阅读说明：本技术 用于在酵母中生产植物***素和植物***素类似物的方法和细胞系 (Methods and cell lines for producing phytocannabinoids and phytocannabinoid analogs in yeast ) 是由 肖哈姆·慕克吉 亚历山大·詹姆斯·坎贝尔 扎卡里·道格拉斯·威尔特希尔 凯文·约翰·陈 于 2018-02-19 设计创作，主要内容包括：用于在酵母中生产植物大麻素和植物大麻素类似物的方法和细胞系。该方法应用,以及该细胞系包括,用聚酮化合物合成酶CDS和胞质异戊烯基转移酶CDS转化的酵母细胞。聚酮化合物合成酶催化橄榄醇或甲基橄榄醇的合成,并且可包括大麻橄榄醇酸合成酶或盘基网柄菌聚酮化合物合成酶(“DiPKS”)。可修饰酵母细胞,以包括磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶,用于增加DiPKS的活性。可修饰酵母细胞,以减轻线粒体乙醛分解代谢,用于增加合成橄榄醇或甲基橄榄醇可用的丙二酰基辅酶A。异戊烯基转移酶催化大麻萜酚或大麻萜酚类似物的合成,并且可包括来自链霉菌属CL190的αββα胞质异戊烯基转移酶。可修饰酵母细胞,以减轻焦磷酸香叶酯的消耗,用于增加用于异戊烯化可用的焦磷酸香叶酯。(Methods and cell lines for the production of phytocannabinoids and phytocannabinoid analogs in yeast. The method uses, and the cell line comprises, yeast cells transformed with polyketide synthase CDS and cytoplasmic prenyltransferase CDS. Polyketide synthases catalyze the synthesis of olivine or methylolivine and may include cannabinol synthase or dictyostelium discodermatum polyketide synthase ("dicks"). Yeast cells can be modified to include a phosphopantetheinyl transferase for increasing the activity of dicks. Yeast cells can be modified to reduce mitochondrial acetaldehyde catabolism for increased malonyl-coa available for synthesis of olivetol or methyl olivetol. The prenyltransferase catalyzes the synthesis of cannabigerol or cannabigerol analogs, and may include an α β α cytosolic prenyltransferase from streptomyces CL 190. Yeast cells can be modified to mitigate geranyl pyrophosphate consumption for increasing the available geranyl pyrophosphate for prenylation.)

用于在酵母中生产植物***素和植物***素类似物的方法和 细胞系

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年2月17日提交的名称为用于在酵母中生产植物***素的方法和细胞系的美国临时专利申请号62/460,526的优先权的权益，该申请在此通过引用以其整体并入。

技术领域

本公开大体上涉及在酵母中生产植物***素和植物***素的类似物。

背景技术

植物***素是在***(Cannabis sativa)、其他植物和一些真菌中天然生产的。已知超过105种植物***素在***中生物合成，或由在***中生物合成的植物***素的热分解或其他分解得到。虽然***植物也是谷物、纤维和其他材料的有价值来源，但是种植用于生产植物***素的***，特别室内种植，耗费能量和劳动。来自***植物的植物***素的随后的提取、纯化和分馏也是劳动和能量密集型的。

植物***素是有助于***的医学和精神治疗作用的药理活性分子。***植物中植物***素的生物合成与其他农业项目规模类似。与其他农业项目一样，通过种植***大规模生产植物***素需要各种投入(例如营养物、光、害虫控制、CO₂等)。必须提供培育***所需的投入。此外，在允许的情况下，在从该植物制备的产品用于商业用途的情况下，***的培育目前受到严格的管制、税收和严格的质量控制，进一步增加了成本。植物***素类似物是与植物***素结构相似的药理活性分子。植物***素类似物通常是化学合成的，这可能是劳动密集型的和昂贵的。因此，在强健且可扩展的可发酵生物体中生产植物***素和植物***素类似物可为经济的。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是已经用于生产工业规模的类似分子的可发酵生物体的例子。

种植用于生产天然存在的植物***素的***所涉及的时间、能量和劳动提供了制备用于在酵母中生产植物***素的转基因细胞系的动机。这种努力的一个例子提供在Poulos和Farnia的美国专利申请公开号US 2016/0010126中。

发明内容

本公开的目的是消除或减轻之前在酵母中生产植物***素的方法和之前生产植物***素类似物的方法的至少一个缺点。在***中发现的105种植物***素的许多种可在酵母中合成，并且可期望提高基于酵母的生产。类似地，可期望允许生产植物***素类似物而无需劳动密集型的合成的方法。

本文提供的方法和细胞系可应用并包括已经用编码来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(“CL190”)的NphB异戊烯基转移酶(“AltPT”)的基因转化的转基因酿酒酵母。AltPT是αββα(“ABBA”)型异戊烯基转移酶。AltPT催化由橄榄醇酸和焦磷酸香叶酯(“GPP”)合成***萜酚酸(“CBGa”)。AltPT还催化由橄榄醇和GPP合成***萜酚(“CBG”)。在***中，异戊烯基转移酶催化由橄榄醇酸和GPP合成CBGa。***异戊烯基转移酶是膜结合的，使得在酿酒酵母中的表达复杂。相反，AltPT是胞质的并且在酿酒酵母中以比***异戊烯基转移酶更高的水平表达。当在酿酒酵母中表达以催化由橄榄醇酸和GPP合成CBGa或由橄榄醇和GPP合成CBG时，AltPT可提供优于膜结合的***异戊烯基转移酶的优势。酿酒酵母可在Erg20、Maf1或UPC2，或支持耗尽GPP的代谢途径的酶或其他蛋白质的其他基因中具有一个或多个突变，该一个或多个突变用于增加可用的GPP。可选地，可应用其他种类的酵母，包括解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、普鲁兰丝孢酵母(Trichosporonpullulan)和产油油脂酵母(Lipomyces lipoferetc)。

在本文提供的一些方法和细胞系中，转基因酿酒酵母包括***聚酮化合物合成酶(也称为橄榄醇酸合成酶或“OAS”)的基因。OAS催化由丙二酰基辅酶A和己酰基辅酶A合成橄榄醇。该反应的丙二酰基辅酶A与己酰基辅酶A与橄榄醇酸的化学计量比为2:1:1。在***中，橄榄醇在存在橄榄醇酸环化酶(“OAC”)或另一聚酮化合物环化酶的情况下被羧化成橄榄醇酸，橄榄醇酸被送到上面结合AltPT和其他胞质异戊烯基转移酶描述的通过***中的膜结合的异戊烯基转移酶催化的CBGa合成代谢途径中。来自***的OAC酶可从转基因酿酒酵母中排除，以促进通过AltPT合成CBG而不是CBGa。

在本文提供的一些方法和细胞系中，转基因酿酒酵母包括盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)聚酮化合物合成酶(“DiPKS”)的基因。DiPKS是由I型脂肪酸合成酶(“FAS”)和聚酮化合物合成酶组成的融合蛋白，并且被称为杂合“FAS-PKS”蛋白。DiPKS催化由丙二酰基辅酶A合成甲基橄榄醇。该反应的丙二酰基辅酶A与甲基橄榄醇的化学计量比为6:1。AltPT催化由甲基橄榄醇合成甲基***萜酚(“meCBG”)，类似于上述由橄榄醇合成CBG。己酸对酿酒酵母有毒。当应用OAS时，己酰基辅酶A是用于合成橄榄醇的必要前体。当使用DiPKS生产甲基橄榄醇而不是OAS，以生产橄榄醇或橄榄醇酸时(如果，不需要将己酸添加到生长培养基中。与使用OAS时的CBG产量相比，生长培养基中没有己酸可使得酿酒酵母培养物的生长增加以及meCBG的产量更高。

对于一些应用，meCBG和可由meCBG合成的甲基化的下游植物***素类似物(类似于在***中由CBGa合成的下游植物***素)为有价值的。在其他情况下，可更期望结构上与脱羧形式的天然存在的植物***素相同的植物***素。为了生产结构上与脱羧形式的天然存在的植物***素相同的植物***素，可相对于野生型DiPKS而修饰DiPKS以减少橄榄醇的甲基化，使得合成CBG而不是meCBG。酿酒酵母可包括增加DiPKS的活性的辅因子加载酶。

通过增加胞质中丙二酰基辅酶A的水平可促进橄榄醇和甲基橄榄醇的合成。酿酒酵母可具有天然的乙醛脱氢酶的过表达和突变型乙酰基辅酶A合成酶或其他基因的表达，这些突变使得减轻线粒体乙醛分解代谢。通过将乙醛转移至乙酰基辅酶A生产来减少线粒体乙醛分解代谢，增加了合成橄榄醇可用的丙二酰基辅酶A。Acc1是天然的酵母丙二酰基辅酶A合成酶。酿酒酵母可具有Acc1的过表达或Acc1的修饰用于增加的活性和增加的可用的丙二酰基辅酶A。酿酒酵母可包括Maf1的修饰的表达或tRNA生物合成的其他调节剂。已经显示，过表达天然的Maf1减少tRNA生物合成的焦磷酸异戊酯(“IPP”)的损失，从而提高酵母中的单萜产量。IPP是甲羟戊酸途径的中间体。Upc2是酿酒酵母中甾醇生物合成的活化剂，并且Upc2的Glu888Asp突变可增加酵母中的单萜生产。

在第一方面中，本文提供了用于在酵母中生产植物***素和植物***素类似物的方法和细胞系。该方法应用，并且该细胞系包括，用聚酮化合物合成酶CDS和胞质异戊烯基转移酶CDS转化的酵母细胞。聚酮化合物合成酶催化橄榄醇或甲基橄榄醇的合成，并且可包括***橄榄醇酸合成酶或盘基网柄菌聚酮化合物合成酶(“DiPKS”)。可修饰酵母细胞以包括用于增加DiPKS的活性的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。可修饰酵母细胞，以减轻线粒体乙醛分解代谢，用于增加可用于合成橄榄醇或甲基橄榄醇的丙二酰基辅酶A。异戊烯基转移酶催化***萜酚或***萜酚类似物的合成，并且可包括来自链霉菌属CL190的αββα胞质异戊烯基转移酶。可修饰酵母细胞，以减轻焦磷酸香叶酯的消耗，用于增加异戊烯化可用的焦磷酸香叶酯。

在进一步的方面中，本文提供了生产植物***素或植物***素类似物的方法，该方法包括：提供包括编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸和编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸的酵母细胞，和使酵母细胞繁殖，用于提供酵母细胞培养物。该聚酮化合物合成酶用于由丙二酰基辅酶A生产至少一种前体化学物质，该前体化学物质具有结构I：

在结构I上，R1是链长为1、2、3、4或5个碳的烷基，R2是H、羧基或甲基，并且R3是H、羧基或甲基。该胞质异戊烯基转移酶用于使至少一种前体化学物质异戊烯化，提供至少一个种类的植物***素或植物***素类似物。

在一些实施方式中，酵母细胞包括编码己酰基合成酶的第三多核苷酸；聚酮化合物合成酶包括来自***的OAS酶；并且使酵母细胞繁殖包括使酵母细胞在包括己酸的营养制剂中繁殖。在一些实施方式中，酵母细胞不包括***聚酮化合物环化酶，并且至少一个种类的植物***素或植物***素类似物包括脱羧的植物***素或植物***素类似物。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括来自***的OAS酶的编码序列，其中OAS酶的一级结构与由SEQ ID NO:45的碱基3841至4995限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:45的碱基3841至4995具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:45的碱基3841至4995具有80％和100％之间的碱基序列同源性。

在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是H，并且R3是H。

在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是H。

在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是甲基，并且R3是H。

在一些实施方式中，R1是链长为3个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是甲基。

在一些实施方式中，聚酮化合物合成酶包括来自盘基网柄菌的DiPKS聚酮化合物合成酶。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括用于DiPKS聚酮化合物合成酶的编码序列，其中DiPKS聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:46的碱基535至9978限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:46的碱基535至9978具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，至少一种前体化学物质在R2处包括甲基，并且至少一个种类的植物***素或植物***素类似物包括甲基化的植物***素类似物。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括影响C-Met结构域的活性位点的突变，用于减轻至少一种前体化学物质的甲基化，使得至少一种前体化学物质包括其中R2是甲基并且R3是H的第一前体化学物质，和其中R2是H并且R3是H的第二前体化学物质；并且至少一个种类的植物***素或植物***素类似物包括甲基化的植物***素类似物和未甲基化的植物***素。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括DiPKSG1516D；G1518A聚酮化合物合成酶。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括用于DiPKSG1516D；G1518A聚酮化合物合成酶的编码序列，其中DiPKSG1516D；G1518A聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:37的碱基523至9966限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ ID NO:37的碱基523至9966具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶。在一些实施方式中，第一多核苷酸包括DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶的编码序列，该DiPKSG1516R聚酮化合物合成酶的一级结构与由SEQ ID NO:38的碱基523至9966限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第一多核苷酸与SEQ IDNO:38的碱基523至9966具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，DiPKS聚酮化合物合成酶包括降低在DiPKS聚酮化合物合成酶的C-Met结构域的活性位点处的活性的突变，用于防止至少一种前体化学物质的甲基化，使得至少一种前体化学物质具有氢R2基团和氢R3基团；并且至少一个种类的植物***素或植物***素类似物包括脱羧的植物***素或植物***素类似物。在一些实施方式中，酵母细胞包括编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的第三多核苷酸，用于增加DiPKS的活性。在一些实施方式中，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶包括来自构巢曲霉(A.nidulans)的NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。在一些实施方式中，第三多核苷酸包括用于来自构巢曲霉的NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的编码序列，其中NpgA磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的一级结构与由SEQ ID NO:10的碱基1170至2201限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸与SEQ ID NO:10的碱基1170至2201具有80％和100％之间的碱基序列同源性。

在一些实施方式中，聚酮化合物合成酶包括用于由丙二酰基辅酶A合成至少一种前体化学物质的活性位点，而不需要较长链的羰游基辅酶A。在一些实施方式中，至少一种前体化学物质在R1处包括戊基，并且至少一个种类的植物***素或植物***素类似物包括戊基植物***素或甲基化的戊基植物***素类似物。在一些实施方式中，至少一种前体化学物质包括橄榄醇橄榄醇酸、甲基橄榄醇或甲基橄榄醇酸中的至少一种，并且至少一个种类的植物***素或植物***素类似物包括CBG、CBGa、meCBG或meCBGa中的至少一种。

在一些实施方式中，胞质异戊烯基转移酶包括来自链霉菌属CL190的NphB异戊烯基转移酶。在一些实施方式中，第二多核苷酸包括用于来自链霉菌属CL190的NphB异戊烯基转移酶的编码序列，其中NphB异戊烯基转移酶的一级结构与由SEQ ID NO:44的碱基987至1913限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第二多核苷酸与SEQ ID NO:44的碱基987至1913具有80％和100％之间的碱基序列同源性。

在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是H，并且R3是H。

在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是H。

在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是甲基，并且R3是H。

在一些实施方式中，R1是链长为5个碳的烷基，R2是羧基，并且R3是甲基。

在一些实施方式中，酵母细胞包括增加可用的焦磷酸香叶酯的遗传修饰。在一些实施方式中，遗传修饰包括Erg20酶的失活。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于Erg20K197E的编码序列，其中Erg20K197E的一级结构与由SEQID NO:3限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸与SEQ ID NO:3具有80％和100％之间的碱基序列同源性。

在一些实施方式中，酵母细胞包括增加可用的丙二酰基辅酶A的遗传修饰。在一些实施方式中，遗传修饰包括Mafl的增加的表达。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于Maf1的编码序列，其中Maf1的一级结构与由SEQ ID NO:8的碱基936至2123限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:8具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，遗传修饰包括用于增加醛脱氢酶和乙酰基辅酶A合成酶的胞质表达的修饰。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于来自肠道沙门氏菌的AcsL641P的编码序列和用于来自酿酒酵母的Ald6的编码序列，其中AcsL641P的一级结构与由SEQ ID NO:4的碱基3938至5893限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性，并且其中Ald6的一级结构与由SEQ ID NO:4的碱基1494至2999限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:4的碱基51至7114具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，遗传修饰包括用于增加丙二酰基辅酶A合成酶活性的修饰。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于来自酿酒酵母的Acc1S659A；S1167A的编码序列。在一些实施方式中，第三多核苷酸包括用于Acc1S659A；S1167A酶的编码序列，其中Acc1S659A；S1167A酶的一部分的一级结构与由SEQ ID NO:7的碱基9至1716限定的阅读框编码的蛋白质部分具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:7具有80％和100％之间的碱基序列同源性。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于由组成型启动子调节的来自酿酒酵母的Acc1的编码序列。在一些实施方式中，组成型启动子包括来自酿酒酵母的PGK1启动子。在一些实施方式中，PGK1启动子与SEQ ID NO:6的碱基7至750具有80％和100％之间的核苷酸同源性。在一些实施方式中，遗传修饰包括用于甾醇生物合成的活化剂的增加的表达。在一些实施方式中，酵母细胞包括第三多核苷酸，第三多核苷酸包括用于来自酿酒酵母的Upc2E888D的编码序列，其中Upc2E888D的一级结构与由SEQ ID NO:9的碱基975至3701限定的阅读框编码的蛋白质具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性。在一些实施方式中，第三多核苷酸进一步包括启动子序列、终止子序列和整合序列，并且与SEQ ID NO:9具有80％和100％之间的碱基序列同源性。

在一些实施方式中，第二多核苷酸包括用于胞质异戊烯基转移酶的编码序列，其中胞质异戊烯基转移酶的一级结构与下述中的任何一个具有80％和100％之间的氨基酸残基序列同源性：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36。

在一些实施方式中，方法包括从酵母细胞培养物中提取至少一个种类的植物***素或植物***素类似物。

在进一步的方面中，本文提供了用于生产植物***素或植物***素类似物的酵母细胞，酵母细胞包括：编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸；和编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸。

