投喂饵料一次；每天计数浮游动物总个体数、抱卵个体数、脱落的夏卵数量；

步骤2.2.3），计算浮游动物雌体抱卵率和种群增殖率，分析污染物对浮游动物种群的毒性效应。

作为本发明一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法进一步的优化方案，所述步骤4）的具体步骤如下：

步骤4.1），将实验微藻两两混合，根据培养液中藻细胞密度和单个藻细胞生物体积的大小设定微藻的初始接种生物量，使共培养微藻生物量比为1:1；

步骤4.2），利用Lotka-Volterra 竞争模型拟合获得竞争抑制参数。

作为本发明一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法进一步的优化方案，所述步骤5）的具体步骤如下：

步骤5.1），将预培养的浮游动物分别在相应要摄食的微藻中驯化培养3-5d，再饥饿24h；

步骤5.2），在烧杯中进行实验，微藻密度为预设的最适投喂密度阈值，每个烧杯加入若干浮游动物，每实验组设3 个平行样，另设不加浮游动物的对照组；用黑布将实验烧杯罩住在黑暗条件下培养24h；

步骤5.3），采用饵料浓度差法，24h 后计数，鲁哥氏液固定藻液，在显微镜下血球计数板计数并计算藻细胞密度；

步骤5.4），计算浮游动物对于微藻的滤水率和摄食率。

作为本发明一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法进一步的优化方案，所述步骤6）的具体步骤如下：

步骤6.1）将微藻两两混合，投喂选取的浮游动物，根据单个藻细胞生物体积的大小确定混合比例，使两种微藻生物量比为1:1，每个烧杯加入若干浮游动物，每实验组设3 个平行样，另设不加浮游动物的对照组；用黑布将实验烧杯罩住在黑暗条件下培养24h；

步骤6.2），采用饵料浓度差法，计算浮游动物对于微藻的摄食率；

步骤6.3），根据浮游动物对不同微藻的摄食程度确定其摄食选择性系数。

作为本发明一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法进一步的优化方案，所述步骤8）的具体步骤如下：

步骤8.1），基于反应终点的分析结果，以生态学意义显著的种群毒性效应反应终点及毒性效应半效浓度为模型参数，将种群毒性效应模型嵌入到浮游生物群落模型当中，构建浮游生物群落—毒性效应耦合模型，从而把处于不同营养级的、种群水平上的、多个反应终点结合起来计算生物群落毒性效应；

步骤8.2），运用耦合模型及Bootstrap 抽样数理统计方法，计算浮游生物群落稳态生物量数组(P*,Q*,R*)，并以稳态生物量数组(P*,Q*,R*)为反应终点测算污染物生态毒性效应半效浓度，并进行不确定性分析。

作为本发明一种环境污染物生态毒性效应半效浓度测算方法进一步的优化方案，所述步骤8）污染物生态毒性效应半效浓度的计算以所述生物群落模型的稳态生物量数组偏移50%为判断依据；所述污染物生态毒性效应半效浓度为简化生物群落达到稳态条件下、任意种群生物量x(x=P, Q, R)偏离原稳态生物量数组(P₀,Q₀,R₀)对应种群生物量的50%时的最小污染物浓度。

本发明采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：

本发明通过生物种群间的生态关系，构建生物群落-毒性效应耦合模型，应用单物种种群毒性效应数据测算污染物生态毒性效应半效浓度，考虑了污染物毒性效应的生态相关性，从而提高了测算的准确性、科学性；本发明能够充分利用现有的大量单物种毒性效应实验数据，节约费用。此外，本发明涉及的生物毒性实验都是常规实验，针对监测生物设计的监测生物群落模型可应用于不同污染物，便于在广大水质环境监测部门推广使用。

附图说明

图1是污染物生态毒性阈值浓度测算技术路线示意图；

图2是简化实验生态系统示意图；

图3是青岛大扁藻、球等鞭金、褶皱臂尾轮虫组成的生物群落稳态生物量数组随污染物铜浓度的变化图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明：

本发明可以以许多不同的形式实现，而不应当认为限于这里所述的实施例。相反，提供这些实施例以便使本公开透彻且完整，并且将向本领域技术人员充分表达本发明的范围。在附图中，为了清楚起见放大了组件。

