阅读说明：本技术 一种在多重pcr体系内加入内参定量核酸拷贝数的方法 (Method for adding internal reference quantity of nucleic acid copy number in multiplex PCR system ) 是由 浦浩 黄文潘 张亚楠 李阳 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种在多重PCR体系内加入内参定量核酸拷贝数的方法,属于核酸分子生物学检测技术领域；所述方法,包括以下步骤：1)构建内参和目标基因扩增效率系数训练集,获得内参与目标基因扩增系数之间的关系；2)在目标基因的多重PCR体系中添加确定拷贝数的内参以及扩增内参的引物后,进行两轮多重PCR扩增后获得测序文库；3)对所述测序文库进行测序,获得测序数据；4)分析所述测序数据获得内参和目标基因的reads数,利用步骤1)中获得的内参与目标基因扩增效率系数之间的关系,计算目标基因的拷贝数。本发明所述方法能够快速的定量样品中特定核酸基因的拷贝数,准确度高。(The invention provides a method for adding internal reference quantity of nucleic acid copy number in a multiplex PCR system, belonging to the technical field of nucleic acid molecular biology detection; the method comprises the following steps: 1) constructing an internal reference and target gene amplification efficiency coefficient training set to obtain the relationship between the internal reference and the target gene amplification coefficients; 2) adding an internal reference for determining copy number and a primer for amplifying the internal reference into a multiplex PCR system of a target gene, and performing two rounds of multiplex PCR amplification to obtain a sequencing library; 3) sequencing the sequencing library to obtain sequencing data; 4) analyzing the sequencing data to obtain the reads number of the internal reference and the target gene, and calculating the copy number of the target gene by utilizing the relation between the internal reference and the target gene amplification efficiency coefficient obtained in the step 1). The method can rapidly quantify the copy number of the specific nucleic acid gene in the sample, and has high accuracy.)

一种在多重PCR体系内加入内参定量核酸拷贝数的方法

技术领域

本发明属于核酸分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种在多重PCR体系内加入内参定量核酸拷贝数的方法。

背景技术

为了快速准确的对核酸样品中特定基因的拷贝数进行定量，已经开发了大量技术。这些技术在检测和定量食品、环境样品、临床样品和其他类型样品中的核酸有着广阔的用途。

实现这类任务的一种常见做法是核酸杂交，该方法基于两条含有互补或基本互补序列的核酸链在合适条件具有下形成双链结构的能力，从而能够特异性地结合的原理。为了检测和定量特定的核酸序列，需制备标记的与靶序列互补的探针。目前DNA定量检测多采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time PCR，qPCR)技术，但价格昂贵，并且也存在一定技术局限性。虽然国产试剂的质量得到很大改进，但多数试剂的灵敏度、准确性及重复性等与进口优质试剂相比，仍存在较大差距，尤其对低核酸量或存在干扰物质的临床样本进行检测时差距更为明显。

随着新一代高通量目标序列捕获测序技术的发展，以Life Technologies公司IonPGMTM/ProtonTM系列和Illumina公司的Hiseq和Miseq系列测序仪为代表，有着其他技术无可替代的高通量、低成本、检测变异类型全面和准确率高等优势，已被广泛的应用于各类生物学研究和医学检测。相比于qPCR技术，应用多重PCR扩增进行目标序列捕获具有操作简单、成本低，短时间大量富集目标DNA序列等显著优势，大大缩短了检测流程和检测时间。对于目前的基于靶序列扩增的核酸检测和定量方法而言，准确地检测和定量具有不同基因型或突变(如导致疾病的突变)的基因一直是众所周知的挑战。因此，开发一种基于多重PCR捕获技术，并可快速、准确、一次性检测和定量样品中基因拷贝数的方法，非常具有市场应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种在多重PCR体系内加入内参定量核酸拷贝数的方法，所述方法能够快速的定量样品中特定核酸基因的拷贝数，准确度高，普适性好。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种在多重PCR体系内加入内参定量核酸拷贝数的方法，包括以下步骤：