在一些实施方式中，酵母细胞中包括本文所述的酵母细胞、第一多核苷酸或第二多核苷酸中的一个或多个的特征。

在进一步的方面中，本文提供了转化用于生产植物***素或植物***素类似物的酵母细胞的方法。方法包括：将用于编码聚酮化合物合成酶的第一多核苷酸引入酵母细胞系中；和将用于编码胞质异戊烯基转移酶的第二多核苷酸引入酵母中。

在一些实施方式中，本文所述的酵母细胞、第一多核苷酸或第二多核苷酸中的一个或多个的特征应用于转化酵母细胞中。

在进一步的方面中，本文提供了具有下述结构II的植物***素类似物：在结构II上，R1是链长为1、2、3、4或5个碳的烷基。R2是甲基。R3是H、羧基或甲基。

在一些实施方式中，R1具有5个碳的链长并且R3是H。在一些实施方式中，植物***素类似物通过酵母中的生物合成生产。

在进一步的方面中，本文提供了具有下述结构III的植物***素类似物：

在结构III上，R1是戊基；R2是甲基；并且R3是H。

通过结合附图阅读下述

具体实施方式

的描述时，本公开的其他方面和特征将对于本领域普通技术人员变得显而易见。

附图说明

现在将参考附图仅通过实施例的方式描述本公开的实施方式。

图1是在***中橄榄醇酸和具有不同烷基链长度的相关化合物的生物合成的示意图；

图2是在***中由己酸、丙二酰基辅酶A和焦磷酸香叶酯生物合成CBGa的示意图；

图3是在***中由CBGa生物合成酸形式的下游植物***素的示意图；

图4是在转化的酵母细胞中通过OAS和AltPT生物合成CBG的示意图；

图5是在转化的酵母细胞中由CBG生物合成下游植物***素的示意图；

图6是在转化的酵母细胞中由DiPKS和AltPT生物合成meCBG的示意图；

图7是在转化的酵母细胞中由meCBG生物合成下游甲基化的植物***素类似物的示意图；

图8是在转化的酵母细胞中由meCBG生物合成下游甲基化的植物***素类似物的示意图；

图9是DiPKS中的功能结构域的示意图，其具有用于降低橄榄醇的甲基化的C-甲基转移酶的突变；

图10是在转化的酵母细胞中通过DiPKS^{G1516D；G1518A}和AltPT生物合成meCBG和CBG的示意图；

图11是在转化的酵母细胞中通过DiPKS^G1516R和AltPT生物合成CBG的示意图；

图12显示了在不同浓度的己酸下酿酒酵母的生长；

图13显示了在引入己酸之前和之后的酿酒酵母生长和橄榄醇生产；

图14显示了在引入己酸之前和之后的酵母生长和CBG生产；

图15显示了在引入己酸之前和之后的酵母生长和酿酒酵母中的己酸消耗；

图16显示了在酿酒酵母中，***膜结合的异戊烯基转移酶和AltPT的胞质表达。

图17显示了在酿酒酵母中，用***OAS和AltPT生产CBG以及用DiPKS和AltPT生产meCBG；

图18显示了通过DiPKS生产甲基橄榄醇，以及通过DiPKS^{G1516D；G1518A}生产甲基橄榄醇和橄榄醇二者；

图19显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKS生产甲基橄榄醇；

图20显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKS生产甲基橄榄醇；

图21显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过AltPT生产meCBG；

图22显示了在两个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKS生产甲基橄榄醇以及通过DiPKS^G1516R生产甲基橄榄醇和橄榄醇二者；

图23显示了在三个单独的酿酒酵母菌株中通过DiPKS^G1516R生产橄榄醇；和

图24显示了在三个酿酒酵母菌株中通过***OAS和AltPT生产CBG，通过DiPKS和AltPT生产meCBG，以及通过DiPKS^G1516R和AltPT生产CBG。

具体实施方式

大体上，本公开提供了用于生产在***植物中天然生物合成的植物***素和由甲基橄榄醇生物合成的甲基化的植物***素类似物的方法和酵母细胞系。植物***素和植物***素类似物在转基因酵母中生产。本文提供的方法和细胞系包括应用***植物中不存在的酶的基因。应用在***植物中编码在生物合成途径中得至植物***素的酶的完整的基因组之外的基因，可提供一种或多种益处，包括在不用投入对于酿酒酵母和其他种类的酵母有毒的己酸的情况下生物合成脱羧的植物***素、生物合成甲基化的植物***素类似物和生物合成植物***素。

如本文所用的修饰语“脱羧的”是指在Δ9-四氢***酚(“THC”)的例如第2位或第4位处，或在其他植物***素或类似物中与橄榄醇酸(其是***中生物合成***萜酚酸(“CBGa”)的前体)的4位相对应的等同位置处缺乏酸基的植物***素或植物***素类似物的形式。在***中，酸形式的植物***素由橄榄醇酸生物合成。当酸形式的植物***素被加热时，植物***素的芳环与羧基之间的键断裂。脱羧源自加热***中生产的羧化的植物***素，其在燃烧或加热至一般高于约110℃的温度期间迅速发生。为简单起见，如本文所用，“脱羧的”是指缺乏酸基的植物***素，无论该植物***素是包括在真正脱羧期间失去的酸基，还是在没有羧基的情况下被生物合成的。

图1显示了如在***中发生的由丙二酰基辅酶A和己酰基辅酶A的聚酮化合物缩合产物生物合成橄榄醇酸。橄榄醇酸是CBGa的代谢前体。如下面进一步详细描述的，CBGa是大量下游植物***素的前体。在大多数品种的***中，大部分植物***素是由橄榄醇酸生物合成的戊基***素，而橄榄醇酸由丙二酰基辅酶A和己酰基辅酶A以2:1的化学计量比合成。观察到了一些丙基***素，并且经常在广泛使用的三字母缩写中用“v”后缀标识(例如，四氢次***酚通常被称为“THCv”，次***二酚通常被称为“CBDv”等)。图1还显示了由丙二酰基辅酶A与正丁基辅酶A缩合来生物合成二酚酸(divarinolic acid)，其将提供下游丙基植物***素。

图1还显示了由丙二酰基辅酶A与乙酰基辅酶A的缩合来生物合成苔色酸，其可提供下游甲基植物***素。在该上下文中，术语“甲基植物***素”意思是它们的烷基侧链是甲基，其中大多数植物***素在烷基侧链上具有戊基，并且酚酸(varinnic)植物***素在烷基侧链上具有丙基。其中meCBG和其他甲基化的植物***素类似物被称为“甲基化”的上下文与“甲基植物***素”中和图1中“甲基”作为前缀的使用不同并且平行。类似地，由于橄榄醇具有限定长度的侧链(否则其将是图1中所示的另外三个聚酮化合物之一而不是“橄榄醇”)，所以甲基橄榄醇是指环上的甲基化而不是指较短的侧链。

图1还显示了由丙二酰基辅酶A与戊酰基辅酶A的缩合来生物合成2,4-二醇-6-丙基苯甲酸，其将提供下游丁基植物***素。

图2显示了在***中由己酸、丙二酰基辅酶A和焦磷酸香叶酯(“GPP”)生物合成CBGa，其包括图1中所示的橄榄醇酸生物合成步骤。己酸通过己酰基辅酶A合成酶用辅酶A活化(“Hex1；图2中的反应1)。OAS(也称为橄榄醇酸合成酶，但是合成橄榄醇而不是橄榄醇酸)和OAC一起催化由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A生产橄榄醇酸(图2中的反应2)。异戊烯基转移酶将橄榄醇酸与GPP组合，提供CBGa(图2中的步骤3)。

图3显示了在***中由CBGa生物合成下游酸形式的植物***素。CBGa通过THCa合成酶被氧化环化成Δ9-四氢***酚酸(“THCa”)。CBGa通过CBDa合成酶氧化环化成***二酚酸(“CBDa”)。通过其他合成酶或通过以影响针对所生产的植物***素结构的酶活性的方式改变植物细胞中的条件，也在***中合成其他植物***素，比如***色烯酸(“CBCa”)、***伊索因酸(cannabielsoinic acid)(“CBEa”)、异-四氢***酚酸(“异-THCa”)、***环酚酸(“CBLa”)或***西川酸(“CBTa”)。这些一般的植物***素类型中的每一种的酸形式显示在图3中，其中通用的“R”基团显示烷基侧链，在由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A合成橄榄醇酸的情况下其将是5碳链。在某些情况下，可替换地在与图3所示的R基团位置相对的环位置上出现羧基(例如，THC的4位而不是图3所示的2位等)。图3所示的脱羧形式的植物***素分别为THC、***二酚(“CBD”)、***色烯(“CBC”)、***伊索因(“CBE”)、异-四氢***酚(“异-THC”)、***环酚(“CBL”)或***西川(“CBT”)。

Poulos等人的美国公开号2016/0010126描述了酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母中的五种天然的***基因的表达。用于生产植物***素的来自酵母中天然的***途径的基因的表达可能带来缺点。***OAS使用己酰基辅酶A作为聚酮化合物底物。己酸对于酿酒酵母和一些其他酵母菌株有毒。此外，由橄榄醇酸合成CBGa需要膜结合的***异戊烯基转移酶，其在真菌中的表达较差。

本文提供的用于生产植物***素和植物***素类似物的方法和酵母细胞可应用和包括用来自链霉菌属CL 190的异戊烯基转移酶NphB的基因转化的酿酒酵母。链霉菌属CL190NphB异戊烯基转移酶为***异戊烯基转移酶提供了替代方案，并在下文称为“AltPT”。AltPT是αββα(“ABBA”)型异戊烯基转移酶。AltPT是高度混杂的，接受大部分聚酮化合物作为用于异戊烯化的底物。AltPT针对作为萜类化合物供体的GPP是特异的。AltPT是在链霉菌属CL 190(***)中表达的胞质酶，相对照，膜结合的异戊烯基转移酶在***(植物)中表达。细菌胞质酶在酵母中的表达水平高于植物膜结合成酶。AltPT将橄榄醇酸异戊烯化为CBGa，类似于在***中被膜结合的异戊烯基转移酶催化的反应。AltPT还将橄榄醇异戊烯化为***萜酚(“CBG”)，或将甲基橄榄醇异戊烯化为甲基***萜酚(“meCBG”)。针对酵母密码子优化的AltPT的合成序列在此包括在SEQ ID NO:1中。AltPT的完整编码DNA序列(“CDS”)可在NCBI GenBank在线数据库获得，登录号为NCBI-AB187169。

图4显示了在转基因酵母中用于由己酸、丙二酰基辅酶A和GPP生产CBG的生物合成途径。如图4所示的本文提供的用于生产CBG的酵母菌株可包括用于编码链霉菌属CL190AltPT、***Hex1和***OAS的基因。这样的酵母菌株的实施例以“HB37”和“HB88”提供，其中的每个描述在表7中。

图5显示了由CBG生物合成下游植物***素。CBG被氧化环化成THC、CBD、CBC、CBE、异-THC、CBL或CBT。这些一般的植物***素类型中的每一种的脱羧形式显示在图5中，其中通用的“R”基团显示烷基侧链，其在由橄榄醇生物合成的植物***素中将是5碳链。

图4显示了通过Hex1由己酸生产己酰基辅酶A。通过Hex1，用辅酶A将己酸活化(图4中的反应1)。OAS催化由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A生产橄榄醇(图4中的反应2)。AltPT将橄榄醇酸与GPP缩合，提供CBG(图4中的反应3)。

图4中所示的途径包括***HEx1和***OAS。图4中所示的途径不包括***OAC。用于实施图4的途径的转基因酵母细胞将相应地包括用于OAS的基因，但不包括用于***OAC的基因。在橄榄醇酸的生物合成期间，***OAC将橄榄醇羧化为橄榄醇酸。在存在OAS且不存在OAC或其他聚酮化合物环化酶的情况下，生产橄榄醇而不是在***中生产的橄榄醇酸。结果，被AltPT催化的反应得到CBG而不是CBGa。接着，生产植物***素的下游反应将相应地生产脱羧种类的植物***素，包括

图5中的植物***素，而在也存在OAC或另一种聚酮化合物环化酶的情况下(比如在***中)，将生产酸形式的植物***素，包括图3中的植物***素。

在图4的反应2中的由OAS催化的己酰基辅酶A转化为橄榄醇被确认为图4途径中的代谢瓶颈。为了增加图4的反应2的产量，功能性筛选了多种酶，并且确认了一种酶，来自盘基网柄菌的称为“DiPKS”的聚酮化合物合成酶，其可直接由丙二酰基辅酶A生产甲基橄榄醇。针对酵母密码子优化的DiPKS的合成序列在此包括在SEQ ID NO:2中。DiPKS的CDS可在NCBI GenBank在线数据库中获得，登录号为NC_007087.3。

图6显示了在转基因酵母中用于由丙二酰基辅酶A和GPP生产meCBG的生物合成途径。如图6所示的本文提供的用于生产CBG的酵母菌株可包括用于AltPT的基因和用于DiPKS的基因(其支持仅由丙二酰基辅酶A生产聚酮化合物)，在培养基中不需要己酸。DiPKS包括与在脂肪酸合成酶中发现的结构域类似的功能结构域、甲基转移酶结构域和Pks III结构域(见图9)。包括编码野生型DiPKS基因的密码子优化的合成序列的酵母菌株的实施例被提供为“HB84”、“HB90”和“HB105”，其各自描述在表7中。

图6显示了由被DiPKS催化的丙二酰基辅酶A生产甲基橄榄醇(图6中的反应1)。AltPT以GPP作为异戊烯基团供体将甲基橄榄醇异戊烯化，提供meCBG(图6中的反应2)。应用DiPKS而不是OAS，促进了植物***素和植物***素类似物的生产，而不需要补充己酸。由于己酸对酿酒酵母有毒，因此在CBG或meCBG的生物合成途径中消除己酸的需求可提供相比表达OAS和Hex1的酵母细胞中的CBG的产量更大的CBG或meCBG的产量。

图7和图8显示了对应于甲基-四氢***酚(“meTHC”)、甲基-***二酚(“meCBD”)、甲基-***色烯(“meCBC”)、甲基-***伊索因(“meCBE”)、异甲基-四氢***酚(“异-meTHC”)、甲基-***环酚(“meCBL”)或甲基-***西川(“meCBT”)的下游甲基化的植物***素类似物，它们分别是THC、CBD、CBC、CBE、异-THC、CBL和CBT的甲基化类似物，当提供甲基橄榄醇而不是橄榄醇酸或橄榄醇作为前体化学物质时可制备它们。这些甲基化的植物***素类似物中的每一种的脱羧形式示于图7和图8中，其中通用的“R”基团显示烷基侧链，其在由己酰基辅酶A和丙二酰基辅酶A或只有丙二酰基辅酶A使得合成的情况下是5碳链。

除了meCBD之外，图7和图8中所示的每种下游植物***素类似物的结构的一部分包括与芳环键合的旋转受限基团。结果，除了meCBD之外的图7和图8中所示的每种下游植物***素类似物可由以两种旋转异构体之一的meCBG合成。取决于合成期间meCBG的旋转异构体，所得环化的甲基化的植物***素类似物中的甲基可在针对图7中的meTHC、meCBC、meCBE、异-meTHC、meCBL或meCBT的异构体所示的位置处，或针对图8中的meTHC、meCBC、meCBE、异-meTHC、meCBL或meCBT的异构体所示的位置处。本文参考meTHC、meCBC、meCBE、异-meTHC、meCBL或meCBT包括图7和图8中所示的异构体之一或二者。

DiPKS包括C-甲基转移酶结构域，其在芳环上的4位处使橄榄醇甲基化。结果，AltPT使甲基橄榄醇异戊烯化，得到meCBG，一种植物***素类似物，而不是已知在***中合成的CBGa。可能生产植物***素的任何下游反应当使用CBGa或CBG作为投入时将相应地生产图7和图8所示的甲基化的植物***素类似物的脱羧种类，而在***中生产未甲基化的酸形式的植物***素(如图3中)。如果包括OAC或另一种聚酮化合物环化酶，则甲基橄榄醇可通过OAC或其他聚酮化合物环化酶转化为meCBGa，因为甲基化和羧化碳可在不同的位置上。例如，由meCBG合成的meTHC可在碳4处甲基化，并且可羧化成甲基-四氢***酚酸(“meTHCa”)，其中THCa的羧基可在2位。可选地，由meCBG合成的meTHC可在碳2处甲基化，在该情况下，THCa的羧基可在4位。在***中观察到的THCa的羧基在2位或4位。

图9是DiPKS的功能结构域的示意图，显示了β-酮酰基-合成酶(“KS”)、酰基转乙酰基酶(“AT”)、脱水酶(“DH”)、C-甲基转移酶(“C-Met”)、烯酰还原酶(“ER”)、酮还原酶(“KR”)和酰基载体蛋白(“ACP”)。“TYPE III”结构域是3型聚酮化合物合成酶。KS、AT、DH、ER、KR和ACP部分提供通常与脂肪酸合成酶相关的功能，显示DiPKS是FAS-PKS蛋白。C-Met结构域为在碳4处甲基化橄榄醇提供催化活性。

图9中划掉了C-Met结构域，示意性地说明了对DiPKS蛋白的修饰，其使C-Met结构域失活并减轻或消除甲基化功能。TYPE III结构域催化迭代的聚酮化合物延伸和从ACP转移到TYPE III结构域的己酸硫酯的环化。

图10显示了在转基因酵母中由丙二酰基辅酶A和GPP生产meCBG和CBG二者的生物合成途径。如图10所示，本文提供的用于生产CBG和meCBG二者的酵母菌株可包括用于AltPT的基因和用于如图9示意性示出的在C-Met结构域处具有降低活性的突变DiPKS的基因。DiPKS蛋白的C-Met结构域包括DiPKS的氨基酸残基1510至1633。C-Met结构域包括三个基序。第一基序包括残基1510至1518。第二基序包括残基1596至1603。第三基序包括残基1623至1633。破坏这三个基序中的一个或多个可使得C-Met结构域处的活性降低。

