阅读说明：本技术 一种抑制病原菌的潜在益生菌株的快速筛选方法 (Rapid screening method of potential probiotic strains for inhibiting pathogenic bacteria ) 是由 李锋 单明旭 谢英杰 杨春旭 单安山 于 2019-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种对致病性细菌具有抑菌活性的菌株筛选方法,如下：将冻存致病性指示菌活化、富集培养后制成指示菌液；取待筛选供试菌株,活化培养,收集上清液,制成待筛选供试菌上清液；取过滤后的待筛选供试菌上清液与指示菌液等量混合为待测样品组,加入到细胞培养板中,以指示菌液与灭菌PBS溶液的混合物作为阳性对照组,液体培养基为阴性对照组；利用酶标仪对混合待测样品的吸光度值进行测定,以灭菌PBS溶液与指示菌液混合作为对照,抑菌活性即抑菌率为：<Image he="86" wi="700" file="DDA0002242505390000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>根据抑菌率的大小判断抑菌活性的强弱,抑菌率越大表明抑菌活性越强。本发明具有筛选样本量大,检测速度及敏感性提高,耗费时间减少的优点。(The invention discloses a screening method of a strain with bacteriostatic activity on pathogenic bacteria, which comprises the following steps: activating and enriching the cryopreserved pathogenicity indicating bacteria to prepare indicating bacteria liquid; taking a test strain to be screened, carrying out activation culture, collecting supernatant, and preparing the supernatant into the test strain to be screened; taking filtered supernatant of the test bacteria to be screened and an indication bacterial solution, mixing the supernatant and the indication bacterial solution in equal amount to form a sample group to be tested, adding the sample group to a cell culture plate, taking a mixture of the indication bacterial solution and a sterilized PBS solution as a positive control group, and taking a liquid culture medium as a negative control group; the absorbance value of the mixed sample to be detected is measured by using an enzyme-labeling instrument, the sterilized PBS solution and the indicating bacteria liquid are mixed as a control, and the bacteriostatic activity, namely the bacteriostatic rate, is as follows: judging the strength of the bacteriostatic activity according to the bacteriostatic rate, wherein the greater the bacteriostatic rate is, the bacteriostatic activity isThe stronger the activity. The invention has the advantages of large screening sample amount, improved detection speed and sensitivity and reduced time consumption.)

一种抑制病原菌的潜在益生菌株的快速筛选方法

技术领域

本发明属于益生菌生物测定技术领域，具体涉及一种抑制病原菌的潜在益生菌株的快速筛选方法。

背景技术

近年来，在世界范围内，由病原性微生物感染造成的仔猪疾病日益增多，并且这种危害可能会在生长发育过程中反复出现。研究表明：仔猪感染大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌后，通常会伴随一系列的危害，包括：严重的肠绒毛萎缩、肠腔到***的细菌移位增加，肠道隐窝深度增加、生长发育速度减缓、胆固醇的转运能力降低、仔猪死亡等，已经对畜牧养殖生产造成了严重的经济损失。在生产过程中，通常利用抗生素对仔猪细菌性感染进行治疗，但抗生素的使用不但会造成细菌耐药性，同时还会对环境、动物甚至人类本身产生不利的影响。因此，亟待找到能够替代抗生素治疗仔猪细菌性感染的替代性产品。具有抑菌活性的益生菌株筛选的常规方法多采用牛津杯法，即抑菌圈法，是最为常用的一种抑菌活性测定方法。其原理为：在含有一定浓度的指示菌平板上放置牛津杯，在牛津杯中加入细菌代谢物，在合适培养条件下培养一定时间，以加灭菌水作为对照，通过比较抑菌圈的大小，结合指示菌的浓度，选择具有高效抑菌活性的菌株。该方法虽然适用于具有快速生长特性的细菌，但是也存在一些弊端，包括：牛津杯的位置易错位，上清液的添加量限制在在100微升-200微升左右，培养皿转移可操作性差，上清扩散需要2小时甚至更长时间，单次可操作样本量小，试验费时等问题。这些问题的存在不但会加大污染概率，延长筛选时间，同时也增加了益生菌筛选工作的繁琐程度。因此，牛津杯法不适用于对具有抑菌活性的益生菌的大批量快速筛选及操作。

