阅读说明：本技术 一种环状dna的制备方法 (Preparation method of circular DNA ) 是由 高亚平 田晖 何筠 邓素华 伊戈尔·伊万诺夫 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本公开提供了一种环状DNA的制备方法,所述环状DNA的制备方法的具体步骤为：(1)首先合成需要成环的单链DNA分子,然后在合成的单链DNA分子的5’端做磷酸化修饰；(2)然后设计合成引导RNA分子,所述引导RNA分子的核苷酸序列与合成的单链DNA分子两端的核苷酸互补配对；(3)将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行退火,获得退火产物；(4)利用连接酶对得到的退火产物进行连接反应,得到连接反应产物；(5)利用核酸外切酶消化连接产物中未成环的线性核苷酸；(6)最后回收合成的单链环状DNA分子。所述制备方法简单易操作,且在方法中所使用的材料成本低,降低了制备环状DNA的成本。(The present disclosure provides a method for preparing circular DNA, which comprises the following specific steps: (1) firstly, synthesizing a single-stranded DNA molecule needing to be cyclized, and then carrying out phosphorylation modification on the 5' end of the synthesized single-stranded DNA molecule; (2) then designing and synthesizing a guide RNA molecule, wherein the nucleotide sequence of the guide RNA molecule is complementarily paired with the nucleotides at two ends of the synthesized single-stranded DNA molecule; (3) annealing the synthesized single-stranded DNA molecules and the guide RNA molecules to obtain an annealed product; (4) performing a ligation reaction on the obtained annealing product by using ligase to obtain a ligation reaction product; (5) digesting the non-circularized linear nucleotides in the ligation product by using exonuclease; (6) finally, the synthesized single-stranded circular DNA molecule is recovered. The preparation method is simple and easy to operate, the cost of the materials used in the method is low, and the cost for preparing the circular DNA is reduced.)

一种环状DNA的制备方法

技术领域

本公开涉及核苷酸技术领域，具体涉及一种环状DNA的制备方法。

背景技术

滚环复制(环-介导的等温扩增，Loop-mediated isothermal amplification-LAMP)是具有链置换能力的等温扩增酶利用环状DNA分子做模板，进行核酸扩增的方法。该方法与PCR(聚合酶链式反应)都能对微量的核酸模板进行序列特异的扩增，不同之处在于，滚环复制过程能够在恒定温度下完成扩增反应，因此不需要温控精确的PCR仪，是一种既简便又经济的核酸扩增方法，且不同序列的单链环状DNA分子通过滚环复制，能够生成不同长度的串联重复序列。天然的基因和蛋白中存在大量的随机重复序列，这些重复序列组成特异的模序，能够急剧增加候选基因的生物大分子的生理特异性和活性。这种模序广泛分布于启动子/增强子等核酸序列，促进反式作用因子对靶序列的识别，产生叠加和/或者协同效用。通过构建大的随机重复序列库，是研究体内或者体外研究结构-功能之间的关系的重要策略之一。通过制备单链环状DNA分子进行滚环复制，可以制备不同长度和重复次数的随机重复序列。

目前常用的单链环状DNA模板主要来源是病毒的单链环状DNA M13mp18(7249bp)以及酶连反应产生的的单链环状DNA分子(sscDNA,single strand circular DNA)，sscDNA分子长度一般为34-120bp，但是使用单链环状病毒DNA M13mp18，这种病毒培养的过程慢，成本高，从而导致M13mp18的价格较高，且单链M13mp18 DNA分子量(Molecular weight)大，若底物浓度过高，会抑制滚环复制反应的进行。在现有的酶连反应产生单链环状DNA分子的制备方法中，多倚赖DNA(guide DNA)做引导分子，完成目标序列的连接，这种方法会导致终产物中残留微量引导DNA分子，使得后续DNA聚合酶利用其作引物进行滚环复制，从而对结果分析造成干扰。