表达在C-Met结构域中具有降低的活性的修饰的DiPKS的酵母菌株的例子在下面的实施例V中提供为“HB80A”。HB80A包括编码野生型DiPKS蛋白的酵母-密码子优化基因的修饰。HB80A包括DiPKS基因的修饰，使得DiPKS蛋白在C-Met结构域的第一基序中被修饰。由于对DiPKS基因的这些修饰，DiPKS蛋白具有Gly1516Asp和Gly1518Ala的替换。HB80A仅包括DiPKS^{G1516D；G1518A}而不包括AltPT，结果仅催化图10的步骤1A和1B，而不催化反应2A和2B。HB80A生产甲基橄榄醇和橄榄醇。可修饰HB80A菌株以包括AltPT，比如通过用pAltPT质粒转化HB80A(见表6)。

图10显示了由丙二酰基辅酶A生产甲基橄榄醇(图10中的反应1A)和由丙二酰基辅酶A生产橄榄醇(图10中的反应1B)二者。反应1A和1B各自被DiPKS^{G1516D；G1518A}催化。Gly1516Asp和Gly1518Ala替换在C-Met结构域的活性位点中，并且减少了DiPKS^{G1516D；G1518A}对橄榄醇环的4位上的甲基化的催化作用，允许一部分投入的丙二酰基辅酶A根据反应1B而不是反应1A被催化。AltPT，一种混杂的ABBA异戊烯基转移酶，催化甲基橄榄醇与GPP以及橄榄醇与GPP的异戊烯化二者。接着生产meCBG(图10中的反应2A)和CBG(图10中的反应2B)二者。然后，生产其他植物***素的任何下游反应将相应地生产甲基化的植物***素类似物的混合物和在CBG的芳环上的4位(或下游植物***素中的相应位置)处没有官能团的种类，而在***中将生产酸形式。

图11显示了在转基因酵母中由丙二酰基辅酶A和GPP仅生产CBG的生物合成途径。如图11所示，本文提供的用于仅生产CBG的酵母菌株可包括用于AltPT的基因和用于如图9中示意性示出的在C-Met结构域处具有降低活性的突变DiPKS基因。

表达在C-Met结构域中基本上没有活性的修饰的DiPKS的酵母菌株的例子在下面的实施例VIII、IX和X中提供为“HB135”、“HB137”、“HB138”和“HB139”。HB135、HB137、HB138和HB139各自包括编码野生型DiPKS蛋白的酵母-密码子优化基因的修饰。HB135、HB137、HB138和HB139各自包括DiPKS基因的修饰，使得DiPKS蛋白在C-Met结构域的第一基序中被修饰。由于这种对DiPKS基因的修饰，DiPKS蛋白具有Gly1516Arg的替换。

DiPKS^G1516R催化图11中的反应1。Gly1516Arg替换在C-Met结构域的活性位点上，并且减少DiPKS^G1516R对橄榄醇环的4位上的甲基化的催化作用。根据图11的反应1催化投入的丙二酰基辅酶A。HB139还包括AltPT，并且随后生产橄榄醇和CBG(图11中的反应2)。然后，生产其他植物***素的任何下游反应将相应地生产在CBG的芳环上的4位或下游植物***素中的相应位置上没有官能团的植物***素种类，而在***中将生产酸形式。

增加生物合成前体的可用性

图4、6、10和11中显示的生物合成途径各自需要丙二酰基辅酶A和GPP以分别生产CBGa、CBG或meCBG。除了引入聚酮化合物合成酶(比如OAS或DiPKS)，并且除了引入胞质异戊烯基转移酶(比如AltPT)以外，可使酵母细胞突变，可引入来自其他种类的基因，可上调或下调基因，或以其他方式对酵母细胞进行基因修饰，来增加丙二酰基辅酶A、GPP或支持图4、6、10和11中任一个的生物合成途径所需的其他投入代谢物的可用性。

可修饰酵母细胞，以增加可用的GPP。酿酒酵母可在Erg20或其他支持消耗GPP的代谢途径的酶的基因中具有一个或多个其他突变。Erg20催化酵母细胞中的GPP生产。Erg20还向GPP添加一个3-异戊基焦磷酸(“IPP”)的亚单元，得到焦磷酸法呢基酯(“FPP”)，一种用于下游倍半萜和甾醇生物合成的代谢物。已经证实了Erg20中的一些突变减少GPP转化成FPP，增加细胞中可用的GPP。Erg20中的替换突变Lys197Glu降低了Erg20将GPP转化成FPP。如下表4中所示，所有修饰碱基的菌株表达Erg20^K197E突变蛋白(“HB42”、“HB82”、“HB100”、“HB106”和“HB110”)。类似地，基于HB42、HB82、HB100、HB106或HB110中的任一个的每个修饰的酵母菌株包括编码整合至酵母基因组中的Erg20^K197E突变体的整合多核苷酸。SEQ ID NO:3是编码Erg20^K197E蛋白的CDS和用于同源重组的侧翼序列。

可修饰酵母菌株用于增加可用的丙二酰基辅酶A。降低的线粒体乙醛分解代谢使得乙醛从乙醇分解代谢转向乙酰基辅酶A生产，这进而驱动丙二酰基辅酶A和下游聚酮化合物和萜类化合物的生产。可修饰酿酒酵母以表达来自肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)的在残基641处具有亮氨酸至脯氨酸的替换修饰的乙酰基辅酶A合成酶(“Acs^L641P”)和来自酿酒酵母的醛脱氢酶6(“Ald6”)。Leu641 Pro突变去除了Acs的下游调节，与野生型Acs相比，Acs^L641P突变体具有更高的活性。这两种酶的胞质表达一起增加了胞质中乙酰基辅酶A的浓度。胞质中较大的乙酰基辅酶A浓度使得线粒体分解代谢降低，绕过线粒体丙酮酸脱氢酶(“PDH”)，提供PDH旁路。结果，更多的乙酰基辅酶A可用于丙二酰基辅酶A生产。SEQ ID NO:4是基于pGREG质粒的质粒，并且其包括编码Ald6和SeAcs^L641P的基因的DNA序列、启动子、终止子和整合位点同源序列，该整合位点同源序列用于通过重组应用规律成簇的间隔短回文重复序列(“CRISPR”)整合至酿酒酵母基因组中的Flagfeldt-位点19处。如下表4所示(术语“PDH旁路”)，基础菌株HB82、HB100、HB106和HB110具有在TDH₃启动子下编码Ald6的SEQ ID NO:4的从碱基1494至2999的一部分，以及在Tef1_P启动子下编码SeAcs^L641P的SEQ ID NO:4的从基因3948至5893的一部分。类似地，基于HB82、HB100、HB106或HB110中的任一个的每个修饰的酵母菌株包括编码Ald6和SeAcs^L641P的多核苷酸。

用来增加胞质丙二酰基辅酶A的另一种方法是上调Acc1，Acc1是天然的酵母丙二酰基辅酶A合成酶。Acc1基因的启动子序列被PGK1基因的组成型酵母启动子替换。来自PGK1基因的启动子允许Acc1的多个拷贝存在于细胞中。天然的Acc1启动子一次仅允许蛋白质的单个拷贝存在于细胞中。天然的启动子区域显示在SEQ ID NO:5中。修饰的启动子区域显示在SEQ ID NO:6中。

除了上调Acc1的表达之外，酿酒酵母还可包括一个或多个Acc1的修饰，以增加Acc1活性和胞质乙酰基辅酶A浓度。在文献中确认了调节序列中的两个突变，其消除了Acc1的抑制，使得更高的Acc1表达和更高的丙二酰基辅酶A生产。SEQ ID NO:7是可用于通过同源重组来修饰酿酒酵母基因组的天然的Acc1基因的多核苷酸。SEQ ID NO:7包括用于具有Ser659Ala和Ser1167Ala修饰的Acc1基因的编码序列的一部分。结果，用该序列转化的酿酒酵母将表达Acc1^{S659A；S1167A}。例如，通过在任何合适的位点将序列与Tef1启动子、具有Ser659Ala和Ser1167Ala修饰的Acc1和Prm9终止子整合，可实现类似的结果。最终结果将是Tef1、Acc1^{S659A；S1167A}和Prm9的侧翼是用于促进整合至酿酒酵母基因组中的基因组DNA序列。这是在Flagfeldt位点18处尝试的，但是由于构建体的大小，接下来改为上述用SEQ ID NO:7的方法。

酿酒酵母可包括Maf1或其他tRNA生物合成调节剂的修饰表达。已经显示，过表达天然的Maf1可减少IPP对于tRNA生物合成的损失，从而提高酵母中的单萜产量。IPP是甲羟戊酸途径的中间体。SEQ ID NO:8是整合至酿酒酵母基因组中Maf1位点5处的多核苷酸，其用于在Tef1启动子下Maf1的基因组整合。SEQ ID NO:8包括Tef1启动子、天然的Maf1基因和Prm9终止子。Tef1、Maf1和Prm9一起的侧翼是用于促进整合至酿酒酵母基因组中的基因组DNA序列。如下表4所示，基础菌株HB100、HB106和HB110在Tefl启动子下表达Mafl。类似地，基于HB100、HB106或HB110中的任一个的每个修饰的酵母菌株包括含有在Tef1启动子下Maf1的编码序列的多核苷酸。

Upc2是用于酿酒酵母中甾醇生物合成的活化剂。Upc2的Glu888Asp突变增加了酵母中单萜的生产。SEQ ID NO:9是可整合至基因组中以提供在Tef1启动子下表达Upc2^E888D的多核苷酸。SEQ ID NO:9包括Tef1启动子、Upc2^E888D基因和Prm9终止子。Tef1、Upc2^E888D和Prm9一起的侧翼是用于促进整合至酿酒酵母基因组中的基因组DNA序列。

上述基因，Erg20^K197E、Acs^L641P、Ald6、Maf1、Acc1^{S659A；S1167A}或Upc2^E888D，中的任一个可从质粒表达或整合至酿酒酵母的基因组中。基因组整合可通过同源重组，包括CRISPR重组，或任何合适的方法。可类似地通过重组修饰Acc1的启动子。SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中的每一个中的编码序列和调节序列可包括在质粒中用于表达(例如pYES等)或包括在线性多核苷酸中用于整合至酿酒酵母基因组中。基础菌株HB42、HB82、HB100、HB106或HB110中的每一个包括一个或多个整合的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10(见下文)。可通过类似方法应用SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的整合。

增加的DiPKS功能

如图9所示，DiPKS包括ACP结构域。DiPKS的ACP结构域需要磷酸泛酰巯基乙胺基团作为辅因子。NpgA是来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。可将用于酿酒酵母的密码子优化的NpgA的拷贝引入酿酒酵母中并转化至酿酒酵母中，包括通过同源重组。将NpgA基因盒整合至酿酒酵母的基因组中的Flagfeldt位点14处以产生菌株HB100。整合的DNA的序列显示在SEQ ID NO:10中，并且包括Tef1启动子、NpgA编码序列和Prm9终止子。Tef1p、NpgA和Prm9t的侧翼是促进整合至酿酒酵母基因组中的Flagfeldt位点14中的基因组DNA序列。如下表4所示，基础菌株HB100、HB106和HB110包括该整合的盒。可选地，SEQ ID NO:10的碱基636至2782可包括在表达质粒上，如菌株HB98中那样。

NpgA的表达提供了构巢曲霉磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，用于将磷酸泛酰巯基乙胺基团加载到DiPKS的ACP结构域上的更大催化作用。结果，由DiPKS催化的反应(图6中的反应1)可以以更大的速率发生，提供更大量的甲基橄榄醇用于异戊烯化为meCBG。

其他异戊烯基转移酶

基于DELTA BLAST检索ABBA异戊烯基转移酶结构来限定NphB变体。通过查找适合于GPP而非IPP、二甲基烯丙基焦磷酸或其他异戊烯基的结合口袋来重新限定该列表。SEQID NO:12至SEQ ID NO:33提供了位于DELTA BLAST检索中的来自真菌和细菌的胞质异戊烯基转移酶的一级结构氨基酸残基序列。还进行了***基因组的DELTA BLAST检索，并且膜结合的异戊烯基转移酶位于这些检索中。一些***膜结合的异戊烯基转移酶在一些酵母种类中表达较差，而不会被引入本文提供的制备植物***素或植物***素类似物的酵母菌株中。

SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:36提供了位于手工文献检索中的来自真菌和细菌的胞质异戊烯基转移酶的一级结构氨基酸残基序列。SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:36分别是名为FNQ26、FNQ28、FUR7和NAPT9的胞质异戊烯基转移酶的一级结构氨基酸残基序列。

SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:36中的任一个可作为胞质异戊烯基转移酶应用于本文所述的酵母菌株。这些异戊烯基转移酶中的每一个总结在表1中。

表1：异戊烯基转移酶

DiPKS的修饰

可修饰DiPKS以降低或消除C-Met的活性。

SEQ ID NO:37是针对酵母密码子优化的DIPKS的合成序列的修饰形式，其中DiPKS包括Gly1516Asp替换和Gly1518Ala替换，其共同破坏C-met结构域的活性。下述关于包括菌株HB80A的实施例IV提供了酿酒酵母培养物中DiPKS^{G1516D，G1518A}表达的结果。可将其他修饰引入DiPKS中以破坏或消除C-Met的全部活性位点或所有C-Met。如针对野生型DiPKS所描述的，可将这些修饰的DiPKS酶中的每一个引入酿酒酵母中。

SEQ ID NO:38是针对酵母密码子优化的DIPKS的合成序列的修饰形式，其中DiPKS包括破坏C-met结构域活性的Gly1516Arg替换。下述结合包括菌株HB135的实施例VIII和包括菌株HB135、HB137和HB138的实施例IX提供酿酒酵母培养物中DiPKS^G1516R表达的结果。

除了具体地DiPKS^{G1516D，G1518A}和DiPKS^G1516R外，还将其他修饰引入DiPKS中以破坏或消除C-Met的全部活性位点或所有C-Met：(a)用GGGSGGGSG替换基序1，(b)基序1中的Gly1516Arg替换和用GGGSGGGS替换基序2，(c)Glu1634Ala，其恰好在基序3的外部并破坏C-Met结构域中活性位点处的三级结构，和(d)通过His1608Gln替换破坏C-Met结构域中的活性位点。将针对(a)至(d)中每一个的密码子优化序列引入酵母中的表达质粒上，类似于表达DiPKS^{G1516D，G1518A}和DiPKS^G1516R，引入基础菌株HB100中。在每种情况下，未观察到橄榄醇的生产。用GGGSGGGS替换基序1或基序2也消除了甲基橄榄醇的生产。在一个实施例批次中，表达DiPKS^G1634A突变体的酵母的培养物每1培养物提供2.67mg甲基橄榄醇。在一个实施例批次中，表达DiPKS^H1608N突变体的酵母的培养物每1培养物提供3.19mg甲基橄榄醇。

转化和生长酵母细胞

根据本说明书进行的方法和制备的酵母细胞的具体实施例的细节在下面作为实施例I至实施例X提供。这10个具体实施例中的每一个应用了类似的方法来构建质粒，转化酵母，定量菌株生长，和定量细胞内代谢物。下述描述10个实施例中的这些共同特征，随后是与10个实施例中的一个或多个相关的结果和其他细节。

质粒构建

被组装用来应用和制备本文提供的方法和酵母细胞的实施例的质粒显示在表2中。在表2中，对于表达质粒pYES和pYES2，SEQ ID NO 39和40分别在没有表达盒的情况下提供整个质粒。可包括SEQ ID NO:10、37、38和41至47的表达盒以制备表2中所示的质粒。SEQID NO:4是pGREG质粒，包括PDH旁路基因的盒。

表2：用于制备酵母菌株的质粒和盒

使用Eppendorf Mastercycler ep Gradient 5341根据制造商推荐的方案，用来自Operon Eurofins和Phusion HF聚合酶(ThermoFisheRF-530S)的引物通过聚合酶链反应(“PCR”)扩增用于引入酿酒酵母中的质粒。

在酿酒酵母中使用重叠DNA部分和转化辅助重组来组装所有质粒。使用如Gietz，R.D.和Schiestl，R.H.，“High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SScarrier DNA/PEG method.”Nat.Protoc.2，31–34(2007)所述的乙酸锂热激法将质粒转化至酿酒酵母中。用于组装质粒的基础酵母菌株如表3所示：

菌株	背景	修饰	注释
				HB24	-LEU	无	用于组装质粒的具有亮氨酸营养缺陷型的未修饰的酵母
HB25	-URA	无	用于组装质粒的具有尿嘧啶营养缺陷型的未修饰的酵母

表3：基础酵母菌株

将pAltPT质粒组装在HB24亮氨酸营养缺陷型中。将pNPGA、pDiPKSm1、pDiPKSm2、pGFP、pPTGFP、pAPTGFP、pH1OAS、pDiPKS、pCRISPR和pPDH质粒组装在HB25尿嘧啶营养缺陷型中。在琼脂培养皿上通过营养缺陷选择来选择转化的酿酒酵母细胞。从培养皿中回收的菌落在液体选择性培养基中于30℃下生长16小时，同时在250RPM下振荡。

在液体选择性培养基中生长后，收集转化的酿酒酵母细胞并提取质粒DNA。将提取的质粒DNA转化至大肠杆菌(Escherichia coli)中。通过在包括氨苄青霉素的琼脂培养皿上生长来选择转化的大肠杆菌。培养大肠杆菌以扩增质粒。提取在大肠杆菌中生长的质粒并用Sanger双脱氧测序进行测序以验证精确的构建。然后将序列验证的质粒用于基因组修饰或酿酒酵母的稳定转化。