发明内容

针对上述存在问题，本发明的目的是提供一种抑制病原菌的潜在益生菌株的快速筛选方法，能够替代传统的牛津杯法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种对致病性细菌具有抑菌活性的菌株筛选方法，步骤如下：

(1)将冻存致病性指示菌用固体培养基活化培养后，再用与所述的固体培养基相同配方的液体培养基富集培养，配置成指示菌液；

(2)取待筛选供试菌株，用适宜该待筛选供试菌生长的液体培养基活化培养后，离心收集上清液，过滤除菌，配置成待筛选供试菌上清液；

(3)筛选方法：取过滤后的待筛选供试菌上清液与指示菌液等量混合为待测样品组，加入到细胞培养板中，以指示菌液与灭菌PBS溶液的混合物作为阳性对照组，以步骤1所述的液体培养基作为阴性对照组；

(4)抑菌活性的计算：利用酶标仪对混合待测样品的吸光度值进行测定，以灭菌PBS溶液与指示菌液混合作为对照，抑菌活性即抑菌率为：

根据抑菌率的大小判断抑菌活性的强弱，抑菌率越大表明抑菌活性越强。

本发明能够如下细菌作为指示菌进行筛选：包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。

以上所述的固体培养为脑心浸液琼脂。

本发明的有益效果及优点：与常规的牛津杯抑菌圈法相比，显著提高大肠杆菌对益生菌代谢物(上清)的接触面积及敏感性，真实反映抑菌活性效率，提高了准确性，减小了测定误差；可操作性更强，减少操作失误率，同时减少了试验时间，又可以极大提高测定样本量。

具体实施方式

下面举例对本发明做进一步的说明：

实施例1：

一种对致病性细菌具有抑菌活性的菌株筛选方法，具体按以下步骤进行：

1.培养基的配置：本实验选择利于大肠杆菌生长富集的脑心浸液琼脂培养基作为用于抑菌活性测定的筛选培养基。

脑心浸液琼脂固体培养基：胰蛋白胨10g，牛心浸粉17.5g，氯化钠5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钠(12H₂O)2.5g，琼脂13.5g，1000ml去离子水，121℃，高压灭菌而成；

脑心浸液琼脂液体培养基：胰蛋白胨10g，牛心浸粉17.5g，氯化钠5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钠(12H₂O)2.5g，1000ml去离子水，10ml分装，121℃，高压灭菌而成。

2.指示菌液的制备：取冻存的大肠杆菌划线至上述固体培养基中，37℃恒温培养，活化菌株；挑取单菌落接种于上述液体培养基中，220rpm、37℃过夜培养，然后再将过夜菌种接种于新的液体培养基中培养2-4h，直至细菌处于对数生长期，离心收集细菌，用无菌PBS冲洗，再将所得的细菌数调整为10⁵CFU/mL；大肠杆菌K88，东北农业大学动物营养研究所提供；

3.微生物代谢物的收集：称取民猪粪便1g溶解于100mL无菌生理盐水中，梯度稀释后，涂布于固体平板上37℃恒温培养24h，挑取单菌落。将单菌落接入相应液体培养基中37℃，220rpm震荡培养24h后，12000r离心，取上清，经0.22微米水系滤器过滤备用。供试材料：民猪粪便采集自兰西县种猪场。

4.抑制大肠杆菌的菌株筛选：取100微升上清与指示菌液等量混合作为样品组，加入到96孔细胞培养板中，同时以指示菌液与灭菌PBS溶液的混合物作为阳性对照组，以脑心浸液琼脂液体培养基作为阴性对照组，置37℃恒温培养12h后，当液体培养基澄清时，利用酶标仪对各样本的吸光度值进行测定。

