一种mTOR抑制剂PP242的二十二碳六烯酸偶联前药、制剂及其应用
阅读说明：本技术 一种mTOR抑制剂PP242的二十二碳六烯酸偶联前药、制剂及其应用 (Docosahexaenoic acid coupled prodrug of mTOR inhibitor PP242, preparation and application thereof ) 是由 谢海洋 周科 王杭祥 郑树森 于 2021-06-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种mTOR抑制剂PP242的二十二碳六烯酸偶联前药及其应用。本发明将PP242-DHA偶联前药应用于抗移植排斥药物中,提高了药物在体内的存留时间,以及在外周免疫器官的蓄积,并能有效抑制免疫排斥反应,延长移植受者移植物的生存时间,且用药安全性高。(The invention discloses a docosahexaenoic acid coupled prodrug of an mTOR inhibitor PP242 and application thereof. The PP242-DHA coupled prodrug is applied to the anti-transplant rejection medicine, so that the retention time of the medicine in the body and the accumulation of peripheral immune organs are improved, the immune rejection reaction can be effectively inhibited, the survival time of transplant recipients is prolonged, and the medication safety is high.)
技术领域
本发明属于抗器官移植排斥药物技术领域，具体涉及一种mTOR抑制剂PP242的二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)偶联前药制备及其在抗心脏移植排斥中的应用。
背景技术
雷帕霉素是目前器官移植领域唯一临床应用的mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)抑制剂，其广泛应用肾脏、肝脏及心脏等实体器官移植。目前雷帕霉素水溶性较差，体内代谢快的问题，难以通过静脉滴注给药，而口服摄入存在生物利用度低、在移植器官局部药物蓄积不足、毒副作用大，易导致移植后代谢并发症。移植排斥反应尤其是急性排斥主要是由T细胞激活增殖介导的炎症反应。
PP242为一种选择性mTOR抑制剂，其结构如下：
PP242能够同时抑制mTORC1以及mTORC2的活性。已经有研究表明PP242能够抑制多种肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。目前，尚未有PP242可以用于制备抗移植排斥药物的报道。
发明内容
发明人基于mTOR抑制剂小分子化合物库，通过体外CFSE标记的T细胞增殖试验体系筛选出对T细胞具有显著增殖抑制作用的mTOR抑制剂，发现mTOR抑制剂PP242抑制CD4+/CD8+T细胞增殖效应最为显著。小鼠心脏移植模型证实其具有抗移植排斥效应。为进一步提高其体内生物利用度，提高抗移植排斥的疗效，我们对其酯化反应偶联具有强疏水性的长链不饱和烷烃分子DHA，构建了自组装型的纳米免疫抑制剂，其在小鼠移植模型中抗排异疗效较原药提升显著，且无明显的毒副作用，为临床移植排异新型免疫抑制剂的开发及移植排斥防治提供新的技术策略。
本发明提供一种mTOR抑制剂PP242的二十二碳六烯酸偶联前药制备及应用；该前药合成方法简单，无特殊辅料，易于后续工业批量合成生产。体内心脏移植动物实验显示，PP242-DHA纳米制剂短期给药即能有效心脏移植排斥反应，延长移植心存活时间。
本发明提供一种PP242或PP242的二十二碳六烯酸偶联前药在抗移植排斥中的应用。其中，所述PP242的二十二碳六烯酸偶联前药(即PP242-DHA偶联前药)的结构式如下：
所述PP242的二十二碳六烯酸偶联前药能够实现自组装纳米化。
我们前期应用体外T细胞增殖试验筛选获得具有CD4+、CD8+T细胞显著抑制增殖作用的mTOR抑制剂PP242，其可同时抑制免疫细胞的极化和抑制小鼠同种异体异位心脏移植的排斥反应，本发明通过利用二十二碳六烯酸修饰前体药物的策略，构建出PP242-DHA偶联前药自组装纳米制剂和聚乙二醇化PP242-DHA偶联前药纳米制剂，较好地改善了PP242的药代动力学特性，延长药物体内循环时间，短期给药即可实现更好的抑制移植后免疫排斥反应，达到延长移植物存活时间的目的。