本实施例以浮游生物种群毒性效应实验为基础分析反应终点的敏感性、可靠性和稳定性，并获取模型参数，进而构建浮游生物群落-毒性效应耦合模型，计算污染物半效浓度。方法的科学性可以通过简化浮游生物群落实验结果分析耦合模型的拟合优度并验证半效浓度计算结果来评估，如图1。简化实验生态系统如图2。

1、生态毒性效应实验及参数获取：

（1）单藻培养体系毒性效应实验

采用实验室繁育获得青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)和球等鞭金藻(Isochrysis galbana)，过滤海水添加适量营养盐作为培养液，置于1000mL锥形瓶中，在光照培养箱中培养。培养温度15℃（或23℃，分别与后面实验中两种浮游动物的适宜培养温度相配合），盐度32，pH 8.0，光照强度60μmol m^-2s^-1，初始密度均为1×10⁴cells mL^-1，光周期12L:12D。重金属铜污染物设6个浓度梯度，包括对照样。每组设置3个平行样。每隔24h取5mL培养液，加入固定液，在显微镜下进行种类鉴定和计数。实验对象种群出现衰亡时结束实验。根据实验结果利用Logistic生长模型拟合获得微藻内禀增长率、环境容纳量等参数。

（2）双藻竞争实验

将青岛大扁藻、球等鞭金藻混合，根据培养液中藻细胞密度和单个藻细胞生物体积的大小设定微藻的初始接种生物量，使共培养微藻生物量比为1:1，其他培养条件及检测指标也与单藻毒性效应实验相同。根据实验结果利用Lotka-Volterra竞争模型拟合获得竞争抑制参数。

（3）浮游动物种群毒性效应实验

单体培养 选择健康活泼的褶皱臂尾轮虫成熟雌体，分别放进15mL的6孔培养板。污染物的浓度设6个浓度梯度，包括对照样，每组设置10个平行样。实验在23℃下恒温培养，每天检查计数产卵个数、孵化出的幼体数和母体存活情况，移去幼体，同时按约1/2的比例换海水，并添加饵料藻，实验到雌体死亡为止。根据实验结果可计算浮游动物存活率，繁殖速率、内禀增长率、世代时间等。

群体累计培养 定量移取活泼健壮、相同条件下预培养的褶皱臂尾轮虫（初始密度为10ind/mL）置于盛有300mL培养液的烧杯中。污染物的浓度设6个浓度梯度，包括对照样，每组设3个平行样。实验在23℃下培养。培养时间到种群增长达到高峰并开始下降为止。在实验期间每隔24h投喂饵料一次。每天计数浮游动物总个体数、抱卵个体数、脱落的夏卵数量(计数后再放回原培养物中)，连续重复三次，求出平均数。根据实验结果可计算浮游动物雌体抱卵率和种群增殖率等。

（4）浮游动物摄食、选食行为实验

分别将青岛大扁藻、球等鞭金藻单独喂养褶皱臂尾轮虫。浮游动物由实验室繁育获得，实验前先将预培养的浮游动物分别在相应要摄食的微藻中驯化培养3-5d，再饥饿24h。实验在150mL烧杯中进行，实验藻液体积为50mL，微藻密度根据预实验设置为最适投喂密度， 温度为23℃，每个烧杯加入10ind/mL褶皱臂尾轮虫，每实验组设3 个平行样，另设不加浮游动物的对照组。用黑布将实验烧杯罩住在黑暗条件下培养24h。采用饵料浓度差法，24h 后计数，鲁哥氏液固定藻液，在显微镜下血球计数板计数并计算藻细胞密度，根据实验结果可计算中华哲水蚤（或褶皱臂尾轮虫）对于微藻的滤水率和摄食率。

将青岛大扁藻、球等鞭金藻混合，投喂褶皱臂尾轮虫，根据单个藻细胞生物体积的大小确定混合比例，使两种微藻生物量比为1:1，其他实验条件步骤同上。采用饵料浓度差法，计算褶皱臂尾轮虫对于微藻的摄食率，根据褶皱臂尾轮虫对不同微藻的摄食程度计算其摄食选择性系数。

（5）简化生物群落毒性效应实验

将青岛大扁藻、球等鞭金藻混合，使共培养微藻生物量比为1:1，取褶皱臂尾轮虫接种到微藻混合液中，并添加污染物。初始接种的微藻生物量、浮游动物生物量及添加的污染物浓度间隔同上。浮游动物选取活泼健壮、相同条件下预培养的个体，实验前先分别在相应的微藻混合液中驯化培养3-5d，再饥饿24h，使之排空肠道。实验在10L玻璃容器中进行，23℃下培养。每实验组设3 个平行样，另设不加污染物的对照组。其他培养条件与单藻毒性效应实验相同。每天观察计数浮游生物种类和数量变化，计数方法同上述相应实验。根据实验群落中浮游生物种群数量稳定持续时间情况决定实验结束时间。