5.抑菌活性的计算：根据吸光度值计算抑菌率，计算公式为：

根据抑菌率的大小判断抑菌活性的强弱，抑菌率越大表明抑菌活性越强。

实施例2：

96孔板液体培养法与牛津杯固体培养法的效果对比试验例，以大肠杆菌作为指示菌：

本实施例的96孔板液体培养法与常规牛津杯固体培养法进行对比试验，试验选取多种对大肠杆菌具有抑制活性的抗生素(多粘菌素B、庆大霉素、强力霉素、卡那霉素)作为测试样本比较两种测定方法的效果。

具体按以下步骤进行：

1.培养基配制：具体步骤参考实施例1；

2.指示菌液的制备：具体步骤参考实施例1；

3.抗生素的制备：每种抗生素(多粘菌素B、庆大霉素、强力霉素、卡那霉素)取2mg溶于100ml灭菌去离子水中，使用前利用0.22微米滤器再次过滤除菌；

4.抗生素液的倍比稀释：对每种抗生素(多粘菌素B、庆大霉素、强力霉素、卡那霉素)溶液进行倍比稀释为10mg/L、5mg/L、2.5mg/L以此类推；

5.牛津杯培养法：具体操作及抑菌测活性测定方案参考作者：辛海云发表的论文《藏猪肠道中拮抗致病菌微生物的筛选及其抗菌肽研究》(2017)；

6.96孔板液体培养法：用微量移液器取100μL细菌悬浮液加入到96孔板中的第2-8号孔内与倍比稀释的抗生素溶液等量混合，100μL和200μL脑心浸液琼脂液体培养基加入到第9、10号孔内，100μL抗生素液(20mg/L)加入第2号孔内，混匀，加盖封口后置于37℃下培养16-18h。此时，第9号孔为阳性对照，第10号孔为阴性对照，第2-8号孔为测试孔，其中抗生素液浓度从20mg/L依次倍比递减；

7.牛津杯法与96孔板液体培养法的结果判定：牛津杯周围出现抑菌圈则说明抗生素对细菌生长具有抑制作用，如无抑菌圈则说明不抑制；阴性对照孔在整个试验过程中保持清亮，表明整个试验过程没有受到细菌污染；与阳性对照孔相比，测试孔呈浑浊状，表明未抑制细菌生长；若无肉眼可见生长菌，则说明抑制。

8.牛津杯法与96孔板液体培养法(96孔板法)的测试结果对比：

注：+,抑制；-,不抑制

根据结果对比可以发现，液体培养相对常规的牛津杯抑菌圈法相比，改固体培养基平面培养为液体培养，从而显著提高大肠杆菌与测定物质的接触面积及敏感性，真实反映抑菌活性效率，提高了准确性，减小了测定误差。

实施例3：

筛选抑制致病性细菌的菌株的方法差异对比实例

本实施例的孔板液体培养法与常规牛津杯固体培养法进行对比试验，试验选取大肠杆菌K88作为指示菌，验证筛选效率及操作难易程度等。

供试材料：具体参考实施例1；

具体按以下步骤进行：

1.培养基的配置：具体参考实施例1；

2.指示菌液的制备：具体参考实施例1；

3.微生物代谢物的收集：具体参考实施例1(实验选取实施例1中挑取的100株菌株作为实验对象)；

4.抑制大肠杆菌的菌株筛选：孔板培养法(以96孔板为例)具体参考实施例1；牛津杯法，在固体培养基上加置牛津杯，在牛津杯中加入100μL各菌株代谢上清，每个菌株设置3个平行，37℃培养18-24h，具体操作参考作者：辛海云发表的论文《藏猪肠道中拮抗致病菌微生物的筛选及其抗菌肽研究》(2017)；

5.牛津杯法与96孔板液体培养法的结果判定：具体参考实施例2；

6.牛津杯法与孔板液体培养法对比总结：首先，在实验操作过程中牛津杯法中牛津杯偶发漏液，串动情况，增长实验操作时间；牛津杯法操作过程中平皿无法封膜，在结果判定过程中发现异于大肠杆菌菌落散布，而孔板法可以封膜且阴性对照组无污染；对100株菌株进行筛选，需要培养皿102个，牛津杯408个，而96孔板只需10个即可完成，且占用空间小。