发明内容

本公开的目的是提供一种环状DNA的制备方法，以达到降低成本的目的。

为实现上述目的，技术方案如下：

一种环状DNA的制备方法，所述环状DNA的制备方法的具体步骤为：

(1)首先合成需要成环的单链DNA分子，然后在合成的单链DNA分子的5’端做磷酸化修饰；

(2)然后设计合成引导RNA分子，所述引导RNA分子的核苷酸序列与合成的单链DNA分子两端的核苷酸互补配对；

(3)将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行退火，获得退火产物；

(4)利用连接酶对得到的退火产物进行连接反应，得到连接反应产物；

(5)利用核酸外切酶消化连接产物中未成环的线性核苷酸；

(6)最后回收合成的单链环状DNA分子。

所述步骤(3)中退火的反应条件为：首先85℃反应5min，然后25℃反应3h。

所述步骤(3)中退火的反应体系为合成的单链DNA分子：引导RNA分子：退火缓冲液：去RNA酶水的体积比为1：2：1：7。

所述退火缓冲液包括：100mM Tris-HCl、10mM EDTA、和1M NaCl，所述Tris-HCl的PH值为7.5。

所述步骤(4)连接反应的条件为：首先16℃反应16h，然后65℃反应20min。

所述步骤(4)中连接反应的体系为连接缓冲液：退火产物：连接酶：H₂O的体积比为3：1：2.5：30。

所述连接酶为SplintR连接酶或T4 DNA连接酶。

所述步骤(5)中核酸外切酶为Exonuclease I外切酶和T7 Exonuclease外切酶的混合物。

核酸外切酶消化的反应体系为连接产物：Exonuclease I外切酶：T7Exonuclease外切酶的体积比为7：1：2。

所述步骤(5)中核酸外切酶消化的条件为：25℃反应16h。

本公开的有益效果是：提供了一种环状DNA的制备方法，所述制备方法简单易操作，且在方法中不需要实用单链环状病毒DNA M13mp18，其余材料成本低，从而降低了制备环状DNA的成本。同时本公开所述的环状DNA的制备方法突破了模板序列的限制，而且在制备过程中无需添加外源DNA，而是添加了根据需要成环的单链DNA分子末端所合成的RNA分子，减少了干扰，且还利用了核酸外切酶消化了未成环的线性核苷酸，进一步的减少了副产物的产生，大大增加了单链环状DNA的产率，而且本公开所述的环状DNA的制备方法所制备的单链环状DNA还可用于检测DNA聚合酶是否具备链置换能力。

附图说明

图1为实施例1中退火产物、连接产物和核酸外切酶消化产物的凝胶电泳图。

图2为实施例2滚环复制产物的凝胶电泳图。

图3为实施例3不同的延伸反应时间下产物的凝胶电泳图。

图4为实施例4DNA聚合酶链置换能力检测图。

具体实施方式

以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。

实施例1

一种环状DNA的制备方法，具体操作步骤为：

(1)首先合成需要成环的单链DNA分子，然后在合成的单链DNA分子的5’端做磷酸化修饰，其中单链DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：5’-pATTGGTCTACATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCCTACGGATTGC；

(2)然后设计合成引导RNA分子，所述引导RNA分子的核苷酸序列与合成的单链DNA分子的两端互补配对，其中引导RNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5’-UAGACCAAUGCAAUCCGUA-3’；

(3)将合成的单链DNA分子和引导RNA分子进行退火，获得退火产物，其中退火反应的体系如表1所示，

表1退火反应体系

试剂	体系
		DNA(100uM)	1uL
RNA(100uM)	2ul
		10×buffer	1uL
Rnase-free H<sub>2</sub>O	加至总体积10ul

其中10x退火缓冲液包括：100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM EDTA和1M NaCl，退火反应的条件为：首先85℃反应5min，然后25℃反应3h，反应结束后，进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1A泳道1所示；

(4)利用SplintR连接酶对得到的退火产物进行连接反应，得到连接反应产物，其中连接反应的体系如表2所示，

表2连接反应体系

试剂	体积
		10xSplintR连接酶缓冲液	3
退火产物(10μM)	1
		Ligase(10.5μM)	2.5
H<sub>2</sub>O	30uL

其中连接反应的条件为：16℃，16h；65℃，20min终止反应，反应结束后，进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1A泳道2所示；

(5)利用核酸外切酶消化连接产物中未成环的线性核苷酸，其中核酸外切酶消化的反应体系如表3所示，

表3核酸外切酶消化的反应体系

试剂	体积
		连接反应产物	7uL
Exonuclease I	1uL
		T7 gene 6exonuclease	2ul

其中反应条件为：25℃反应16h，反应结束后，进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，以检测目标产物以及线形分子是否消化完全，结果如图1B所示，可以看出线性分子已被消化完全；