1)构建内参和目标基因扩增效率系数训练集，获得内参与目标基因扩增系数之间的关系；

2)在目标基因的多重PCR体系中添加确定拷贝数的内参以及扩增内参的引物后，进行两轮多重PCR扩增后获得测序文库；

3)对所述测序文库进行测序，获得测序数据；

4)分析所述测序数据获得内参和目标基因的reads数，利用步骤1)中获得的内参与目标基因扩增效率系数之间的关系，计算目标基因的拷贝数；

所述内参的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述内参和目标基因扩增效率系数训练集的构建包括以下步骤：

1.1)将目标基因与内参分别稀释至不同的浓度梯度后，分别将同一浓度的目标基因与内参混合获得若干个模板集合；

1.2)向所述模板集合中加入扩增目标基因和扩增内参的引物，进行两轮PCR扩增后获得测序文库；

1.3)对所述测序文库进行测序、分析后获得内参和目标基因的reads数；

1.4)根据式I计算获得内参和目标基因的扩增效率系数；

其中，σ_i是第i种目标基因的扩增效率，d_in是第i种目标基因在第n个浓度梯度中的reads数，a_n是第n个浓度梯度测试中reads的平均数。

优选的，步骤1.1)中不同的浓度梯度包括拷贝数为300、1000、3000、10000和30000共计5个浓度梯度。

优选的，步骤4)中计算目标基因的拷贝数的公式如式II所示，

其中，r_i是第i种目标基因的拷贝数，d_i是测序样本中第i种目标基因测序得到的reads数；σ_i是第i种目标基因的扩增效率系数，由式I计算获得；d_n是内参的reads数目；c是加入的内参的拷贝数。

优选的，步骤2)中所述扩增内参的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示。

优选的，步骤3)中所述测序的长度大于PE50。

优选的，步骤4)中分析所述测序数据包括拆分Barcode、数据质量过滤、去掉低质量reads和去除非特异扩增reads。

本发明的有益效果：本发明提供了一种在多重PCR体系内加入内参定量核酸拷贝数的方法，在多重PCR体系中加入扩增内参，可以有效解决PCR检测中假阴性的现象；如果反应体系中没有扩增内参，检测到阴性结果可能是由于反应体系中没有目标基因，也可能是由于反应体系中存在抑制剂，PCR仪器故障，反应体系错误，聚合酶失活等原因造成的假阴性结果。如果反应体系中加入扩增内参，无论在反应体系中有无目标基因出现，扩增内参的信号总会出现，如果扩增内参无信号说明PCR反应失败，因此加入扩增内参可以有效的解决假阴性的现象。本发明中所述的内参是人工合成的序列，在每次检测过程中都非常稳定，并通过内参来量化检测样品中包含的目标基因的拷贝数；所述方法对样品中特定基因检测的稳定性及准确性是至关重要的；本发明所述方法还能够结合独有的生物信息学分析，能在分子水平高灵敏度的检测出不同待检测样本中所包含的特定基因含量，且检测结果准确性高。

附图说明

图1为本发明所述方法的主要步骤示意图；

图2为本发明模板集合的示意图；

图3为实施例中内参与各个目标基因的扩增效率分布图。

具体实施方式

本发明提供了一种在多重PCR体系内加入内参定量核酸拷贝数的方法，包括以下步骤：1)构建内参和目标基因扩增效率系数训练集，获得内参与目标基因扩增系数之间的关系；2)在目标基因的多重PCR体系中添加确定拷贝数的内参以及扩增内参的引物后，进行两轮多重PCR扩增后获得测序文库；3)对所述测序文库进行测序，获得测序数据；4)分析所述测序数据获得内参和目标基因的reads数，利用步骤1)中获得的内参与目标基因扩增效率系数之间的关系，计算目标基因的拷贝数；所述内参的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明中，构建内参和目标基因扩增效率系数训练集，获得内参与目标基因扩增系数之间的关系。在本发明中，所述内参的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述内参为人工合成序列，所述内参的核苷酸序列与目前已知的生物物种的基因组中包括的核苷酸序列不匹配；所述内参优选的委托生物合成公司进行合成。本发明对所述目标基因的种类和序列没有特殊限定，任何生物体中待检测的目的基因均可作为目标基因；本发明对所述目标基因的数量没有限定，在具体实施过程中，根据检测需要设定具体目标基因的数量和种类等。