作为优选，所述抗移植排斥药物为抗移植排斥靶向药物。
作为优选，所述抗移植排斥药物为具有抑制T细胞增殖、减轻移植免疫排斥反应的药物。
我们前期实验表明PP242具有显著的抑制T细胞增殖作用，但PP242的水溶性差，体内生物利用率低，导致其移植模型体内抗排斥作用并不十分显著。本发明通过构建PP242-DHA纳米制剂使得其水溶性大大增加，并增强PP242的体内循环时间，维持有效血药浓度；同时纳米制剂可靶向于外周免疫器官脾脏和淋巴结，从而实现更佳的抗移植排斥效果。
作为进一步优选，所述抗移植排斥药物为治疗移植排斥反应的药物。
上述PP242-DHA偶联前药的制备方法为：在缩合剂和催化剂作用下，PP242与二十二碳六烯酸(DHA)进行酯化反应，得到所述PP242-DHA偶联前药，如上式所示。
所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，催化剂为4-二甲氨基吡啶(DMAP)。作为优选，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。作为优选，反应温度为40～50℃。反应时间为2～8小时。
作为优选，所述PP242的DHA偶联前药采用纳米制剂形式。
作为进一步优选，所述PP242的DHA偶联前药采用自组装纳米制剂或聚乙二醇化的纳米制剂(即聚乙二醇化PP242-DHA偶联前药纳米制剂)。
作为具体优选，上述PP242-DHA偶联前药的自组装纳米制剂制备方法，包括将溶有PP242-DHA偶联前药的有机溶剂于超声条件下注入水相中，透析得到均匀分散的纳米颗粒，即PP242-DHA偶联前药自组装纳米制剂；
作为优选，有机溶剂为二甲基亚砜溶剂，二甲基亚砜与水相体积比为1:8～15；作为进一步优选，二甲基亚砜与水相体积比为1：9。
作为进一步优选，所述聚乙二醇化的纳米制剂由1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)](DSPE-PEG)与所述PP242-DHA偶联前药制备得到。
作为更进一步优选，以PP242的质量计算，所述PP242-DHA与1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]的质量比为8～12:1；作为进一步优选所述PP242-DHA与1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]的质量比10：1。作为优选，所述1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]为DSPE-PEG2k(或DSPE-PEG2000)。
作为具体优选，上述聚乙二醇化PP242-DHA偶联前药纳米制剂的制备方法，包括将溶有PP242-DHA偶联前药与含有DSPE-PEG2k的有机溶剂于超声条件下注入水相中，透析得到均匀分散的纳米颗粒。
制备过程中，可将PP242-DHA偶联前药及DSPE-PEG2k分别溶于有机溶剂中，再将有机溶剂充分混匀，最后将混匀的有机溶剂于超声条件下注入水相，透析得到均匀分散的纳米颗粒。
作为优选，有机溶剂为二甲基亚砜溶剂，二甲基亚砜与水相体积比为1：8～15；作为进一步优选，所述体积比为1：9。
本发明提供了以上基于PP242-DHA偶联前药自组装纳米制剂、聚乙二醇化PP242-DHA偶联前药纳米制剂。前述形式的纳米制剂显著提高了PP242的水溶性，同时用于修饰的DHA为人体所需物质，生物相容性好，便于临床转化，具有较好的应用前景。更为重要的是，PP242-DHA纳米制剂显著改善了药物的药代动力学特性，延长其体内循环时间，并可将药物有效递送至外周免疫器官，发挥更强效的维持外周免疫微环境的免疫抑制作用，从而减轻器官移植后的排斥反应。
与现有技术相比，本发明的优势效果体现在：
1)本发明筛选了具有免疫抑制效应的mTOR抑制剂PP242，并应用人体必需脂肪酸DHA作为前药的修饰材料，具有很好的安全性及生物相容性，便于临床转化。
2)本发明通过对PP242修饰不饱和脂肪酸DHA，大大提高了药物的水溶性，避免使用增溶剂、表面活性剂等辅料，提高了安全性。
3)本发明构建的PP242-DHA偶联前药具有外周免疫器官的靶向性，增大了脾脏和淋巴结的蓄积作用，从而达到更好的器官移植外周免疫耐受，减轻移植物的排斥反应。