酿酒酵母的基因组修饰

本文所述的酿酒酵母菌株可通过质粒的稳定转化或基因组修饰来制备。基因组修饰可通过同源重组来实现，包括通过利用CRISPR的方法。

采用应用CRISPR的方法来从酿酒酵母基因组中删除DNA并将异源DNA引入至酿酒酵母基因组中。用Benchling在线DNA编辑软件设计用于将Cas9核酸内切酶靶向至酿酒酵母基因组上期望位置的引导RNA(“gRNA”)序列。应用通过重叠延伸(“SOEing”)和PCR进行的DNA剪接来组装gRNA序列并扩增包括功能性gRNA盒的DNA序列。

将功能性gRNA盒、表达Cas9的基因盒和pYes2(URA)质粒组装至pCRISPR质粒中并转化至酿酒酵母中，用于促进靶向DNA双链切割。通过添加靶向DNA的线性片段修复所得的DNA切割。

通过同源重组将SEQ ID NO:3中所示的Erg20^K197E蛋白的CDS整合至HB13的基因组中，得到HB42基础菌株。

通过CRISPR将SEQ ID NO:4的碱基51至7114整合至HB42菌株中，以提供在酿酒酵母中具有PDH旁路基因的HB82基础菌株。在酿酒酵母中组装后，对pPDH质粒进行序列验证。序列验证的pPDH质粒在大肠杆菌中生长，纯化，并用BciV1限制酶消化。如表2中，通过BciV1消化提供了包括Ald6和SeAcs^L641P的基因、启动子、终止子和整合位点同源序列的多核苷酸，该整合位点同源序列用于整合至酿酒酵母基因组中的Cas9旁边的PDH-位点19处。通过凝胶分离纯化得到的线性PDH旁路供体多核苷酸，如SEQ ID NO:4的碱基51至7114所示。

在两个PDH旁路基因(Ald6和Acs^L641P)在单个PDH旁路多核苷酸上的情况下，将PDH旁路供体多核苷酸共转化至具有pCRISPR的酿酒酵母中。通过Gietz所述的乙酸锂热激法进行转化。pCRISPR质粒表达Cas9，其通过gRNA分子靶向至酿酒酵母基因组的选定位置。在该位置处，Cas9蛋白造成DNA中的双链断裂。PDH旁路供体多核苷酸用作CRISPR反应中的供体多核苷酸。包括Ald6、Acs^L641P、启动子和终止子的PDH旁路供体多核苷酸通过同源重组整合至基因组中的断裂位点，位点19，得到菌株HB82。

制备并扩增SEQ ID NO:10中所示的NpgA供体多核苷酸。使用DNA SOEing来从3个多核苷酸产生单个供体DNA片段用于NpgA整合。第一多核苷酸是基因组同源性的5'区域，其允许供体重组至基因组中的特定基因座处。第二多核苷酸编码NpgA基因盒。NpgA基因盒包括Tef1启动子、NpgA编码序列和Prm9终止子。第三多核苷酸包括基因组同源性的3’区域，以促进靶向整合至酿酒酵母基因组中。

将NpgA供体多核苷酸与pCRISPR质粒共转化至菌株HB82中。表达pCRISPR质粒，并通过gRNA分子将核酸内切酶Cas9靶向至酿酒酵母基因组上的位置。在该位置处，Cas9蛋白产生DNA中的双链断裂，并且通过同源重组将NpgA供体多核苷酸整合至基因组中的断裂处，以提供HB100基础菌株。

制备并扩增SEQ ID NO:8中所示的Maf1供体多核苷酸。使用DNA SOEing来从3个多核苷酸产生单个供体DNA片段，用于Maf1整合。第一多核苷酸是基因组同源性的5’区域，其允许供体重组至基因组中的特定基因座处。第二多核苷酸编码Maf1基因盒。Maf1基因盒包括Tef1启动子、Maf1编码序列和Prm9终止子。第三多核苷酸包括基因组同源性的3’区域，以促进靶向整合至酿酒酵母基因组中。

将Maf1供体多核苷酸与pCRISPR质粒共转化至菌株HB100中。可表达pCRISPR质粒，并通过gRNA分子将核酸内切酶Cas9靶向至酿酒酵母基因组上的位置。在该位置处，Cas9蛋白可产生DNA中的双链断裂，并且可通过同源重组将Maf1供体多核苷酸整合至基因组中的断裂处。Maf1供体多核苷酸的稳定转化至HB100菌株中提供了HB106基础菌株。

制备并扩增SEQ ID NO:6中所示的Acc1-PGK1p供体多核苷酸。使用DNA SOEing来从3个多核苷酸产生单个供体DNA片段，用于Acc1-PGK1整合。第一多核苷酸是基因组同源性的5’区域，其允许供体重组至基因组中的特定基因座处。第二多核苷酸编码PGK1启动子区域。第三多核苷酸包括基因组同源性的3’区域，以促进靶向整合至酿酒酵母基因组中。

将Acc1-PGK1供体多核苷酸与pCRISPR质粒共转化。表达pCRISPR质粒，并通过gRNA分子将核酸内切酶Cas9靶向至酿酒酵母基因组上的位置。在该位置处，Cas9蛋白产生DNA中的双链断裂，并且通过同源重组将Acc1-PGK1供体多核苷酸整合至基因组中的断裂处。供体多核苷酸的稳定转化至HB100菌株提供了具有由PGK1启动子调节的Acc1的HB110基础菌株。

表4提供了通过酿酒酵母的基因组修饰制备的基础菌株的总结。表4中所示的每个基础菌株是亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型，并且它们都不包括质粒。

表4：用于确认蛋白质表达和植物***素生产制备的碱基转化菌株

用于菌株构建的稳定转化

使用如Gietz所述的乙酸锂热激法将质粒转化至酿酒酵母中。

如下表5中所示，通过将表2中的质粒引入HB25中，由HB25基础菌株制备转基因酿酒酵母菌株HB1、HB6和HB7。菌株HB1、HB6和HB7用于比较酿酒酵母中***异戊烯基转移酶和AltPT的蛋白质表达水平。

菌株	基础菌株	质粒
			HB1	HB25	pGFP
HB6	HB25	pPTGFP
			HB7	HB25	pAPTGFP
HB13	HB25	pEV

表5：用于确认蛋白质表达和植物***素生产而制备的包括表达质粒的转化酵母菌株

如下表6所示，通过用表达质粒转化HB42，由HB42、HB100、HB106和HB110基础菌株制备转基因酿酒酵母HB80、HB80A、HB98、HB102、HB135、HB137和HB138，并且通过转化HB80制备HB80A。HB80、HB98和HB102各自包括和表达DiPKS。HB80A包括和表达DiPKS^{G1516D；G1518A}。HB135、HB137和HB138各自包括和表达DiPKS^G1516R。HB98包括和表达来自质粒的DiPKS和NPGa。

表6：包括表达聚酮化合物合成酶的质粒的菌株

通过用下表7中所示的表达质粒转化基础菌株，由表7中所示的基础菌株制备转基因酿酒酵母HB37、HB84、HB88、HB90、HB105和HB130。HB37和HB88各自包括和表达AltPT和OAS。HB80、HB90和HB105各自包括和表达AltPT和DiPKS。HB139包括和表达AltPT和DiPKS^G1516R。

菌株	基础菌株	质粒1	质粒2
				HB37	HB42	pAltPT	pH1OAS
HB84	HB42	pAltPT	pDiPKS
				HB88	HB82	pAltPT	pH1OAS
HB90	HB82	pAltPT	pDiPKS
				HB105	HB100	pAltPT	pDIPKS
HB139	HB106	pAltPT	pDIPKSm2

表7：包括表达胞质异戊烯基转移酶的质粒的菌株

酵母生长和饲养条件

用选择性培养基在过夜培养物中生长酵母培养物以提供起始培养物。然后将得到的起始培养物用于接种一式三份50ml培养物至光密度为在600nm处的吸收率(“A₆₀₀”)为0.1。表6显示了用于生长每种菌株的培养基的细节。

菌株	生长培养基
		HB13-HA	YNB+2％葡萄糖+1.6g/L 4DO*+0.5mM己酸
HB13-No	YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*
		HB37-HA	YNB+2％葡萄糖+1.6g/L 4DO*+0.5mM己酸
HB84-No	YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*

表8：用于酵母的生长培养基

在表8中，“4DO*”指缺乏亮氨酸和尿嘧啶的酵母合成缺失培养基补充剂。就菌株HB13而言，“HB13-HΑ”指在存在0.5mM己酸的情况下生长的HB13，并且“HB13-No”指在不存在己酸的情况下生长的HB13。在表8中，“YNB”是包括表9的前两列中列出的化学物质的营养肉汤。表9的第3和第4列中列出的化学物质包括在4DO*补充剂中。

表9：YNB营养肉汤和4DO*补充剂

代谢物的定量

使用甲醇提取从酿酒酵母细胞中提取细胞内代谢物。将1mL液体培养物以12,000×g离心3分钟。将250μl所得上清液用于细胞外代谢物定量。将得到的细胞团块悬浮于200μl的-40℃80％甲醇中。使混合物起旋涡并在冰上冷却10分钟。在冰上冷却10分钟后，将混合物在15,000×g，4℃下旋转14分钟。收集所得上清液。将另外200μl的-40℃80％甲醇加入至细胞碎片团块中，并且使混合物起旋涡并在冰上冷却10分钟。在冰上冷却10分钟后，将混合物在15,000×g，4℃下离心14分钟。将得到的200μl上清液加入到之前收集的200μl上清液中，提供总共400μl的80％甲醇和细胞内代谢物。

使用高效液相色谱(“HPLC”)和质谱(“MS”)方法定量细胞内代谢物。使用连接至ThermoFinnigan LTQ质谱仪的Agilent 1260自动进样器和HPLC系统。HPLC系统包括ZorbaxEclipseC18 2.1μm×5.6mm×100mm柱。

使用自动进样器将代谢物注入至10μl样品中，并在HPLC上使用1ml/min的流速分离。HPLC分离方案总共20分钟，其中(a)0-2分钟，98％溶剂A和2％溶剂B；(b)2-15分钟，达到98％溶剂B；(c)15-16.5分钟处于98％溶剂B；(d)16.5-17.5分钟达到98％A；和(e)在98％溶剂A下最终平衡2.5分钟。溶剂A是MS水中的乙腈+0.1％甲酸，并且溶剂B是MS水中的0.1％甲酸。

HPLC分离后，通过电喷雾电离将样品注入至质谱仪中并以正模式分析。毛细管温度保持在380℃。管透镜电压为30V，毛细管电压为0V，并且喷射电压为5kV。在HPLC-MS/MS后，CBG分析为母离子在317.2处且子离子在193.1处，而meCBG分析为母离子为331.2。类似地，在HPLC-MS/MS后，橄榄醇分析为母离子在181.2处且子离子在111处，而甲基橄榄醇分析为母离子在193.2处且子离子在125处。

注入不同浓度的已知标准品以产生线性标准曲线。CBG和meCBG的标准品购自Toronto Research Chemicals。meCBG是根据要求定制的，因为Toronto ResearchChemicals在被要求该标准品之前没有合成过该化学物质。橄榄醇和甲基橄榄醇标准品购自Sigma Aldrich。

己酸对酿酒酵母生长的影响

编码己酸生物合成所需的酶的基因未引入酿酒酵母中。而是，在包括OAS基因的酵母细胞，比如HB37中，将己酸包括在生长培养基中。

图12显示了己酸补充对酿酒酵母生长的影响。HB13在YNB+2％葡萄糖+1.6g/L4DO*+0.5mM己酸中培养。在培养36小时时加入己酸。分别以0、0.5、1.0和3.0mM的浓度将己酸加入到培养样品中。己酸对酿酒酵母有毒。在存在己酸的情况下观察到了生长减少。酿酒酵母生长减少的程度对应于生长培养基中己酸的浓度。培养物悬浮液的A₆₀₀值定量了生长速率，其在图12中显示为0、0.5、1.0和3.0mM的己酸浓度。

在存在0.5mM己酸的情况下，HB13和HB37生长96小时，其中在24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时和96小时的点取样。在不存在己酸的情况下，生长HB13和HB84，并且在72小时采取单个时间点。在两个实验中都使用HB13作为对照。上面结合表8和9描述了生长培养基。

时间点	HB13-HA	HB13-No	HB37-HA	HB84-No
					24小时	5.33	(无数据)	3.33	(无数据)
36小时	5.80	(无数据)	3.43	(无数据)
					48小时	4.67	(无数据)	3.33	(无数据)
60小时	6.07	(无数据)	3.53	(无数据)
					72小时	8.96	10.7	4.48	6.9
84小时	7.23	(无数据)	4.13	(无数据)
					96小时	8.28	(无数据)	4.33	(无数据)

表10：HB13和HB37(0.5mM己酸)和HB13和HB84(无己酸)生长

如表10中所示，HB84生长快于HB37。此外，HB84不需要己酸来生产meCBG，而HB37需要己酸来生产CBG。类似地，与存在0.5mM己酸相比，HB13在不存在己酸的情况下在72小时显示出更好的生长，与图12中显示的数据一致。

图13至15各自显示表10中列出的HB37培养物的A₆₀₀值(具有三角形数据点的虚线)。另外，图13至15中的每一个显示具有圆形数据点的实线的另一数据系列。

图13以具有圆形数据点的实线显示了橄榄醇产量(μg橄榄醇/L培养基)。

图14以具有圆形数据点的实线显示了CBG产量(μgCBG/L培养基)。

图15以具有圆形数据点的实线显示了培养物中存在的己酸(mg己酸/L培养基)。

图13至15一起与在50和60小时之间发生的二次转变(dioxic shift)一致。二次转变包括从葡萄糖分解代谢到乙酸和乙醇分解代谢的代谢转变。利用二次转变，许多次级代谢途径变得更加活跃，并且AltPT和OAS活性类似地增加。

图12至15和表10显示了与下述一致的数据：通过消耗己酸生产植物***素似乎没有在很大程度上减轻己酸毒性，直到在50和60小时之间己酸水平下降，然后继续下降。如图12和13中所示，从引入己酸开始生产橄榄醇和CBG。然而，当生产CBG并且己酸转化为橄榄醇时，培养物的A₆₀₀随着橄榄醇和CBG的生产没有大幅度增加。如图15所示，仅在50和60小时之间己酸开始耗尽之后A₆₀₀才增加。耗尽至少部分由于橄榄醇生产。然而，在36小时引入己酸后生产橄榄醇和CBG期间没有观察到培养物A₆₀₀显著增加，直至己酸浓度耗尽。

胞质和膜结合的异戊烯基转移酶的表达

***异戊烯基转移酶是膜结合植物蛋白，而AltPT是胞质细菌蛋白。在酿酒酵母中应用AltPT而不是***异戊烯基转移酶在酵母细胞中提供更高的蛋白质表达水平。表5中所示的HB1、HB6、HB7和HB13各自在YNB、2％葡萄糖和1.6g/L 4DO*中生长过夜。在生长过夜后，将所得培养物归一化至1.0A₆₀₀，然后在YNB、2％葡萄糖和1.6g/L 4DO*中生长4小时。使用BDAcuri C6流式细胞仪测量每个培养物悬浮液的荧光。

HB1表达绿色荧光蛋白(“GFP”)。HB6和HB7各自表达GFP-异戊烯基转移酶融合蛋白。HB6和HB7都不包括来自pDiPKS或pH1OAS质粒的基因。相应地，HB6和HB7都不表达聚酮化合物合成酶基因或都不包括实现图4、6或9中任何一个中的生物合成途径的所有酶。

图16显示了来自HB13(“阴性”)、HB1(“阳性”)、HB6(“异戊烯基转移酶_***”)和HB7(“异戊烯基转移酶_Alt”)的细胞培养物样品的平均荧光水平。荧光水平对应于蛋白质表达水平，显示HB6的***异戊烯基转移酶和HB7的AltPT的相对表达水平。普通膜结合的***异戊烯基转移酶在酿酒酵母的胞质中具有低的表达。胞质AltPT在酿酒酵母的胞质中的表达水平高于普通膜结合的***异戊烯基转移酶。

实施例I

如上表7中所述的酵母菌株HB37在YNB+2％葡萄糖+1.6g/L 4DO*+0.5mM己酸培养基中培养。观察到了由葡萄糖和己酸生产CBG，表明在酵母中直接生产CBG。

用0.85mM己酸以10μg/L的浓度生产CBG。在优化己酸进料和生长条件后，用0.5mM己酸生产50μg/L的CBG。

实施例II

如上表7中所述的酵母菌株HB84在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产meCBG，表明在没有己酸的情况下，在酵母中直接生产meCBG。生产的meCBG为42.63mg/L。与HB37的CBG产量相比，HB84生产的meCBG产量增加了近1,000倍。

图17显示了实施例I中由HB37的CBG(“CBG_C_sativa”)的产量相比于实施例II中由HB84的meCBG(“HB_CBG_me”)的产量。

实施例III

如上表6中所述的酵母菌株HB80在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产甲基橄榄醇，表明在酵母中直接生产甲基橄榄醇而不转化为meCBG，因为HB80缺乏AltPT。生产的甲基橄榄醇的浓度为3.259mg/L。在包括HB80的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如HB139中将预期发生转化为meCBG。

实施例IV

如上表6中所述的酵母菌株HB80A在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由DiPKS^{G1516D；G1518A}催化，由棉子糖和半乳糖生产橄榄醇和甲基橄榄醇二者。该数据表明了在没有己酸的情况下，在酵母中直接生产橄榄醇和甲基橄榄醇二者。由于HB80A缺乏AltPT，因此未发生转化为CBG和meCBG。在包括HB80A的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如通过用pAltPT转化HB80A中将预期发生转化为CBG和meCBG。