在本发明中，所述内参和目标基因扩增效率系数训练集的构建包括以下步骤：1.1)将目标基因与内参分别稀释至不同的浓度梯度后，分别将同一浓度的目标基因与内参混合获得若干个模板集合；1.2)向所述模板集合中加入扩增目标基因和扩增内参的引物，进行两轮PCR扩增后获得测序文库；1.3)对所述测序文库进行测序、分析后获得内参和目标基因的reads数；1.4)根据式I计算获得内参和目标基因的扩增效率系数；

其中，σ_i是第i种目标基因的扩增效率，d_in是第i种目标基因在第n个浓度梯度中的reads数，a_n是第n个浓度梯度测试中reads的平均数。

在本发明中，将目标基因与内参分别稀释至不同的浓度梯度后，分别将同一浓度的目标基因与内参混合获得若干个模板集合。在本发明中，所述不同的浓度梯度优选的包括拷贝数为300、1000、3000、10000和30000共计5个浓度梯度，本发明分别将目标基因与内参稀释至拷贝数为300、1000、3000、10000和30000，然后将同一浓度的目标基因与内参混合获得若干个模板集合；本发明中，每一个浓度梯度优选的设置两个重复处理。本发明设定不同浓度梯度的目的在于得到不同模板浓度，内参与各个目标基因的扩增效率系数的比值。

本发明在获得所述模板集合后，向所述模板集合中加入扩增目标基因和扩增内参的引物，进行两轮PCR扩增后获得测序文库。在本发明中，所述扩增内参的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

在本发明中，所述第一轮PCR扩增的作用是富集目标基因模板与内参模板；所述第一轮PCR的体系以30μl计，优选的包括以下组分：引物Panel Mix 8μl，PCR酶10μl，H₂O 11μl，扩增内标(5个梯度浓度)1μl。所述第一轮PCR的扩增程序优选的如下：95℃3min；(95℃，20s；60℃4min)共22个循环，72℃4min，10℃保持。本发明在所述第一轮PCR扩增结束后，优选的进行PCR扩增产物的纯化，所述纯化优选的采用PCR扩增产物纯化试剂盒进行；所述PCR扩增产物纯化试剂盒优选的采用Ampure XP磁珠纯化试剂盒。本发明中，所述纯化能够有效的富集目标区域片段，减低非特异性扩增的浓度。

本发明在获得纯化的第一轮PCR的扩增产物后，以纯化的第一轮PCR的扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增；所述第二轮PCR扩增反应体系以30μl计，优选的包括以下组成：H₂O 18μl，PCR酶10μl，2PCRPrimer F 1μl，2PCR BarcodeXX R 1μl。所述第二轮PCR扩增反应的程序优选的如下：95℃3min；(95℃，15s；58℃，15s；72℃，1min)6～8个循环；72℃5min，10℃保持。连接的测序接头如下：

2PCR PrimerF：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-通用序列-3'；(SEQ ID No.2)

2PCR BarcodeXX R：

5-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNGAT-通用序列-3’(SEQ ID No.3)；

所述序列中N表示AGCT任意碱基，NNNNNNNN用于识别不同样品构建的文库；所述通用引物为测序通用引物，核苷酸序列为GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA(SEQ ID No.4)。在本发明中，所述第二轮PCR扩增的作用是让富集后的目标基因模板序列与内参模板接上测序文库接头。在本发明中，所述第二轮PCR扩增后优选的还包括第二轮PCR产物的纯化步骤，所述第二轮PCR产物的纯化与第一轮PCR产物纯化的方法一致，在此不再赘述。