综上所述，本发明将PP242-DHA偶联前药应用于抗移植排斥药物中，提高了药物在体内的存留时间，以及在外周免疫器官的蓄积，并能有效抑制免疫排斥反应，延长移植受者移植物的生存时间，且用药安全性高。
附图说明
图1为实施例1中PP242-DHA偶联前药的合成路线图；
图2为实施例1中制得的PP242-DHA偶联前药的核磁氢谱图；
图3为实施例2中(1)纳米制剂电镜及粒径图；
图4为实施例2中(2)纳米制剂体内器官分布图；
图5为实施例3中(1)纳米制剂抗移植排斥效果对比图；
图6为实施例3中(2)纳米制剂移植受体鼠原位心脏切片HE图；
图7为实施例3中(2)纳米制剂移植受体鼠肝脏切片HE图；
图8为实施例3中(2)纳米制剂移植受体鼠肺切片HE图；
图9为实施例3中(2)纳米制剂移植受体鼠肾脏切片HE图。
具体实施方式
实施例1
PP242-DHA偶联前药的合成，如图1所示：
将EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，25.6mg，0.165mmol)和DMAP(4-二甲氨基吡啶，20.2mg，0.165mmol)快速滴加入含PP242(46.2mg，0.15mmol)和DHA(顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸，52.5mg，0.16mmol)反应瓶中，加入2mL无水DMF溶解。43℃搅拌6小时，然后去除溶剂，反应混合物用二氯甲烷稀释，分别用0.1M盐酸溶液，饱和碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水溶液清洗；有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液后减压除去溶剂；通过柱层析色谱分离纯化(DCM:MeOH＝20：1)后得到产物DHA-PP242偶联前药(42.3mg，产率45.8％)(DHA-PP242)。
产物PP242-DHA偶联前药的1H NMR核磁数据如下，核磁谱图如图2所示：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.95(s,1H),8.39(s,1H),7.43(d,J＝8.8Hz,1H),7.36(d,J＝2.2Hz,1H),6.98(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),6.86(d,J＝2.0Hz,1H),5.87(s,2H),5.45–5.31(m,12H),5.24–5.18(m,1H),2.90–2.80(m,10H),2.67(m,J＝7.2Hz,2H),2.59–2.53(m,2H),2.07(t,J＝7.4Hz,2H),1.25(s,6H),0.98(m,3H).
实施例2
1)聚乙二醇化PP242-DHA纳米制剂的制备：
将实施例1中制得的DHA-PP242偶联前药溶于含有DSPE-PEG2000的二甲基亚砜溶剂中(DHA-PP242偶联前药与DSPE-PEG2000的质量比为10：1，二甲基亚砜为溶解量即可)，得混合溶液。加入水，二甲基亚砜与水相体积比为1：9，通过透析(MW 3500)除去有机溶剂，得到均匀分散的聚乙二醇化PP242-DHA纳米制剂(DPNP或PEGylated NPs或PEGylated DPNP)。其粒径分布及透射电镜如图3所示。
图3中，PP242-DHA自组装纳米颗粒(Self-assembled DHA-PP242nanoparticles，或bare DPNP)的制备方法同聚乙二醇化PP242-DHA纳米制剂，区别在于不添加DSPE-PEG2000。
图3的A和B中：“-”表示不加DSPE-PEG2000的纳米制剂；“+”表示添加DSPE-PEG2000的纳米制剂；A图中，“PP242”表示(添加或不添加DSPE-PEG2000)PP242原药直接溶解在水中的纳米颗粒体系。由A中左图可知，相比于不添加DSPE-PEG2000实验组，添加的DSPE-PEG2000的PP242原药纳米颗粒体系在24小时后出现了明显的沉淀现象；由A中右图可知，聚乙二醇化PP242-DHA纳米制剂在24小时候依然呈现良好的可溶性纳米悬浮液状态。由B图可知，聚乙二醇化PP242-DHA纳米制剂具有明显的丁达尔效应。由C图和D图可知，聚乙二醇化PP242-DHA纳米制剂(PEGylated NPs)颗粒明显小于未添加DSPE-PEG2000的PP242-DHA自组装纳米颗粒直径。D图是平均粒径(DH)与时间的关系，由D图可知DHA-PP242自组装纳米制剂颗粒与聚乙二醇化DHA-PP242纳米制剂均具有较为稳定的平均粒径。