图18显示来自实施例III的由HB80生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB80”)的浓度和HB80A生产的橄榄醇和甲基橄榄醇(分别为“甲基橄榄醇HB80A”和“橄榄醇HB80A”)的浓度。在72小时对培养物取样。HB80A主要生产甲基橄榄醇(每L培养物1.4mg甲基橄榄醇，相比于每L培养物0.010mg橄榄醇)，并且生产的甲基橄榄醇和橄榄醇总量少于HB80生产的甲基橄榄醇(3.26mg/L)。

实施例V

如上表6中所述的酵母菌株HB98在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由DiPKS催化，由棉子糖和半乳糖生产甲基橄榄醇。该数据表明，与实施例III中所述的HB80相比，甲基橄榄醇的产量增加，并且也是在不包括己酸的情况下。由于HB80A缺乏AltPT，因此未发生转化为meCBG。在包括HB98的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如通过用pAltPT转化HB98或用pNPGa转化的HB84中将预期发生转化为meCBG。

图19显示来自实施例III的HB80生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB80”)的浓度和来自实施例V的HB98生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB98”)的浓度。在72小时对培养物取样。HB98生产29.85mg/L甲基橄榄醇，而HB80每L培养物仅生产3.26mg甲基橄榄醇。HB98生产的甲基橄榄醇几乎是HB80的10倍。

实施例VI

如上表6中所述的酵母菌株HB102在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产甲基橄榄醇，表明与HB98菌株相比，甲基橄榄醇在酵母中的增加的产量为42.44mg/L，而HB98仅生产29.85mg/L甲基橄榄醇。这表明NpgA的基因整合形式是起作用的。由于HB102缺乏AltPT，因此未发生转化为meCBG。在包括HB102的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株，比如HB105中将预期发生转化为meCBG。

图20显示了与实施例V中来自菌株HB98的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB98”)的生产相比，来自实施例VI的HB102生产的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB102”)的浓度。

实施例VII

如上表7中所述的酵母菌株HB105在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了以66.3mg/L的滴度由棉子糖和半乳糖生产meCBG，表明与HB84的CBG的产量相比，增加的meCBG的生产。这表明了PDH旁路和整合的NpgA对meCBG滴度的积极作用。

图21显示了与实施例II中来自菌株HB84的meCBG(“甲基_CBG HB84”)生产相比，来自实施例VII的HB105生产的meCBG(“甲基_CBG HB105”)的滴度。

实施例VIII

将如上表6中所述的酵母菌株HB135在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖生产橄榄醇，表明在不含任何己酸的酵母中且以49.24mg/L的高滴度生产橄榄醇，且不生产甲基橄榄醇。这与由菌株HB102的甲基橄榄醇产量相当，表明DIPKS的突变对于生产橄榄醇而不是甲基橄榄醇有效。由于HB135缺乏AltPT，因此未发生转化为CBG和meCBG。在包括HB135的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株中将预期发生转化为CBG和meCBG。

图22显示了与实施例VI中来自菌株HB102的甲基橄榄醇(“甲基橄榄醇HB102”)的生产相比，来自实施例VIII的HB135生产的橄榄醇和甲基橄榄醇(分别为“甲基橄榄醇HB135”和“橄榄醇HB135”)的浓度。

实施例IX

如上表6中所述的酵母菌株HB137和HB138在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L4DO*培养基中培养。在两个菌株中均观察到了由棉子糖和半乳糖生产橄榄醇。菌株HB137生产61.26mg/L的橄榄醇，并且菌株HB138生产74.26mg/L的橄榄醇，表明Mafl整合和Acc1-启动子交换对橄榄醇滴度的积极作用。由于HB137和HB138缺乏AltPT，因此未发生转化为CBG。在包括HB137和HB138的特征和AltPT或另一种异戊烯基转移酶的菌株中将预期发生转化为CBG。

图23显示了与相比于实施例VIII中由HB135生产的橄榄醇(“橄榄醇HB135”)的浓度相比，来自实施例IX的HB137生产的橄榄醇(“橄榄醇HB137”)的浓度和HB138生产的橄榄醇(“橄榄醇HB138”)的浓度。

实施例X

如上表7中所述的酵母菌株HB139在YNB+2％棉子糖+2％半乳糖+1.6g/L 4DO*培养基中培养。观察到了由棉子糖和半乳糖以0.03mg/L的滴度直接生产CBG。这远小于菌株HB105生产的meCBG的滴度。

图24显示了与来自实施例VII的HB105的meCBG(“meCBG HB105”)的产量和在实施例I中HB37的CBG(“CBG HB37”)的产量相比，来自实施例X的HB139由半乳糖和棉子糖直接生产的CBG(“CBG HB139”)的浓度。

参考文献

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序列

下述序列以电子方式随本申请提交，但也包括在此。

只是实施例

在前面的描述中，出于解释的目的，阐述了许多细节以便提供对实施方式的透彻理解。然而，对于本领域技术人员将明显的是这些具体细节不是必须的。

上述实施方式仅期望作为实施例。在不背离仅由本文所附权利要求限定的范围的情况下，本领域技术人员可对特定实施方式进行变更、修改和变化。

序列表

<110> 海牙森生物公司

<120> 用于在酵母中产生植物***素和植物***素类似物的方法和细胞系

<130> PAT 85146W-90

<150> US 62/460,526

<151> 2017-02-17

<160> 47

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 927

<212> DNA

<213> 天蓝色链霉菌属190

<400> 1

atgtctgaag ccgctgatgt cgaaagagtt tacgccgcta tggaagaggc cgctggtttg 60

ttgggtgttg cctgtgctag agacaagatt tacccattgt tatccacctt ccaagatact 120

ttggttgaag gtggttctgt tgtcgttttc tctatggcct ccggtagaca ctccaccgaa 180

ttggacttct ctatttctgt tccaacttct catggtgatc catacgccac tgtcgttgaa 240

aagggtttat ttcctgctac tggtcaccca gttgacgatt tgttagctga cactcaaaag 300

cacttacctg tttctatgtt cgctattgac ggtgaagtta ccggtggttt caaaaagact 360

tacgccttct tcccaactga caatatgcca ggtgttgctg aattgtctgc tatcccatcc 420

atgccaccag ccgttgccga gaatgctgaa ttgttcgctc gttatggttt ggacaaggtc 480

caaatgacct ccatggacta caagaaaaga caagtcaact tgtatttctc cgaattgtct 540

gctcaaactt tagaagccga atctgttttg gctttggtta gagaattagg tttgcacgtt 600

ccaaacgaat tgggtttgaa gttttgtaaa cgttctttct ctgtttatcc aactttgaac 660

tgggaaaccg gtaaaatcga cagattgtgc ttcgctgtca tctctaacga cccaaccttg 720

gtcccatcct ccgatgaagg tgatatcgaa aagttccaca actacgccac taaggctcct 780

tacgcttacg tcggtgagaa acgtaccttg gtctatggtt tgactttatc cccaaaggag 840

gaatactaca agttgggtgc ttactaccac attaccgacg tccaaagagg tttgttaaag 900

gccttcgact ctttagaaga cggctga 927

<210> 2

<211> 9444

<212> DNA

<213> 盘基网柄菌

<220>

<221> 基序1

<222> (4528)..(4554)

<220>

<221> C-甲基转移酶结构域

<222> (4528)..(4890)

<220>

<221> 基序2

<222> (4787)..(4809)

<220>

<221> 基序3

<222> (4867)..(4899)