本发明在所述第二轮PCR扩增后获得测序文库，对所述测序文库进行测序、分析后获得内参和目标基因的reads数。在本发明中，所述测序文库优选的进行质检，本发明对所述测序文库的质检没有特殊要求，采用本领域常规的文库质检步骤和标准即可；本发明中，所述测序的长度优选的大于PE50，所述测序的深度优选的以每个目标基因能够获得大于1000条reads为宜。在本发明中，所述分析包括拆分Barcode、数据质量过滤、去掉低质量reads和去除非特异扩增reads。本发明对所述分析的方法以及参数要求没有特殊限定，采用本领域常规的分析方法和参数要求即可。

本发明根据分析获得的内参和目标基因的reads数以及式I计算获得内参和目标基因的扩增效率系数，从而获得内参与目标基因扩增系数之间的关系。

在本发明中，在目标基因的多重PCR体系中添加确定拷贝数的内参以及扩增内参的引物后，进行两轮多重PCR扩增后获得测序文库。本发明对添加的所述内参拷贝数没有特殊限定，采用已知确定的拷贝数即可，例如300拷贝数。在本发明中此处的两轮多重PCR扩增的扩增体系和扩增程序与上述步骤1.2)中的一致，在此不再赘述。

本发明在获得所述测序文库后，对所述测序文库进行测序，获得测序数据。本发明分析所述测序数据获得内参和目标基因的reads数，利用上述步骤获得的内参与目标基因扩增效率系数之间的关系，计算目标基因的拷贝数。在本发明中，分析所述测序数据包括拆分Barcode、数据质量过滤、去掉低质量reads和去除非特异扩增reads。

在本发明中，计算目标基因的拷贝数的公式如式II所示，

其中，r_i是第i种目标基因的拷贝数，d_i是测序样本中第i种目标基因测序得到的reads数；σ_i是第i种目标基因的扩增效率系数，由式I计算获得；d_n是内参的reads数目；c是加入的内参的拷贝数。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

内参筛选和制备

通过blast将候选序列与NCBI数据库进行比对，筛选了一段通用的内参，命名为IAC。

>IAC

TACAGCACCCTAGCTTGGTAGAATCGATCAGCTACGTGAGGTCCTACGACGATCGCCAAGCATGCCCTAGCTAAGATGCATCGATTGCTCATCACGTACGTTAGGTCGACTAGGAGGACTGGAGTGCATCGACTAGCTAAGATGGTTCGATTGCTCATCACGAAGGTTAGGTCGACTACGAACGAGTCGTACGTTAGGTT(SEQ ID No.1)

IAC序列在NCBI上比对不上其它目前已知物种的序列。

将该序列人工合成，构建到载体是pUC57载体上，该操作由探针合成公司完成。

人工序列IAC质粒序列合成好之后，先用M13通用载体引物进行初步扩增，这一步可以将非线性的质粒扩增成线性的双链DNA。用Qbit对M13扩增产物进行定量，然后稀释到需要的拷贝数。按照如下公式换算即可：

其中m为对应的质量值，n是需要稀释的拷贝数。

比如需要3000拷贝情况下，只需要1.217×10^-6ng的M13扩增产物，用1.217ng的IAC的M13扩增产物稀释10的6次方倍即可。

内参及各个目标基因扩增效率系数训练集构建

(1)首先构建不同浓度梯度的模板集合。

构建300、1000、3000、10000、30000等5种拷贝数情况下的内参以及各个目标基因的模板集合。

(2)分别往步骤(1)中不同的模板集合中加入相对应的PCR引物以及内参IAC对应的引物，构建好第一轮pcr体系。其中，引物Panel Mix 8μl，PCR酶10μl，H₂O 11μl，扩增内标(5个梯度浓度)1μl；共30μl的扩增体系。