2、反应终点分析及种群毒性效应模型构建：

根据种群毒性效应实验测定结果，应用Log-logistic模型计算不同反应终点（微藻种群的内禀增长率、环境容纳量等参数，浮游动物种群的存活率、繁殖速率、内禀增长率、世代时间、雌体抱卵率、种群增殖率、滤水率和摄食率等参数）下EC₁₀、EC₅₀、EC₉₀ 及其95%置信区间，分析不同反应终点下种群毒性效应的敏感性、可靠性和稳定性。

结论：通过反应终点分析，发现微藻种群的内禀增长率、环境容纳量等参数，浮游动物种群的存活率、内禀增长率、滤水率和摄食率等参数具有较高的敏感性、可靠性和稳定性，可以作为种群水平上的反应终点，用以构建测算生态毒性效应半效浓度的种群毒性效应模型。

3、生物群落-毒性效应耦合模型构建：

根据双藻竞争实验和浮游动物摄食、选食行为实验测定的参数，基于Logistic生长模型和Lotka-Voterra捕食模型建立简化浮游生物群落模型，其中微藻生长考虑密度制约，浮游动物生长不考虑密度制约。污染物浓度对简化浮游生物群落模型系数的影响通过若干不同反应终点的种群毒性效应函数来构造，这样便将种群毒性效应模型嵌入到浮游生物群落模型当中，构建成浮游生物群落—毒性效应耦合模型。

结果分析：利用竞争-摄食等生态关系建立起来的简化浮游生物群落模型，通过嵌入种群毒性效应模型，能够反映污染物对浮游生物群落的生态毒性效应。

4、半效浓度测算：

在上述实验条件下，简化浮游生物群落模型存在唯一稳态生物量数组(P₀,Q₀,R₀)。在一定的污染物浓度条件下，简化浮游生物群落稳态生物量数组(P*,Q*,R*)发生变化，偏离原来稳态生物量数组(P₀,Q₀,R₀)，这里我们将简化生物群落达到稳态条件下，任意种群生物量x(x=P,Q ,R)偏离原稳态生物量数组(P₀,Q₀,R₀)对应种群生物量的50%时的最小污染物浓度作为生物群落生态毒性效应半效浓度，并应用贝叶斯转换和蒙特-卡罗方法进行半效浓度的不确定性分析。

结论：尽管每一个反应终点都对应一个半效浓度，当嵌入到简化生物群落模型以后，由于耦合模型对参数变化的敏感性不一样，某反应终点确定的最小半效浓度不一定就是简化生物群落模型稳态生物量数组偏移50%的最小浓度，稳态生物量数组偏移程度通过计算一定污染物浓度条件下任意种群生物量与对照实验的差异来判断。重金属铜的生态毒性效应半效浓度测算结果为107.7±6.7μg/L。

5、半效浓度测算结果验证：

将简化生物群落实验中各污染物浓度下浮游生物种群生物量测定结果 (P_t, Q_t, R_t)与模型计算的相应结果 (P _t , Q _t , R _t ) 进行比对，计算得到模型拟合优度R ²>0.9，检验模型计算的稳态生物量数组 (P*,Q*,R*)与实验测定的稳态生物量数组 (P*,Q*,R*)没有显著性差异，从而验证了模型计算结果的可靠性。

应用本发明的模型，如图3所示，基于青岛大扁藻、球等鞭金、褶皱臂尾轮虫等单物种种群毒性效应实验数据，以简化浮游生物群落稳态生物量数组的偏离为判据测算的污染物生态毒性效应半效浓度，与由青岛大扁藻、球等鞭金藻、褶皱臂尾轮虫构成的简化生物群落的测定结果基本一致。这一结果进一步验证了由单物种毒性效应数据通过生物群落—毒性效应耦合模型测算污染物生态毒性效应半效浓度的可操作性及可靠性，同时也表明了本发明方法在水环境污染物生态毒性效应半效浓度测算中具有一定的应用价值。

本技术领域技术人员可以理解的是，除非另外定义，这里使用的所有术语（包括技术术语和科学术语）具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。