<400> 2

atgaacaaga actccaaaat ccagtcccca aactcttctg atgttgctgt tattggtgtt 60

ggttttagat tcccaggtaa ctctaatgac ccagaatctt tgtggaacaa cttgttggat 120

ggtttcgatg ctattaccca agtcccaaaa gaaagatggg ctacttcttt tagagagatg 180

ggtttgatca agaacaagtt cggtggtttc ttgaaggatt ctgaatggaa gaatttcgac 240

cctttgttct ttggtatcgg tccaaaagaa gctccattca ttgatccaca acaaaggttg 300

ttgttgtcca tcgtttggga atctttggaa gatgcttaca tcagaccaga tgaattgaga 360

ggttctaaca ctggtgtttt catcggtgtt tctaacaacg attacaccaa gttgggtttc 420

caagacaact actctatttc tccatacact atgaccggct ctaactcttc attgaactcc 480

aacagaattt cctactgctt cgattttaga ggtccatcca ttactgttga taccgcttgt 540

tcttcttcct tggtttctgt taatttgggt gtccaatcca tccaaatggg tgaatgtaag 600

attgctattt gcggtggtgt taacgctttg tttgatccat ctacatctgt tgccttttcc 660

aagttgggtg ttttgtctga aaatggcaga tgcaactctt ttagtgatca agcctctggt 720

tacgttagat ctgaaggtgc tggtgttgtt gttttgaagt ctttggaaca agctaagttg 780

gatggtgata gaatctacgg tgttatcaag ggtgtttcct ctaatgaaga tggtgcttct 840

aatggtgaca agaactcttt gactactcca tcttgtgaag cccaatccat taacatttct 900

aaggctatgg aaaaggcctc cttgtctcca tctgatatct attacattga agcccatggt 960

actggtactc cagttggtga tccaattgaa gttaaggcct tgtccaagat cttctccaac 1020

tctaacaaca accagttgaa caacttctct accgatggta atgataacga tgatgatgat 1080

gacgataaca cctctccaga accattattg attggctcat tcaagtccaa catcggtcat 1140

ttggaatctg ctgctggtat tgcttctttg attaagtgtt gcttgatgtt gaagaacagg 1200

atgttggttc catccattaa ctgctctaat ttgaacccat ccattccatt cgatcagtac 1260

aacatctccg ttatcagaga aatcagacaa ttcccaaccg ataagttggt taacatcggt 1320

atcaattctt tcggtttcgg tggttctaac tgccatttga ttattcaaga gtacaacaac 1380

aacttcaaga acaactctac catctgcaat aacaacaaca acaacaataa caacatcgac 1440

tacttgatcc caatctcctc taagactaag aagtccttgg ataagtactt gattttgatc 1500

aagaccaact ccaactacca caaggatatt tctttcgatg acttcgtcaa gttccaaatc 1560

aagtctaagc agtacaactt gtccaacaga atgactacca ttgctaacga ttggaactcc 1620

ttcattaagg gttctaacga attccacaac ttgatcgaat ctaaggatgg tgaaggtggt 1680

tcttcatctt ctaacagagg tattgattcc gccaatcaaa tcaacactac tactacctct 1740

accatcaacg atatcgaacc tttgttggtt ttcgttttct gtggtcaagg tccacaatgg 1800

aatggtatga ttaagacctt gtacaactcc gagaacgttt tcaagaacac cgttgatcat 1860

gttgacagca tcttgtacaa gtacttcggt tactccattt tgaacgtctt gtctaagatc 1920

gatgataacg acgattccat caaccatcca atagttgctc aaccatcttt gttcttgttg 1980

caaattggtt tggtcgagtt gtttaagtac tggggtatct acccatctat ctctgttggt 2040

cattctttcg gtgaagtctc ttcttattac ttgtccggta tcatctcttt ggaaaccgct 2100

tgtaaaatcg tctacgtcag atcctctaat cagaacaaaa ctatgggttc cggtaagatg 2160

ttggttgttt ctatgggttt taagcaatgg aacgatcaat tctctgctga atggtccgat 2220

attgaaattg cttgttacaa cgctccagat tccatagttg ttactggtaa cgaagaaaga 2280

ttgaaagaat tgtccatcaa gttgtccgac gaatccaatc aaattttcaa caccttcttg 2340

aggtccccat gttcttttca ttcttcccat caagaagtca tcaagggttc tatgttcgaa 2400

gagttgtcta acttgcaatc tactggtgaa accgaaatcc ctttgttctc tactgttact 2460

ggtagacaag ttttgtctgg tcatgttact gctcaacaca tctacgataa tgttagagaa 2520

ccagtcttgt tccaaaagac gattgaatcc attacctcct acatcaagtc tcactaccca 2580

tccaatcaaa aggttatcta cgttgaaatt gctccacacc caaccttgtt ttcattgatc 2640

aaaaagtcca tcccatcctc caacaagaat tcctcttctg ttttgtgtcc attgaacaga 2700

aaagaaaact ccaacaactc ctacaagaag ttcgtttctc agttgtactt caacggtgtt 2760

aacgttgact tcaacttcca gttgaactcc atttgcgata acgttaacaa cgatcaccat 2820

ttgaacaacg tcaagcaaaa ctccttcaaa gagactacca attccttgcc aagataccaa 2880

tgggaacaag atgaatattg gtccgaacca ttgatctcca gaaagaatag attggaaggt 2940

ccaactactt ccttgttggg tcatagaatt atctacagct tcccagtttt ccaatccgtt 3000

ttggacttgc aatctgacaa ctacaaatac ttgttggacc acttggttaa cggtaagcca 3060

gtttttccag gtgctggtta tttggatatc atcatcgaat tcttcgacta ccaaaagcag 3120

cagttgaatt cctctgattc ctctaactcc tacatcatca acgttgacaa gatccaattc 3180

ttgaacccaa ttcacttgac cgaaaacaag ttgcaaacct tgcaatcttc tttcgaacct 3240

atcgttacta agaagtctgc cttctctgtt aacttcttca tcaaggatac cgtcgaggat 3300

caatctaagg ttaagtctat gtctgacgaa acttggacta acacttgtaa ggctaccatt 3360

tccttggaac aacaacagcc atctccatct tctactttga ctttgtctaa gaagcaagac 3420

ttgcagatct tgagaaacag atgcgatatt agcaagctag acaagtttga gttgtacgac 3480

aagatctcta agaatttggg cttgcagtac aactccttgt ttcaagttgt tgataccatc 3540

gaaactggta aggattgctc ttttgctact ttgtctttgc cagaagatac tttgttcacc 3600

accattttga acccatgctt gttggataac tgtttccatg gtttgttgac cttgatcaac 3660

gaaaagggtt ctttcgttgt cgagtccatt tcttctgttt ctatctactt ggagaacatc 3720

ggttccttca atcaaacttc tgttggtaac gtccagttct acttgtacac cactatttct 3780

aaagccacct cctttagttc tgaaggtact tgtaagttgt tcaccaagga tggttccttg 3840

attttgtcta tcggtaagtt catcatcaag tccaccaatc caaagtctac taagaccaac 3900

gaaactatcg aatctccatt ggacgaaacc ttctctattg aatggcaatc taaggattct 3960

ccaattccaa ccccacaaca aatccaacaa caatctccat tgaactctaa cccatccttc 4020

attagatcta ccatcttgaa ggacatccag ttcgaacaat actgctcctc cattatccac 4080

aaagaattga tcaaccacga aaagtacaag aaccagcaat ccttcgatat caactccttg 4140

gaaaaccact tgaacgatga ccaattgatg gaatccttgt ccatctccaa agaatacttg 4200

agattcttca ccaggatcat ctccatcatt aagcaatacc caaagatctt gaacgaaaaa 4260

gagctaaaag aattgaaaga aatcatcgaa ttgaagtacc catccgaagt tcagttgttg 4320

gaattcgaag ttatcgagaa ggtgtccatg attatcccaa agttgttgtt cgaaaacgac 4380

aagcaatctt ccatgacctt gttccaagat aacttgttga ccaggttcta ctccaattct 4440

aactctacca gattctactt ggaaagggtt tccgaaatgg tcttggaatc tattagacca 4500

atcgtcagag aaaagagggt gttcagaatt ttggaaattg gtgctggtac aggctctttg 4560

tctaatgttg ttttgactaa gttgaacacc tacttgtcca ccttgaattc taatggtggt 4620

tctggttaca acatcatcat tgagtacacc ttcaccgata tttccgccaa cttcattatt 4680

ggtgaaatcc aagaaaccat gtgcaacttg tacccaaacg ttactttcaa gttctccgtc 4740

ttggacttgg agaaagagat tattaactcc tccgatttct tgatgggtga ttacgatata 4800

gttttgatgg cctacgttat ccatgccgtt tctaacatta agttctccat cgaacagttg 4860

tacaagttgt tgtctccaag aggttggttg ttgtgtattg aacctaagtc caacgttgtg 4920

ttctccgatt tggttttcgg ttgttttaat cagtggtgga actactacga tgatattaga 4980

actacccact gctccttgtc tgaatctcaa tggaatcagt tgttgttgaa ccagtccttg 5040

aacaacgaat cctcttcttc ttctaactgt tacggtggtt tctccaacgt ttcttttatt 5100

ggtggtgaaa aggatgtcga ctcccattct ttcatattgc actgccaaaa agaatccatc 5160

tcccaaatga agttagccac cactattaac aacggtttgt catctggttc catcgttatc 5220

gttttgaact ctcaacaatt gaccaacatg aagtcctacc caaaggttat tgagtatatt 5280

caagaggcta cctctttgtg caagaccatt gaaattatcg attccaagga cgtcttgaac 5340

tctaccaatt cagttttgga aaagatccaa aagtccttgt tggtgttctg tttgttgggt 5400

tatgacttgt tggagaacaa ctaccaagaa cagtctttcg aatacgttaa gttgttgaac 5460

ttgatctcta ctaccgcctc ttcatctaat gataagaaac caccaaaggt cttgttgatc 5520

accaagcaat ctgaaagaat ctccaggtct ttctactcca gatccttgat tggtatttcc 5580

agaacctcta tgaacgagta cccaaatttg tccattacct ctatcgattt ggataccaac 5640

gactactcat tgcagtcttt gttgaagcca atcttcagca actctaagtt ttccgacaac 5700

gagttcatct tcaaaaaggg cttgatgttc gtgtccagga tctttaagaa caagcagttg 5760

ctagaatcct ccaacgcttt tgaaactgac tcttctaact tgtactgtaa ggcctcttct 5820

gacttgtctt acaagtacgc tattaagcag tctatgttga ccgaaaatca gatcgaaatc 5880

aaggttgaat gcgtcggtat taacttcaag gacaacctat tctacaaggg cttgttgcca 5940

caagaaattt tcagaatggg tgacatctac aatccaccat atggtttgga atgctctggt 6000

gttattacca gaattggttc taacgtcacc gaatactcag ttggtcaaaa tgtttttggt 6060

ttcgccagac attctttggg ttctcatgtt gttaccaaca aggatttggt tatcttgaag 6120

ccagatacca tctcattttc tgaagctgct tctatcccag ttgtttactg tactgcttgg 6180

tactccttgt tcaacattgg tcagttgtct aacgaagaat ccatcctaat tcattctgct 6240

actggtggtg taggtttggc ttctttgaat ttgttgaaaa tgaagaatca gcaacagcaa 6300

ccattgacca atgtttatgc tactgttggc tctaacgaga agaagaagtt cttgatcgat 6360

aacttcaaca acttgttcaa agaggacggc gaaaacattt tctctaccag agacaaagaa 6420

tactccaacc agttggaatc caagatcgat gttattttga acaccttgtc cggtgaattc 6480

gtcgaatcta atttcaagtc cttgagatcc ttcggtagat tgattgattt gtctgctact 6540

cacgtttacg ccaatcaaca aattggtcta ggtaacttca agttcgacca cttgtattct 6600

gctgttgact tggaaagatt gatcgacgaa aaacctaagt tgttgcagtc catcttgcaa 6660

agaattacca actctatcgt caacggttcc ttggaaaaaa ttccaattac catcttccca 6720

tccaccgaaa ctaaggatgc tatcgaatta ttgtccaaga gatcccatat cggtaaagtt 6780

gttgtagatt gcaccgatat ctctaagtgt aatcctgttg gtgatgtgat caccaacttc 6840

tctatgagat tgccaaagcc aaactaccag ttgaatttga actccacctt gttgattact 6900

ggtcagtctg gtttgtctat ccctttgttg aattggttgt tgtctaagtc tggtggtaac 6960

gttaagaacg ttgtcatcat ttctaagtcc accatgaagt ggaagttgca gactatgatt 7020

tcccatttcg tttccggttt cggtatccat tttaactacg ttcaagtcga catctccaac 7080

tacgatgctt tgtctgaagc tattaagcaa ttgccatctg atttgccacc aatcacctct 7140

gtttttcatt tggctgctat ctacaacgat gttccaatgg atcaagttac catgtctacc 7200

gttgaatctg ttcataaccc taaagttttg ggtgccgtta acttgcatag aatctctgtt 7260

tcttttggtt ggaagttgaa ccacttcgtc ttgttctctt ctattactgc tattaccggt 7320

tacccagacc aatctatcta caattctgcc aactctattt tggacgcttt gtccaacttt 7380

agaaggttta tgggtttgcc atccttctcc attaacttgg gtccaatgaa ggatgaaggt 7440

aaggtttcta ccaacaagag catcaagaag ctattcaagt ctagaggttt gccaagccta 7500

tccttgaaca agttatttgg tttgttggag gtcgtcatca acaacccatc taatcatgtt 7560

atcccatccc aattgatttg ctccccaatc gatttcaaga cctacatcga atctttctca 7620

actatgaggc caaagttgtt acacttgcaa cctaccattt ccaagcagca atcttctatc 7680

attaacgatt ctaccaaggc ttcctccaac atttcattgc aagataagat cacctccaag 7740

gtgtctgatt tgttgtccat tccaatctcc aagatcaact tcgatcatcc attgaaacac 7800

tacggcttgg attctttgtt gaccgttcaa ttcaaatcct ggatcgacaa agaattcgaa 7860

aagaacttgt tcacccatat ccaattggcc accatctcta ttaactcatt cttggaaaag 7920

gtgaacggct tgtctacaaa caataacaac aacaacaatt ccaacgtcaa gtcctctcca 7980

tccattgtca aagaagaaat cgttaccttg gacaaggatc aacaaccatt gctattgaaa 8040

gaacaccagc acattatcat ctccccagat attagaatca acaagccaaa gagggaatcc 8100

ttgattagaa ccccaatctt gaacaaattc aaccagatca ccgaatccat tatcactcca 8160

tctacaccat ctttgtccca atccgatgtt ttgaaaactc caccaatcaa gtctttgaac 8220

aacactaaga actccagctt gattaacacc ccaccaattc aatctgtcca acaacatcaa 8280

aagcaacaac aaaaggtcca agtcatccaa caacagcaac aaccattatc cagattgtcc 8340

tacaagagca acaacaactc tttcgttttg ggtatcggta tttctgttcc aggtgaacct 8400

atttcccaac aatccttgaa agactccatc tccaatgact tttctgataa ggctgaaact 8460

aacgagaagg tcaagagaat ctttgagcaa tctcaaatca agaccagaca cttggttaga 8520

gattacacta agccagagaa ctccatcaag ttcagacatt tggaaaccat taccgatgtg 8580

aacaaccagt tcaagaaagt tgttccagat ttggctcaac aagcctgttt gagagctttg 8640

aaagattggg gtggtgataa gggtgatatt acccatatag tttctgttac ctccaccggt 8700

attatcatcc cagatgttaa tttcaagttg atcgacttgt tgggcttgaa caaggatgtt 8760

gaaagagtgt ctttgaacct aatgggttgt ttggctggtt tgagttcttt gagaactgct 8820

gcttctttgg ctaaggcttc tccaagaaat agaattttgg ttgtctgtac cgaagtctgc 8880

tccttgcatt tttctaatac tgatggtggt gatcaaatgg tcgcctcttc tatttttgct 8940

gatggttctg ctgcttacat tattggttgt aacccaagaa ttgaagaaac cccattatac 9000

gaagtcatgt gctccattaa cagatctttc ccaaataccg aaaacgccat ggtttgggat 9060

ttggaaaaag aaggttggaa cttgggtttg gatgcttcta ttccaattgt cattggttct 9120

ggtattgaag ccttcgttga tactttgttg gataaggcta agttgcaaac ttccactgct 9180

atttctgcta aggattgcga attcttgatt catactggtg gcaagtccat cttgatgaac 9240

atcgaaaatt ccttgggtat cgacccaaag caaactaaga atacttggga tgtttaccat 9300

gcctacggca atatgtcatc tgcctctgtt attttcgtta tggatcatgc cagaaagtcc 9360

aagtctttgc caacttactc aatttctttg gcttttggtc caggtttggc ttttgaaggt 9420

tgtttcttga agaacgtcgt ctaa 9444

<210> 3

<211> 1059

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 3

atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60

gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120

gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180

gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240

aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300

gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360

gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420

aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480

accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540

gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcga gactgcttac 600

tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660

gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720

gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780

gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840

aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900

attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960

gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020

actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaataa 1059

<210> 4

<211> 14025

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒

<220>

<221> C1:p506同源引物

<222> (1)..(50)

<220>

<221> 19 UP

<222> (51)..(761)

<220>

<221> L0

<222> (762)..(800)

<220>

<221> THD3p

<222> (801)..(1453)

<220>

<221> L1

<222> (1454)..(1493)

<220>

<221> ALD6

<222> (1494)..(2999)

<220>

<221> L2

<222> (3000)..(3039)

<220>

<221> LTP1

<222> (3364)..(3403)

<220>

<221> Tef1p

<222> (3404)..(3897)

<220>

<221> L3

<222> (3898)..(3937)

<220>

<221> Acs L641P

<222> (3938)..(5893)

<220>

<221> L4

<222> (5894)..(5933)

<220>

<221> PRM9t

<222> (5934)..(6471)

<220>

<221> LTP2

<222> (6472)..(6511)

<400> 4

taaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctcgtttaa acggcgcgcc caccggagct 60

tggatatgat aaacgaaata ttcttgaatc gtgagatcgc ctgttttcaa aaccgttgga 120

ggcagaaaca attttgtcac aagatgggca ttctacccca tccttgctgt attattgtag 180

tctcgctttc ttttatgctg gacaaatgag actactgcac atttttatac gttcttggtt 240

ttttttaaag gtgtggtttc ggcattatcc tgccgcacgt ttcttggata attcatcctg 300

attctctatt ttaaacgctt cagcctatca ggatttggtt ttgatacata ctgcaagagt 360

gtatctcggg aacagtcatt tattccgcaa caaacttaat tgcggaacgc gttaggcgat 420

ttctagcata tatcaaatac cgttcgcgat ttcttctggg ttcgtctctt ttcttttaaa 480

tacttattaa cgtactcaaa caactacact tcgttgtatc tcagaatgag atccctcagt 540

atgacaatac atcattctaa acgttcgtaa aacacatatg aaacaacttt ataacaaagc 600

gaacaaaatg ggcaacatga gatgaaactc cgcgtccctt agctgaacta cccaaacgta 660

cgaatgcctg aacaattagt ttagatccga gattccgcgc ttccatcatt tagtataatc 720

catattttat ataatatata ggataagtaa cagcccgcga aaaacaacaa ataatcataa 780

aaattttaga actagacata tcgagtttat cattatcaat actgccattt caaagaatac 840

gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag tcaaaaaatt agccttttaa 900

ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt tacacagaat atataacatc 960

gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta aatataatgg agcccgcttt 1020

ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa aatattgttt tcttcaccaa 1080

ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga gaacaggggc acaaacaggc 1140

aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc tggagtaaat gatgacacaa 1200

ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca ccttctatta ccttctgctc 1260

tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca gttccctgaa attattcccc 1320

tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt aaatctattt 1380

cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt tttagtttta aaacaccaag 1440

aacttagttt cgactagaaa atttattata aaaggaagag aaataattaa acaatgacta 1500

agctacactt tgacactgct gaaccagtca agatcacact tccaaatggt ttgacatacg 1560

agcaaccaac cggtctattc attaacaaca agtttatgaa agctcaagac ggtaagacct 1620

atcccgtcga agatccttcc actgaaaaca ccgtttgtga ggtctcttct gccaccactg 1680

aagatgttga atatgctatc gaatgtgccg accgtgcttt ccacgacact gaatgggcta 1740

cccaagaccc aagagaaaga ggccgtctac taagtaagtt ggctgacgaa ttggaaagcc 1800

aaattgactt ggtttcttcc attgaagctt tggacaatgg taaaactttg gccttagccc 1860

gtggggatgt taccattgca atcaactgtc taagagatgc tgctgcctat gccgacaaag 1920

tcaacggtag aacaatcaac accggtgacg gctacatgaa cttcaccacc ttagagccaa 1980

tcggtgtctg tggtcaaatt attccatgga actttccaat aatgatgttg gcttggaaga 2040

tcgccccagc attggccatg ggtaacgtct gtatcttgaa acccgctgct gtcacacctt 2100

taaatgccct atactttgct tctttatgta agaaggttgg tattccagct ggtgtcgtca 2160

acatcgttcc aggtcctggt agaactgttg gtgctgcttt gaccaacgac ccaagaatca 2220

gaaagctggc ttttaccggt tctacagaag tcggtaagag tgttgctgtc gactcttctg 2280

aatctaactt gaagaaaatc actttggaac taggtggtaa gtccgcccat ttggtctttg 2340

acgatgctaa cattaagaag actttaccaa atctagtaaa cggtattttc aagaacgctg 2400

gtcaaatttg ttcctctggt tctagaattt acgttcaaga aggtatttac gacgaactat 2460

tggctgcttt caaggcttac ttggaaaccg aaatcaaagt tggtaatcca tttgacaagg 2520

ctaacttcca aggtgctatc actaaccgtc aacaattcga cacaattatg aactacatcg 2580

atatcggtaa gaaagaaggc gccaagatct taactggtgg cgaaaaagtt ggtgacaagg 2640

gttacttcat cagaccaacc gttttctacg atgttaatga agacatgaga attgttaagg 2700

aagaaatttt tggaccagtt gtcactgtcg caaagttcaa gactttagaa gaaggtgtcg 2760

aaatggctaa cagctctgaa ttcggtctag gttctatggg tatcgaaaca gaatctttga 2820

gcacaggttt gaaggtggcc aagatgttga aggccggtac cgtctggatc aacacataca 2880

acgattttga ctccagagtt ccattcggtg gtgttaagca atctggttac ggtagagaaa 2940

tgggtgaaga agtctaccat gcatacactg aagtaaaagc tgtcagaatt aagttgtaaa 3000

gacataaaac tgaaacaaca ccaattaata atagactttt ggacttcttc gccagaggtt 3060

tggtcaagtc tccaatcaag gttgtcggct tgtctacctt gccagaaatt tacgaaaaga 3120

tggaaaaggg tcaaatcgtt ggtagatacg ttgttgacac ttctaaataa gcgaatttct 3180

tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta tacaaatttt 3240

aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct ttcctgtagg 3300

tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat tgaccacacc tctaccggca 3360

tggcttaaat aacatactca tcactaaaca ttcttaacaa tcaaagcaac aggcgcgttg 3420

gacttttaat tttcgaggac cgcgaatcct tacatcacac ccaatccccc acaagtgatc 3480

ccccacacac catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca gattttctcg 3540

gactccgcgc atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta aatttcccct 3600

ctttcttcct ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag 3660

accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt 3720

ttcttgaaaa tttttttttt tgattttttt ctctttcgat gacctcccat tgatatttaa 3780

gttaataaac ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat ttttcttgtt ctattacaac 3840

tttttttact tcttgctcat tagaaagaaa gcatagcaat ctaatctaag ttttaataca 3900

tctaccagtc aacagccaac aattaactaa ttaaacaatg tcccaaactc ataagcacgc 3960

tattccagct aatattgctg atagatgctt gatcaaccca gaacagtacg aaactaagta 4020

caagcaatcc atcaacgatc cagatacttt ttggggtgaa caaggtaaga ttttggattg 4080

gattacccca taccaaaagg tcaagaatac ttcttttgct ccaggcaacg tttccattaa 4140

gtggtatgaa gatggtactt tgaacttggc tgctaactgt ttggatagac acttgcaaga 4200

aaacggtgat agaaccgcta ttatttggga aggtgatgat acctcccaat ccaaacatat 4260

ctcttacaga gaattgcaca gagatgtctg tagattcgct aacactttgt tggatttggg 4320

catcaaaaag ggtgatgttg ttgctatcta tatgccaatg gttcctgaag ctgctgttgc 4380

tatgttggct tgtgctagaa ttggtgctgt tcattctgtt attttcggtg gtttttcacc 4440

agaagctgtt gccggtagaa ttatcgattc ttcatccaga ttggttatca ccgctgatga 4500

aggtgttaga gctggtagat ctattccatt gaaaaagaac gttgatgacg ccttgaagaa 4560

cccaaatgtt acttctgttg aacacgtcat cgttttgaag agaactggtt ctgatatcga 4620

ttggcaagag ggtagagatt tgtggtggag agatttgatt gaaaaggctt ctccagaaca 4680

tcaaccagaa gctatgaacg ctgaagatcc tttgtttatc ttgtacactt ctggttctac 4740

tggtaagcca aaaggtgttt tacacactac tggtggttat ttggtttacg ctgctactac 4800

tttcaagtac gttttcgatt atcacccagg tgatatctat tggtgtactg ctgatgttgg 4860

ttgggttact ggtcattctt atttgttgta tggtccattg gcttgtggtg ctactacatt 4920

gatgtttgaa ggtgttccaa attggccaac tccagctaga atgtgtcaag ttgttgacaa 4980

acaccaagtc aacatcttgt atactgctcc aactgctatt agagctttga tggctgaagg 5040

tgataaggct attgaaggta ctgatagatc ctccttgaga atcttgggtt ctgttggtga 5100

acctattaac cctgaagcct gggaatggta ttggaagaaa attggtaaag aaaagtgccc 5160

agttgttgat acttggtggc aaactgaaac tggtggtttt atgattactc cattgccagg 5220

tgctattgaa ttgaaagctg gttctgctac tagaccattt tttggtgttc aaccagcttt 5280

ggttgataac gaaggtcatc cacaagaagg tgctactgaa ggtaatttgg ttattactga 5340

ttcttggcca ggtcaagcta gaactttgtt tggtgatcac gaaagattcg aacagactta 5400

cttctctacc ttcaagaaca tgtacttctc tggtgatggt gctagaagag atgaagatgg 5460

ttactattgg attaccggta gagttgatga tgtcttgaat gtttctggtc acagattagg 5520

tactgccgaa attgaatctg ctttggttgc tcatccaaag attgctgaag ctgcagttgt 5580

tggtattcca catgctatta agggtcaagc tatctacgct tacgttactt tgaatcatgg 5640

tgaagaacca tctccagaat tatacgctga agttagaaac tgggtcagaa aagaaattgg 5700

tccattagct accccagatg ttttacattg gactgattct ttgccaaaga ccagatcagg 5760

taagatcatg agaagaatct tgagaaagat tgctgctggt gatacttcta acttgggtga 5820

tacttcaaca ttagctgatc caggtgttgt tgaaaagcct ttggaagaaa aacaagctat 5880

tgccatgcca tcctaataat taaatactat tttcaaaatt ctacttaaaa ataacagaag 5940

acgggagaca ctagcacaca actttaccag gcaaggtatt tgacgctagc atgtgtccaa 6000

ttcagtgtca tttatgattt tttgtagtag gatataaata tatacagcgc tccaaatagt 6060

gcggttgccc caaaaacacc acggaacctc atctgttctc gtactttgtt gtgacaaagt 6120

agctcactgc cttattatca cattttcatt atgcaacgct tcggaaaata cgatgttgaa 6180

aatgcctcta gagatgaaaa acaatcgtaa aagggtcctg cgtaattgaa acatttgatc 6240

agtatgcagt ggcacagaaa caaccaggaa tactatagtc ataggcaata caaggtatat 6300

attggctatg cagacccctc cagaaagtac cgacgtcaag ttagatacac ttaacgaacc 6360

tagtgcacat ttaattgaga aaaatgtggc tcttcctaag gacatattcc gttcgtactt 6420

gagttattgg atctatgaaa tcgctcgcta tacaccagtc atgattttgt cattgcgaag 6480

actatactga tatatgaatt taaactagag cggaccaact atcatccgct aattactgac 6540

attaccaaat gagatctgtg aatgggcaag ataaaaaaca aaaattgaaa tgtttgacgt 6600

tatgtaaaac tattaattcc ttcgctttcg gcggtcacag aatttgcgtg tagctgactc 6660

ttgttcaatc aatatcattt gttactttat ttgaaagtct gtattactgc gcctattgtc 6720

atccgtacca aagaacgtca aaaagaaaca agataatttt tgtgcttaca ccatttatag 6780

atcactgagc ccagaatatc gctggagctc agtgtaagtg gcatgaacac aactctgact 6840

gatcgcacat attgccgtta tcataaatac tagttgtact tgtcaatgcg acgaatggca 6900

tcatgcctat tattacgttc ctctttttcc gtttcatgtt tccagaatgc tattgaatct 6960

aacacttcaa ttataaaaaa gaataaatcc gcaataattt taggctaatt gttgtactgt 7020

caagcgaacc taatggttaa aattcagagg aaccttcgac gtagtctgat cgctacttct 7080

atatcttatg ttcccagtca atcaaaagtt gatactataa tagctgccat ttatacctgt 7140

tagttatggc gatcgtttat cacggcggcc gcggtaccta ataacttcgt atagcataca 7200

ttatacgaag ttatattaag ggttctcgac gttttcgaca ctggatggcg gcgttagtat 7260

cgaatcgaca gcagtatagc gaccagcatt cacatacgat tgacgcatga tattactttc 7320

tgcgcactta acttcgcatc tgggcagatg atgtcgaggc gaaaaaaaat ataaatcacg 7380

ctaacatttg attaaaatag aacaactaca atataaaaaa actatacaaa tgacaagttc 7440

ttgaaaacaa gaatcttttt attgtcagta ctgattagaa aaactcatcg agcatcaaat 7500

gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct 7560

gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt 7620

ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa 7680

ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagct 7740

tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac 7800

tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat 7860

cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca 7920

gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt 7980

tgccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga 8040

tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat 8100

cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat 8160

acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat 8220

ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga aacgtgagtc ttttccttac 8280