(3)第一轮pcr富集目标基因以及内参序列。将步骤(2)中的扩增体系，充分混匀，短暂离心后，放入PCR仪上。按照以下PCR反应程序进行扩增：95℃3min；22cycles(95℃20s，60℃4min)，72℃4min，10℃Hold。

(4)对第一轮扩增产物进行纯化，筛选目的片段，过滤掉二聚体等非特异扩增。第一轮PCR获得目标片段后Ampure XP磁珠纯化试剂盒或者其他等效功能的试剂盒进行纯化，除去多余的PCR引物及二聚体，有效的富集目标区域片段，减低非特异性扩增的浓度。

具体步骤如下：1)向PCR反应液加入15ul AMPure XP Beads,用移液器上下吹打，以使扩增产物与AMPure XP Beads充分混匀，室温静置1-2分钟。2)用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。3)移液器吸取上清至新的EP管中(保留上清)，避免吸到磁珠。4)向新的上清液中加入36ul AMPureXP Beads；用移液器上下吹打，以使扩增产物与AMPureXP Beads充分混匀。室温静置1-2分钟。5)用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠。6)加入40ul BW17，涡旋均匀，室温静置1-2分钟。7)重复步骤5，加入100ul 70％乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮磁珠便洗涤。8)重复步骤5。9)室温放置，直至乙醇挥发干净。

(5)对目标区域回收产物进行第二轮PCR，连接上测序相应接头与barcode。第二轮PCR反应体系如下：H₂O 18μl，PCR酶10μl，2PCR PrimerF 1μl，2PCR BarcodeXX R 1μl。运行PCR反应程序：95℃3min；6-8cycles(95℃15s，58℃15s，72℃1min)，72℃5min，10℃Hold。连接的测序接头如下：

2PCRPrimerF：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-通用序列-3'；

2PCR BarcodeXX R：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNGAT-通用序列-3’；

序列中N表示AGCT任意碱基，NNNNNNNN用于识别不同样品构建的文库，通用序列为GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA。

(6)对第二轮PCR扩增产物进行纯化。获得的产物用Ampure XP磁珠纯化试剂盒或者其他等效功能的试剂盒进行纯化。纯化步骤如下：1)PCR产物中加入30μl AMPure XPBeads，用移液器上下吹打，以使回收产物与AMPure XP Beads充分混匀。室温静置2分钟。2)用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，2分钟，直至溶液澄清为止。3)用移液器小心吸取上清，抛弃上清，留磁珠。4)加入40μl BW12，涡旋均匀，室温静置2分钟。5)用磁铁或磁力架吸附磁珠，2分钟，直至溶液澄清为止。重复步骤3。加入100μl 70％乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮磁珠便洗涤，用移液器小心去除上清。6)室温放置，直至乙醇挥发干净。本步骤磁珠亦可放于50度烘箱5分钟左右，快速蒸干乙醇。7)加入25μl Elution Buffer(可用水代替)，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱DNA。将磁珠用磁铁吸附，所得到上清DNA溶液吸20μl至一新的1.5ml离心管中，本产物直接用于后续试验或置于-20℃保存，PCR管中剩余文库可用于电泳质检。

(6)文库质检

(6.1)文库电泳：将PCR管中剩余文库进行电泳分析。配1％的琼脂糖凝胶(含1XGelred)，电泳缓冲液采用1X TBE，恒压100V电泳25分钟。上样量至少3μl，Marker使用MarkerI(天根)。正确的文库片段平均大小为400bp，100-200bp范围内为引物二聚体。

(6.2)文库定量：取文库洗脱产物2μl，加入198μl的Qubit染料(稀释至工作浓度)，充分混匀后避光孵育2min，然后使用Qubit仪进行定量。

(7)混库制备与上机

按照定量结果将所有文库按质量(ng)数1:1进行混合。

测序平台：Illumina-Miseq。

试剂盒：MiSeq ReagentNano Kit,v2(300cycles)

测序模式：PE150

测序深度：1000x

(8)下机数据基础过滤分析

采用cutadapt软件去掉下机数据reads里面的测序接头，Q20小于85％的reads，含N较多的reads，再利用引物去匹配reads，通过匹配结果来去掉引物非特异扩增的reads。