2)药物体内器官分布实验：
按照图4中A的流程，利用实施例1的方法，利用PP242与DHA合成DHA-PP242。按照相同的方法合成DHA-Cy5.5。
然后按照本实施例上述步骤1)相似的方法，将DHA-PP242溶于DMSO，与DSPE-PEG2000和DHA-Cy5.5的DMSO溶液混合，DHA-PP242、DSPE-PEG2000以及DHA-Cy5.5(以其中Cy5.5的量计算)的质量比依次是100：10：1，透析后制备得到荧光探针Cy5.5标记的聚乙二醇化PP242-DHA纳米制剂(Cy5.5 labeled DPNP)，腹腔注射入小鼠。
图4中B为在注射后6、12、24、48和72小时处死小鼠，取出小鼠脾脏，通过小动物成像系统检测Cy5.5的荧光强度，以辐射效率作为评判指标。C中横坐标是时间，纵坐标是平均辐射效率。
图4中D为在注射后6、12、24、48和72小时处死小鼠，取出小鼠腹主动脉旁淋巴结，通过小动物成像系统检测Cy5.5的荧光强度，以辐射效率作为评判指标。E为横坐标是时间，纵坐标是平均辐射效率。
由图4可知，荧光探针Cy5.5标记的DHA-PP242具有很好的外周免疫器官靶向性，给药12-48小时后主要蓄积于脾脏和引流淋巴结，脾脏和淋巴结是器官移植T细胞免疫激活的主要场所，而荧光探针对照组在脾脏和淋巴结无明显的蓄积和趋向作用。
实施例3
1)同种异体异位心脏移植模型的构建及免疫抑制治疗实验
构建稳定的供体BALB/c至受体C57BL/6小鼠皮肤移植及小鼠异位心脏移植模型，小鼠异位心脏移植模型通过供心主动脉与受体腹主动脉、供心肺动脉与受体下腔静脉吻合的方法构建获得，该同种异体移植模型排斥效应强效且稳定，并易于观察评价。心脏移植手术后每天给药1次，通过腹腔注射给药，共10天(40mg/kg/天)。给药后10天内记录小鼠体重变化情况并以小鼠异位移植心存活时间作为药物治疗效果的评价依据。
图5中，A为取Balb/c小鼠的心脏移植到C57BL/6小鼠腹腔中，术后连续给药10天，PP242或者聚乙二醇化DHA-PP242纳米颗粒(DPNP)，生理盐水作为对照。B为三组小鼠的移植心脏的存活时间。C为给药时间内三组小鼠的体重变化。D为在心脏移植术后4天(POD 4)，取移植心脏做HE染色，发现在第四天的时候生理盐水组和PP242组的移植心脏边缘出现免疫细胞浸润，但DPNP组没有明显免疫细胞浸润；在心脏移植术后8天(POD 8)，取移植心脏做HE染色，在第八天的时候生理盐水组和PP242组的移植心脏肌层出现免疫细胞浸润，但DPNP组仅出现少量免疫细胞浸润。E、取术后八天的移植心脏研磨提取RNA，通过定量PCR技术检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、CX3CL、CXCL12、CXCL16、HMGB1、ICAM-1、GMCSF1、TGF-β、TNF-α、IFN-γ、NF-κB、CTLA4、PDL1、CD11b、CD11c、FOXP3、RAPTOR、Granzyme B和Perforin 1。
如图5所示，相较于生理盐水组(Saline)，PP242原药、纳米药物组(DPNP，为实施例2制备得到)均有效延长了移植心脏的中位生存期，三组体重无明显差异。组织切片显示有效减轻了移植心脏的排斥反应，降低了IL-2等炎性细胞因子的表达。纳米药物组相较于原药形式，具有更为显著的治疗效果。
2)药物对同种异体异位心脏移植模型受体鼠主要器官毒性的影响
在移植后4天、8天取移植受体鼠原位心脏(非异位移植心脏)、肾脏、肝脏及肺，福尔马林固定后切片HE观察，发现40mg/kg/天，连续10天给药，原药和纳米制剂组均无明显的器官毒副作用。如图6-9所示。图6为术后第4天和第8天，取接受心脏移植的三组C57BL/6的小鼠胸腔中的心脏做HE染色。图7为在术后第4天和第8天，取接受心脏移植的三组C57BL/6的小鼠肝脏做HE染色。图8为在术后第4天和第8天，取接受心脏移植的三组C57BL/6的小鼠肺脏做HE染色。图9为在术后第4天和第8天，取接受心脏移植的三组C57BL/6的小鼠肾脏做HE染色。
综上所述，本发明上述形式的纳米制剂显著提高了PP242的水溶性，避免使用增溶剂等辅料；同时用于修饰的不饱和脂肪酸为人体所需物质，生物相容性好，便于临床转化，具有较好的应用前景。更为重要的是，聚乙二醇化不饱和脂肪酸偶联前药自组装纳米制剂，显著改善了药物的药代动力学特性，延长其体内循环时间，可将PP242递送至靶部位，发挥药效，对比原药具有更优的抗移植排斥效应，且无明显的毒副作用。
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