ccatggttgt ttatgttcgg atgtgatgtg agaactgtat cctagcaaga ttttaaaagg 8340

aagtatatga aagaagaacc tcagtggcaa atcctaacct tttatatttc tctacagggg 8400

cgcggcgtgg ggacaattca acgcgtctgt gaggggagcg tttccctgct cgcaggtctg 8460

cagcgaggag ccgtaatttt tgcttcgcgc cgtgcggcca tcaaaatgta tggatgcaaa 8520

tgattataca tggggatgta tgggctaaat gtacgggcga cagtcacatc atgcccctga 8580

gctgcgcacg tcaagactgt caaggagggt attctgggcc tccatgtcgc tggccgggtg 8640

acccggcggg gacgaggcaa gctaaacaga tctctagacc taataacttc gtatagcata 8700

cattatacga agttatatta agggttgtct taattaaggg tgcccaattc gccctatagt 8760

gagtcgtatt acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 8820

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 8880

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 8940

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 9000

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 9060

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 9120

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 9180

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 9240

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 9300

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 9360

aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta 9420

cgcatctgtg cggtatttca caccgcatag atccgtcgag ttcaagagaa aaaaaaagaa 9480

aaagcaaaaa gaaaaaagga aagcgcgcct cgttcagaat gacacgtata gaatgatgca 9540

ttaccttgtc atcttcagta tcatactgtt cgtatacata cttactgaca ttcataggta 9600

tacatatata cacatgtata tatatcgtat gctgcagctt taaataatcg gtgtcaatgt 9660

ctgcccctat gtctgcccct aagaagatcg tcgttttgcc aggtgaccac gttggtcaag 9720

aaatcacagc cgaagccatt aaggttctta aagctatttc tgatgttcgt tccaatgtca 9780

agttcgattt cgaaaatcat ttaattggtg gtgctgctat cgatgctaca ggtgtcccac 9840

ttccagatga ggcgctggaa gcctccaaga aggttgatgc cgttttgtta ggtgctgtgg 9900

gtggtcctaa atggggtgcc ggtagtgtta gacctgaaca aggtttacta aaaatccgta 9960

aagaacttca attgtacgcc aacttaagac catgtaactt tgcatccgac tctcttttag 10020

acttatctcc aatcaagcca caatttgcta aaggtactga cttcgttgtt gtcagagaat 10080

tagtgggagg tatttacttt ggtaagagaa aggaagacga tggtgatggt gtcgcttggg 10140

atagtgaaca atacaccgtt ccagaagtgc aaagaatcac aagaatggcc gctttcatgg 10200

ccctacaaca tgagccacca ttgcctattt ggtccttgga taaagctaat gttttggcct 10260

cttcaagatt atggagaaaa actgtggagg aaaccatcaa gaacgaattc cctacattga 10320

aggttcaaca tcaattgatt gattctgccg ccatgatcct agttaagaac ccaacccacc 10380

taaatggtat tataatcacc agcaacatgt ttggtgatat catctccgat gaagcctccg 10440

ttatcccagg ttccttgggt ttgttgccat ctgcgtcctt ggcctctttg ccagacaaga 10500

acaccgcatt tggtttgtac gaaccatgcc acggttctgc tccagatttg ccaaagaata 10560

aggttgaccc tatcgccact atcttgtctg ctgcaatgat gttgaaattg tcattgaact 10620

tgcctgaaga aggtaaggcc attgaagatg cagttaaaaa ggttttggat gcaggtatca 10680

gaactggtga tttaggtggt tccaacagta ccaccgaagt cggtgatgct gtcgccgaag 10740

aagttaagaa aatccttgct taactttgcc ttcgtttatc ttgcctgctc attttttagt 10800

atattcttcg aagaaatcac attactttat ataatgtata attcattatg tgataatgcc 10860

aatcgctaag aaaaaaaaag agtcatccgc taggggaaaa aaaaaaatga aaatcattac 10920

cgaggcataa aaaaatatag agtgtactag aggaggccaa gagtaataga aaaagaaaat 10980

tgcgggaaag gactgtgtta tgacttccct gactaatgcc gtgttcaaac gatacctggc 11040

agtgactcct agcgctcacc aagctcttaa aacgggaatt tatggtgcac tctcagtaca 11100

atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacg cgctgacgcg 11160

ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 11220

agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 11280

gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta ggacggatcg 11340

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tctgtgttta tttattttta tgttttgtat ttggatttta gaaagtaaat aaagaaggta 11460

gaagagttac ggaatgaaga aaaaaaaata aacaaaggtt taaaaaattt caacaaaaag 11520

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cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 12480

gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 12540

gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 12600

ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 12660

gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 12720

ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 12780

tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 12840

actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 12900

taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 12960

gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 13020

tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 13080

ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 13140

gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 13200

tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 13260

cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 13320

gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 13380

actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 13440

ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 13500

gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 13560

atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 13620

tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 13680

tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 13740

aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 13800

gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 13860

gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttac ctcactcatt aggcacccca 13920

ggctttacac tttatgcttc cggctcctat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 13980

tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagcgc gcaat 14025

<210> 5

<211> 684

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<220>

<221> Acc1启动子

<222> (1)..(463)

<220>

<221> gRNA_3

<222> (53)..(72)

<220>

<221> gRNA_2

<222> (265)..(284)

<220>

<221> gRNA_1

<222> (339)..(358)

<400> 5

ggtagaaact tgattttttc taattttctg cgctgtttcg ggaacggaaa aaaattaagc 60

tagaagacga atcggttatt atactattat atttgtatag tatagtagcg tgtcgtatcg 120

tatcgtgtcg tatcgtatcg tatcgttaaa agaaaataca cgaataaata ataatatgtg 180

gagaagaaaa agggaagttt cttgtctctt gctctgaatc tgaattccaa ttcaagttca 240

aattgttctc tagtttattg tccaaaaata aggatgaagc gggagggaag ggcagaggga 300

aaagttcgta tagtagaatg aataaacttt tataaacaca tgcaccgatc actcacagag 360

gataaaaaaa tggcacaaca aatatatata tatagatgca aatggcgatt gcaaattagg 420

gaattggctt tgttgttttt tatcttcagg taaactgtac gaaagggata aaaagagtag 480

aataaggaaa ggaaaattga agagagcaga acaattgtag aaccgataac aattgtgaca 540

gtgattgtgc taggctatac tgtgccagaa tacgactggg agtgctgttc ttcttatata 600

tcttggcgct gattgagcgt atagcctagt tcaccaagca gtagagagag tggcaatgag 660

cggttgaatt tcgactgcga cttg 684

<210> 6

<211> 971

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PGK1启动子和用于酿酒酵母Acc1启动子的整合序列

<220>

<221> PGK1p

<222> (7)..(750)

<400> 6

tgttttatat ttgttgtaaa aagtagataa ttacttcctt gatgatctgt aaaaaagaga 60

aaaagaaagc atctaagaac ttgaaaaact acgaattaga aaagaccaaa tatgtatttc 120

ttgcattgac caatttatgc aagtttatat atatgtaaat gtaagtttca cgaggttcta 180

ctaaactaaa ccaccccctt ggttagaaga aaagagtgtg tgagaacagg ctgttgttgt 240

cacacgattc ggacaattct gtttgaaaga gagagagtaa cagtacgatc gaacgaactt 300

tgctctggag atcacagtgg gcatcatagc atgtggtact aaaccctttc ccgccattcc 360

agaaccttcg attgcttgtt acaaaacctg tgagccgtcg ctaggacctt gttgtgtgac 420

gaaattggaa gctgcaatca ataggaagac aggaagtcga gcgtgtctgg gttttttcag 480

ttttgttctt tttgcaaaca aatcacgagc gacggtaatt tctttctcga taagaggcca 540

cgtgctttat gagggtaaca tcaattcaag aaggagggaa acacttcctt tttctggccc 600

tgataatagt atgagggtga agccaaaata aaggattcgc gcccaaatcg gcatctttaa 660

atgcaggtat gcgatagttc ctcactcttt ccttactcac gagtaattct tgcaaatgcc 720

tattatgcag atgttataat atctgtgcgt agggataaaa agagtagaat aaggaaagga 780

aaattgaaga gagcagaaca attgtagaac cgataacaat tgtgacagtg attgtgctag 840

gctatactgt gccagaatac gactgggagt gctgttcttc ttatatatct tggcgctgat 900

tgagcgtata gcctagttca ccaagcagta gagagagtgg caatgagcgg ttgaatttcg 960

actgcgactt g 971

<210> 7

<211> 1724

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有酿酒酵母Acc1(S659A; S1167A)编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> T-G Ser659Ala

<222> (108)..(108)

<220>

<221> T-G Ser1167Ala

<222> (1602)..(1602)

<400> 7

ggcgcgccga gggtaaaaga tacaagttca cggtcgctaa atccggtaat gaccgctaca 60

cattatttat caatggttct aaatgtgata tcatactgcg tcaactagct gatggtgggc 120

tgctgatcgc tatcggcgct aaatcgcata ccatctattg gaaagaagaa gttgctgcta 180

caagattatc cgttgactct atgactactt tgttggaagt tgaaaacgat ccaacccagt 240

tgcgtactcc atcccctggt aaattggtta aattcttggt ggaaaatggt gaacacatta 300

tcaagggcca accatatgca gaaattgaag ttatgaaaat gcaaatgcct ttggtttctc 360

aagaaaatgg tatcgtccag ttattaaagc aacctggttc taccattgtt gcaggtgata 420

tcatggctat tatgactctt gacgatccat ccaaggtcaa gcacgctcta ccatttgaag 480

gtatgctgcc agattttggt tctccagtta tcgaaggaac caaacctgcc tataaattca 540

agtcattagt gtctactttg gaaaacattt tgaagggtta tgacaaccaa gttattatga 600

acgcttcctt gcaacaattg atagaagttt tgagaaatcc aaaactgcct tactcagaat 660

ggaaactaca catctctgct ttacattcaa gattgcctgc taagctagat gaacaaatgg 720

aagagttagt tgcacgttct ttgagacgtg gtgctgtttt cccagctaga caattaagta 780

aattgattga tatggccgtg aagaatcctg aatacaaccc cgacaaattg ctgggcgcag 840

tcgtggaacc attggcggat attgctcata agtactctaa cgggttagaa gcccatgaac 900

attctatatt tgtccatttc ttggaagaat attacgaagt tgaaaagtta ttcaatggtc 960

caaatgttcg tgaggaaaat atcattctga aattgcgtga tgaaaaccct aaagatctag 1020

ataaagttgc gctaactgtt ttgtctcatt cgaaagtttc agcgaagaat aacctgatcc 1080

tagctatctt gaaacattat caaccattgt gcaagttatc ttctaaagtt tctgccattt 1140

tctctactcc tctacaacat attgttgaac tagaatctaa ggctaccgct aaggtcgctc 1200

tacaagcaag agaaattttg attcaaggcg ctttaccttc ggtcaaggaa agaactgaac 1260

aaattgaaca tatcttaaaa tcctctgttg tgaaggttgc ctatggctca tccaatccaa 1320

agcgctctga accagatttg aatatcttga aggacttgat cgattctaat tacgttgtgt 1380

tcgatgtttt acttcaattc ctaacccatc aagacccagt tgtgactgct gcagctgctc 1440

aagtctatat tcgtcgtgct tatcgtgctt acaccatagg agatattaga gttcacgaag 1500

gtgtcacagt tccaattgtt gaatggaaat tccaactacc ttcagctgcg ttctccacct 1560

ttccgactgt gaagtctaag atgggtatga acagggctgt tgctgtttca gatttgtcat 1620

atgttgcaaa cagtcagtca tctccgttaa gagaaggtat tttgatggct gtggatcatt 1680

tagatgatgt tgatgaaatt ttgtcacaaa gtttggggcg cgcc 1724

<210> 8

<211> 3256

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有酿酒酵母Maf1编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> L0

<222> (362)..(401)

<220>

<221> Tef1

<222> (402)..(895)

<220>

<221> L1

<222> (896)..(935)

<220>

<221> MAF1

<222> (936)..(2123)

<220>

<221> L2

<222> (2124)..(2163)

<220>

<221> PRM9t

<222> (2164)..(2701)

<220>

<221> LTP2

<222> (2702)..(2741)

<400> 8

aatgatttaa gcgtgcgtga agataacact acaatccatt ttaaagcaac atccacattg 60

agtgtataca ccacaaaggt tttttcaggg cgtttttctc gccactttat gttgaccaaa 120

attattaatg gaacttacaa cgtttccaaa agttagttaa atacatacgt ctatttacta 180

agcaagaaat atatcatgac aagcccaaat attatattgt tatgtttaca aaaaaaaaat 240

ggctatatac atcaagtctg gaggcttttt ataacaagca agtggggtaa cttagacata 300

agattgactt ctttgaattc aacaaaaata catacttttg atgatttcaa tggtagaagc 360

ataaacaaca aataatcata aaaattttag aactagacat aaagcaacag gcgcgttgga 420

cttttaattt tcgaggaccg cgaatcctta catcacaccc aatcccccac aagtgatccc 480

ccacacacca tagcttcaaa atgtttctac tcctttttta ctcttccaga ttttctcgga 540

ctccgcgcat cgccgtacca cttcaaaaca cccaagcaca gcatactaaa tttcccctct 600

ttcttcctct agggtgtcgt taattacccg tactaaaggt ttggaaaaga aaaaagagac 660

cgcctcgttt ctttttcttc gtcgaaaaag gcaataaaaa tttttatcac gtttcttttt 720

cttgaaaatt tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt 780

taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt 840

tttttacttc ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt ttaatctaga 900

aaatttatta taaaaggaag agaaataatt aaacaatgaa atttattgat gagctagata 960

tagagagagt gaatcaaact ctcaatttcg agacaaatga ctgtaaaatc gtgggcagtt 1020

gcgatatttt cacaacaaag gcggttgcat cagatagaaa attatataaa actattgatc 1080

agcatttgga tactatttta caggaaaatg agaattacaa tgctaccctt cagcaacagc 1140

tagctgctcc cgaaacaaac caatcaccct gctcgtcgcc attttattct aataggaggg 1200

atagcaactc tttttgggag caaaagagaa gaatatcttt tagtgaatac aatagcaata 1260

ataacactaa caacagtaat ggcaatagca gtaataacaa taactattct ggacctaatg 1320

gttcttctcc agcaactttt cccaaaagtg ccaagctaaa tgaccaaaat ttaaaagaat 1380

tagtctcgaa ttacgattct ggctctatga gctcatcgtc tcttgattct tcttctaaga 1440

atgatgagag gataagaaga aggagcagta gcagtattag cagtttcaaa agtggtaaat 1500

catcgaacaa taattacagt tctggtacag caaccaacaa tgttaacaaa agaagaaaat 1560

cttcgataaa cgaaaggcca agcaatttaa gtttgggtcc gtttggtccc ataaacgaac 1620

cgtcaagccg caaaatattt gcttatctga ttgctatcct caacgcttct tatcctgacc 1680

atgatttttc atcggttgag ccaacggatt ttgtcaaaac atcattgaaa acttttattt 1740

ccaaatttga aaacacctta tattctcttg gtagacaacc agaggaatgg gtctgggagg 1800

taattaattc tcacatgact ctttctgatt gcgtcctttt tcaatattca ccttcaaact 1860

cttttttgga agatgagcct ggctatcttt ggaatcttat aggttttctt tacaacagga 1920

aaaggaaaag agtggcttac ctttacttga tttgctcgcg tctaaattcg agtacaggcg 1980

aagtggaaga tgccttggca aaaaaacctc agggaaagct tataatagat gatggctcaa 2040

atgaatacga aggagaatac gatttcactt atgatgagaa tgtaatagat gataaatcag 2100

atcaagaaga atccctacag tagagacata aaactgaaac aacaccaatt aataatagac 2160

tttacagaag acgggagaca ctagcacaca actttaccag gcaaggtatt tgacgctagc 2220

atgtgtccaa ttcagtgtca tttatgattt tttgtagtag gatataaata tatacagcgc 2280

tccaaatagt gcggttgccc caaaaacacc acggaacctc atctgttctc gtactttgtt 2340

gtgacaaagt agctcactgc cttattatca cattttcatt atgcaacgct tcggaaaata 2400

cgatgttgaa aatgcctcta gagatgaaaa acaatcgtaa aagggtcctg cgtaattgaa 2460

acatttgatc agtatgcagt ggcacagaaa caaccaggaa tactatagtc ataggcaata 2520

caaggtatat attggctatg cagacccctc cagaaagtac cgacgtcaag ttagatacac 2580

ttaacgaacc tagtgcacat ttaattgaga aaaatgtggc tcttcctaag gacatattcc 2640

gttcgtactt gagttattgg atctatgaaa tcgctcgcta tacaccagtc atgattttgt 2700

ccttaaataa catactcatc actaaacatt cttaacaatc agaaaacaac gcgtcatgaa 2760

aaagagttac tgaaccttca gatcctactt attgtaatgc ttcgcgacat ccaatccatt 2820

taataatcaa tttaaaacta gagttggtag agttccttgt tgaacgtgat aacccaaaag 2880

cataatacga gtaatgtttc agtattgcta ttatatgttt acacaaggaa aacatataat 2940

aacaaacctc taatccggta gtacttaaga aactatagtt tctatgtaca aaaaggtaac 3000

tatgtaattc ttacatttac ataacgtata gaagggtcca ataaacttac taaacttact 3060

accttgttgt atataggcta gatcgtaatc cactacgtca acataaaaaa aacttaagaa 3120

gtttgaattt tatgtacaaa cagattgtta aaatataata taagattatg gaaacgaact 3180

tgctctaaaa aaaatttaaa gttttataaa atcctcgaac tatcgctgtt atacatgatg 3240

tccccaaagc gtgtac 3256

<210> 9

<211> 4662

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有酿酒酵母UPC2E888D编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> L0