(9)数据比对模板，确定目标基因的reads数。

事先根据设计好的引物，把模拟PCR的扩增产物序列构建成一个多目标基因的参考fasta文件。

采用bwa软件将测序reads和参考fasta文件进行比对，认为错配不超过总长10％的reads为比对上该目标基因。

在比对完成之后可以直接统计每种目的基因比对上的reads数，包括内参的reads。

(10)计算内参与各个目标基因的扩增效率。

按照式I的计算公式以及各个目标基因的比对到的reads数计算内参与各个目标基因的扩增效率。

如图3是各个内参与各个目标基因的扩增效率分布图，表1是得到的目标基因与内参扩增效率系数。

表1是各个目标基因以及内参的扩增效率系数

利用内参与扩增效率训练集对检测样本目标基因进行定量计算

在构建好内参与各个目标基因扩增效率的训练集以后，可以在检测样本中加入合成好的人工内参IAC，对检测目标基因进行定量。

具体检测流程如下：

(1)构建第一轮PCR体系。其中，引物Panel Mix 8μl，PCR酶10μl，H2O 3μl，人工合成内参IIAC 1μl(300拷贝)，待检测样本DNA 8μl；共30ul的扩增体系。

构建好PCR体系后充分混匀，短暂离心后，放入PCR仪上。按照以下PCR反应程序进行扩增：95℃3min；22cycles(95℃20s，60℃4min)，72℃4min，10℃Hold。

(2)对第一轮扩增产物进行纯化。方法同内参及各个目标基因扩增效率系数训练集构建中的步骤(4)。

(3)进行第二轮pcr，接上测序接通。方法同内参及各个目标基因扩增效率系数训练集构建中的步骤(5)。

(4)对第二轮pcr产物进行纯化。内参及各个目标基因扩增效率系数训练集构建中的步骤(6)。

(5)对构建好的文库进行文库质检与测序，方法同内参及各个目标基因扩增效率系数训练集构建中的步骤(7)。

(6)对下机的数据，先做基础分析，包括采用cutadapt去除测序接头，去低质量等过滤，方法类似于内参及各个目标基因扩增效率系数训练集构建中的步骤(8)。接着按照内参及各个目标基因扩增效率系数训练集构建中的步骤(9)的规则，采用bwa软件将reads往内参序列与模板序列上比对，统计内参模板的reads数以及各个目标基因的reads数。表2为该待测样本实施例中得到的各个目标基因以及内参的reads数目

表2该待测样本实施例中得到的各个目标基因以及内参的reads数目

(7)利用人工内参与扩增效率训练集对检测样本目标基因进行定量

根据表2，这次检测里面扩增内参的read数是43条，“消化链球菌属”这个目标基因的reads数为5598条。其它目标基因的read数均为0。根据表1中的矫正系数以及式II，可以推算出“消化链球菌属”这个目标基因的拷贝数为r_i＝228641拷贝。即，该检测的核酸里面含有228641拷贝的“消化链球菌属”的核酸。

综上，利用本发明所述方法可以对目标基因进行绝对定量，可以清楚的确定待检测的DNA样本中有多少拷贝的目标基因核酸，同时可以对多个目标基因进行检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海冰缘医疗科技有限公司

<120> 一种在多重PCR体系内加入内参定量核酸拷贝数的方法

<141> 2019-10-31

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 200

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tacagcaccc tagcttggta gaatcgatca gctacgtgag gtcctacgac gatcgccaag 60

catgccctag ctaagatgca tcgattgctc atcacgtacg ttaggtcgac taggaggact 120

ggagtgcatc gactagctaa gatggttcga ttgctcatca cgaaggttag gtcgactacg 180

aacgagtcgt acgttaggtt 200

<210> 2

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cctctctatg ggcagtcggt gat 23

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ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnga t 41

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gtgactggag ttccttggca cccgaga 27