(6)最后利用NEB Monarch^TMPCR&DNA Cleanup Kit回收试剂盒回收合成的单链环状DNA分子。

实施例2

利用实施例1所制备的单链环状DNA分子(sscDNA)进行滚环复制实验，其具体操作步骤为：首先设计引物序列，其引物DNA序列为SEQ ID NO.3：5’-aTAGACCAAT GCAATCCGTAc-3’；然后进行退火反应，最后选用Phi29 DNA聚合酶进行延伸反应。

其中退火反应的体系如表4所示：

表4滚环复制退火反应体系

试剂	体系
		sscDNA(2.5uM)	1uL
引物DNA(2.5uM)	2ul
		10×buffer	1uL
Rnase-free H<sub>2</sub>O	加至总体积10ul

其中10x退火缓冲液包括：100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM EDTA和1M NaCl，退火反应条件为：85℃，5min；25℃，3h。

其中利用Phi29 DNA聚合酶(Phi29 DNAP)进行延伸反应的体系，然后设置对照组，体系如表5所示：

表5滚环复制延伸反应的体系

其中Phi29DNA聚合酶，购自NEB，货号为M0269S；延伸反应条件是30℃，30min。

反应结束后，采用碱性琼脂糖凝胶电泳检测延伸产物，其中，碱性琼脂糖凝胶电泳条件为3V/CM，3h。碱性琼脂糖凝胶电泳的缓冲液为：10×碱性琼脂糖电泳缓冲液或6×碱性凝胶载样缓冲液，其中10×碱性琼脂糖电泳缓冲液包括：500mM NaOH及10mM EDTA；6×碱性凝胶载样缓冲液包括：300mM NaOH，6mM EDTA，18％(m/V)Ficoll-400(Pharmacia公司)，0.15％(m/V)溴甲酚绿及0.25％(m/V)二甲苯氰。电泳结束后，将琼脂糖胶浸泡在SYBR Gold染液中，缓慢水平震荡约20min；然后利用Azure Biosystems成像仪检测。结果如图2所示，对照组(泳道1)没有延伸产物，而实验组(泳道2)生成大于48.5kbp的延伸产物，证明实施例1中制备所得DNA为环形DNA。

实施例3

利用实施例1中制备的单链环状DNA分子做模板，生成不同大小的串联重读序列，按照实施例2的滚环复制的方法设定不同的延伸反应时间(0、5、10、20、30min)，可以生成不同长度和浓度的串联重复序列，其中退火反应的体系为实施例2表1所示，退火反应的条件为：85℃，5min；25℃，3h；其中延伸反应的体系为实施例2中表5所示的实验组体系，结果如图3所示，其中2-6泳道中反应时间分别为0、5、10、20、30min，可以看出延伸产物的长度和浓度，均随着延伸时间的延长不断增加。

实施例4

利用实施例1中制备的单链环状DNA分子做模板，通过实施例2中的滚环复制方法，根据DNA聚合酶的聚合能力，可以检测DNA聚合酶是否具有链置换能力，其中退火反应的体系为实施例2表1所示，退火反应的条件为：85℃，5min；25℃，3h；其中延伸反应体系如表6：

表6检测DNA聚合酶链置换能力的延伸反应体系

其中Phi29DNA聚合酶，购自NEB，货号为M0269S；延伸反应条件是30℃，30min。

将上述反应体系所产生的产物进行凝胶电泳，结果如图4所示，其中图中泳道1为不添加DNA聚合酶的空白对照组，泳道2为Phi29 DNA聚合酶延伸产物，泳道3为大肠杆菌DNAPol I，Large(Klenow)fragment，根据图4可以看出具有链置换能力的DNA聚合酶能够利用环形DNA分子进行滚环复制，生成大片段单链DNA产物；而不具有链置换能力的DNA聚合酶，不能生成相应的产物，因此利用单链环状DNA分子做模板，通过DNA聚合酶的聚合能力这种方法，可以用来迅速、简便鉴定未知DNA聚合酶是否具有链置换能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳清华大学研究院；安序源生物科技(深圳)有限公司

<120> 一种环状DNA的制备方法

<130> 2019.10.12

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> RNA

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uagaccaaug caauccgua 19

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