<222> (401)..(440)

<220>

<221> Tef1

<222> (441)..(934)

<220>

<221> L1

<222> (935)..(974)

<220>

<221> UPC2-1

<222> (975)..(3701)

<220>

<221> g-a G888D

<222> (3637)..(3637)

<220>

<221> L2

<222> (3702)..(3741)

<220>

<221> PRM9t

<222> (3742)..(4279)

<220>

<221> LTP2

<222> (4280)..(4319)

<400> 9

cccagttgtt tgtagctggt tcatatttag cggcaattct ctgttgcgta aatgaaaata 60

ttaatgtaaa caaaaaaaga ccaaaacatt ttagcagtgt aagaaggtgt actgatacaa 120

aatgtgttta gagtctactg atatgttact gaccgttcgt tgggaaaaaa atactgtatc 180

atttattaat caaaagcgac ttttggtgga atattatgat atgtgttgtt aaaatatgac 240

gtaattttag aattgtctga ttcgtattca aatttggtga aggaataacg cagagttgac 300

aatttaatag aatggattaa tcgtaatttt cagaaacgta gaaaaagaaa aacaattaaa 360

acattatatt aagattattg atttgccttt taagggtcca taaacaacaa ataatcataa 420

aaattttaga actagacata aagcaacagg cgcgttggac ttttaatttt cgaggaccgc 480

gaatccttac atcacaccca atcccccaca agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa 540

tgtttctact ccttttttac tcttccagat tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac 600

ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt 660

aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg 720

tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga 780

tttttttctc tttcgatgac ctcccattga tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc 840

tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt ttttacttct tgctcattag 900

aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt taatctagaa aatttattat aaaaggaaga 960

gaaataatta aacaatgagc gaagtcggta tacagaatca caagaaagcg gtgacaaaac 1020

ccagaagaag agaaaaagtc atcgagctaa ttgaagtgga cggcaaaaag gtgagtacga 1080

cttcaaccgg taaacgtaaa ttccataaca aatcaaagaa tgggtgcgat aactgtaaaa 1140

gaagaagagt taagtgtgat gaagggaagc cagcctgtag gaagtgcaca aatatgaagt 1200

tggaatgtca gtatacacca atccatttaa ggaaaggtag aggagcaaca gtagtgaagt 1260

atgtcacgag aaaggcagac ggtagcgtgg agtctgattc atcggtagat ttacctccta 1320

cgatcaagaa ggagcagaca ccgttcaatg atatccaatc agcggtaaaa gcttcaggct 1380

catccaatga ttcctttcca tcaagcgcct ctacaactaa gagtgagagc gaggaaaagt 1440

catcggcccc tatagaggac aaaaacaata tgactcctct aagtatgggc ctccagggta 1500

ccatcaataa gaaagatatg atgaataact ttttctctca aaatggcact attggttttg 1560

gttctcctga aagattgaat tcaggtatcg atggcttact attaccgcca ttgccttctg 1620

gaaatatggg tgcgttccaa cttcagcaac agcagcaagt gcagcagcaa tctcaaccac 1680

agacccaagc gcagcaagca agtggaactc caaacgagag atatggttca ttcgatcttg 1740

cgggtagtcc tgcattgcaa tccacgggaa tgagcttatc aaatagtcta agcgggatgt 1800

tactatgtaa caggattcct tccggccaaa actacactca acaacaatta caatatcaat 1860

tacaccagca gctgcaattg caacagcatc agcaagttca gctgcagcag tatcaacaat 1920

tacgtcagga acaacaccaa caagttcagc aacaacaaca ggaacaactc cagcaatacc 1980

aacaacattt tttgcaacag cagcaacaag tactgcttca gcaagagcaa caacctaacg 2040

atgaggaagg tggcgttcag gaagaaaaca gcaaaaaggt aaaggaaggg cctttacaat 2100

cacaaacaag cgaaactact ttaaacagcg atgctgctac attacaagct gatgcattat 2160

ctcagttaag taagatgggg ctaagcctaa agtcgttaag tacctttcca acagctggta 2220

ttggtggtgt ttcctatgac tttcaggaac tgttaggtat taagtttcca ataaataacg 2280

gcaattcaag agctactaag gccagcaacg cagaggaagc tttggccaat atgcaagagc 2340

atcatgaacg tgcagctgct tctgtaaagg agaatgatgg tcagctctct gatacgaaga 2400

gtccagcgcc atcgaataac gcccaagggg gaagtgctag tattatggaa cctcaggcgg 2460

ctgatgcggt ttcgacaatg gcgcctatat caatgattga aagaaacatg aacagaaaca 2520

gcaacatttc tccatcaacg ccctctgcag tgttgaatga taggcaagag atgcaagatt 2580

ctataagttc tctaggaaat ctgacaaaag cagccttgga gaacaacgaa ccaacgataa 2640

gtttacaaac atcacagaca gagaatgaag acgatgcatc gcggcaagac atgacctcaa 2700

aaattaataa cgaagctgac cgaagttctg tttctgctgg taccagtaac atcgctaagc 2760

ttttagatct ttctaccaaa ggcaatctga acctgataga catgaaactg tttcatcatt 2820

attgcacaaa ggtctggcct acgattacag cggccaaagt ttctgggcct gaaatatgga 2880

gggactacat accggagtta gcatttgact atccattttt aatgcacgct ttgttggcat 2940

tcagtgccac ccatctttcg aggactgaaa ctggactgga gcaatacgtt tcatctcacc 3000

gcctagacgc tctgagatta ttaagagaag ctgttttaga aatatctgag aataacaccg 3060

atgcgctagt tgccagcgcc ctgatactaa tcatggactc gttagcaaat gctagtggta 3120

acggcactgt aggaaaccaa agtttgaata gcatgtcacc aagcgcttgg atctttcatg 3180

tcaaaggtgc tgcaacaatt ttaaccgctg tgtggccttt gagtgaaaga tctaaatttc 3240

ataacattat atctgttgat cttagcgatt taggcgatgt cattaaccct gatgttggaa 3300

caattactga attggtatgt tttgatgaaa gtattgccga tttgtatcct gtcggcttag 3360

attcgccata tttgataaca ctagcttatt tagataaatt gcaccgtgaa aaaaaccagg 3420

gtgattttat tctgcgggta tttacatttc cagcattgct agacaagaca ttcctggcat 3480

tactgatgac aggtgattta ggtgcaatga gaattatgag atcatattat aaactacttc 3540

gaggatttgc cacagaggtc aaggataaag tctggtttct cgaaggagtc acgcaggtgc 3600

tgcctcaaga cgttgatgag tacaggggag gtggtgatat gcatatgatg ctaggattac 3660

catcgatgac aacaacaaat ttctctgatt tttcgttatg aagacataaa actgaaacaa 3720

caccaattaa taatagactt tacagaagac gggagacact agcacacaac tttaccaggc 3780

aaggtatttg acgctagcat gtgtccaatt cagtgtcatt tatgattttt tgtagtagga 3840

tataaatata tacagcgctc caaatagtgc ggttgcccca aaaacaccac ggaacctcat 3900

ctgttctcgt actttgttgt gacaaagtag ctcactgcct tattatcaca ttttcattat 3960

gcaacgcttc ggaaaatacg atgttgaaaa tgcctctaga gatgaaaaac aatcgtaaaa 4020

gggtcctgcg taattgaaac atttgatcag tatgcagtgg cacagaaaca accaggaata 4080

ctatagtcat aggcaataca aggtatatat tggctatgca gacccctcca gaaagtaccg 4140

acgtcaagtt agatacactt aacgaaccta gtgcacattt aattgagaaa aatgtggctc 4200

ttcctaagga catattccgt tcgtacttga gttattggat ctatgaaatc gctcgctata 4260

caccagtcat gattttgtcc ttaaataaca tactcatcac taaacattct taacaatcac 4320

gatggatgat gattggttct tatcataatt tgatttcggc agaagcaata ttagaggtat 4380

tgttgtaacg aaattccaat gtcatctgct tagtattatt aatgttacct gcatattatc 4440

acatgccgct taaaaatgtg ttataagtat taaaatctag tgaaagttga aatgtaatct 4500

aataggataa tgaaacatat gaaacggaat gaggaataat cgttgtatta ctatgtagag 4560

atatcgattt cattttgagg attcctatat tcttggggag aacttctact atattctgta 4620

tacatgatat aatagccttt accaacaatg gaatgccaac aa 4662

<210> 10

<211> 3564

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有构巢曲霉NpgA编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> LTP1 (L0)

<222> (596)..(635)

<220>

<221> Tef1p

<222> (636)..(1129)

<220>

<221> L1

<222> (1130)..(1169)

<220>

<221> NpgA

<222> (1170)..(2201)

<220>

<221> L2

<222> (2205)..(2244)

<220>

<221> PRM9t

<222> (2245)..(2782)

<220>

<221> LTP2

<222> (2783)..(2822)

<400> 10

tcaatcaaag caacccacaa atcctaggct gaatcatgat atcgatggaa gcaatcaaca 60

attttatcaa gaccgcacca aagcacgact atctgacagg cggagttcat cattctggta 120

atgtagacgt gttacaatta agcggcaata aagaagatgg tagtttagta tggaaccata 180

cttttgttga tgtagacaac aatgtggtag ctaagtttga agacgctctc gaaaaacttg 240

aaagtttgca ccggcgctca tcctcatcca caggcaatga agaacacgct aacgtttaac 300

cgaggggagt cacttcataa tgatgtgaga aataagtgaa tattgtaata attgttggga 360

ctccattgtc aacaaaagct ataatgtagg tatacagtat atactagaag ttctcctcga 420

ggatcttgga atccacaaaa gggagtcgat aaatctatat aataaaaatt actttatctt 480

ctttcgtttt atacgttgtc gtttattatc ctattacgtt atcaatcttc gcatttcagc 540

tttcattaga tttgatgact gtttctcaaa ctttatgtca ttttcttaca ccgcataaac 600

aacaaataat cataaaaatt ttagaactag acataaagca acaggcgcgt tggactttta 660

attttcgagg accgcgaatc cttacatcac acccaatccc ccacaagtga tcccccacac 720

accatagctt caaaatgttt ctactccttt tttactcttc cagattttct cggactccgc 780

gcatcgccgt accacttcaa aacacccaag cacagcatac taaatttccc ctctttcttc 840

ctctagggtg tcgttaatta cccgtactaa aggtttggaa aagaaaaaag agaccgcctc 900

gtttcttttt cttcgtcgaa aaaggcaata aaaattttta tcacgtttct ttttcttgaa 960

aatttttttt tttgattttt ttctctttcg atgacctccc attgatattt aagttaataa 1020

acggtcttca atttctcaag tttcagtttc atttttcttg ttctattaca acttttttta 1080

cttcttgctc attagaaaga aagcatagca atctaatcta agttttaatc tagaaaattt 1140

attataaaag gaagagaaat aattaaacaa tggttcaaga tacctcttct gcttctacct 1200

ctccaatttt gactagatgg tacattgata ccagaccatt gactgcttct actgctgctt 1260

tgccattatt ggaaacttta caaccagccg atcaaatctc cgttcaaaag tactatcact 1320

tgaaggacaa gcacatgtct ttggcttcta acttgttgaa gtacttgttc gttcacagaa 1380

actgcagaat tccatggtcc tctatcgtta tttctagaac tccagatcca catagaaggc 1440

catgttatat tccaccatct ggttctcaag aggattcttt taaagatggt tacaccggta 1500

tcaacgtcga gtttaatgtt tctcatcaag cctccatggt tgctattgct ggtactgctt 1560

ttactccaaa ttctggtggt gattctaagt tgaaaccaga agttggtatc gatattacct 1620

gcgtcaacga aagacaaggt agaaatggtg aagaaaggtc cttggaatct ttgagacagt 1680

acatcgatat cttctccgaa gttttctcta ctgctgaaat ggccaacatt agaagattgg 1740

atggtgtctc ttcttcctca ttgtctgctg atagattggt tgattatggc tacaggttgt 1800

tctatactta ctgggctttg aaagaagcct acattaagat gactggtgaa gccttgttgg 1860

ctccatggtt gagagaattg gaattctcta atgttgttgc tccagctgct gttgctgaat 1920

ctggtgattc tgctggtgat tttggtgaac catatactgg tgttagaacc accttgtaca 1980

agaacttggt tgaagatgtt agaattgaag ttgctgcttt gggtggtgat tacttgtttg 2040

ctactgctgc tagaggtggt ggtattggtg cttcttctag accaggtggt ggtccagatg 2100

gttctggtat tagatctcaa gatccttgga ggccattcaa gaagttggat attgaaaggg 2160

atattcaacc atgtgctact ggtgtatgta actgcttgtc ttaaagacat aaaactgaaa 2220

caacaccaat taataataga ctttacagaa gacgggagac actagcacac aactttacca 2280

ggcaaggtat ttgacgctag catgtgtcca attcagtgtc atttatgatt ttttgtagta 2340

ggatataaat atatacagcg ctccaaatag tgcggttgcc ccaaaaacac cacggaacct 2400

catctgttct cgtactttgt tgtgacaaag tagctcactg ccttattatc acattttcat 2460

tatgcaacgc ttcggaaaat acgatgttga aaatgcctct agagatgaaa aacaatcgta 2520

aaagggtcct gcgtaattga aacatttgat cagtatgcag tggcacagaa acaaccagga 2580

atactatagt cataggcaat acaaggtata tattggctat gcagacccct ccagaaagta 2640

ccgacgtcaa gttagataca cttaacgaac ctagtgcaca tttaattgag aaaaatgtgg 2700

ctcttcctaa ggacatattc cgttcgtact tgagttattg gatctatgaa atcgctcgct 2760

atacaccagt catgattttg tccttaaata acatactcat cactaaacat tcttaacaat 2820

cagaaaatgc aaccgataaa acattataaa tcttcgcggt tatctggcat tgttattaac 2880

caaaaaaatg ccggcctatt acaagctact gttcaataaa tattgttgta atgaagacgg 2940

tccaactgta caaatacagc aaactgtcat atataaggtg tcttatgtga cagcacttgc 3000

gttattgtca gccggagtat gtctttgtcg cattctgggc tttttacttt ctgctcagaa 3060

ggaagtacga acaagaaaaa aaaatcacca atgcttccct tttcagtatt agtttcatat 3120

ttgtttacgt tcaaactcgt cgtttgcgcg ataacctcta aaaaagtcag ttacgtaact 3180

atatcaatca gagaatgcaa aaagcactat cataaaaatg tctctagggg atgtgagaca 3240

tgtcaattat aagaagtgat ggtgtcatag tatatatatc ataaatgatt atcaaagttt 3300

caatcctttg tattttctag tttagcgcca acttttgaca aaacctaaac tttagataat 3360

catcattctt acaattttta tctggatggc aataatctcc tatataaagc ccagataaac 3420

tgtaaaaaga atccatcact atttgaaaaa aagtcatctg gcacgtttaa ttatcagagc 3480

agaaatgatg aagggtgtta gcgccgtcca ttgatgcgcc tggtagtcat gatttacgta 3540

taactaacac atcatgagga cggc 3564

<210> 11

<211> 336

<212> PRT

<213> 土曲霉

<400> 11

Met Ile Gln Gln Val Gln Gln Ala Val Phe Asp Pro Glu Arg Phe Leu

1 5 10 15

Val Asp Ile Glu Glu Thr Cys Arg Ala Ile Gly Ala Pro Tyr Ser Gln

20 25 30

Glu Lys Thr Leu Lys Val Leu Glu Gly Phe Gln Ala Ser Phe Ala Arg

35 40 45

Gly Ala Val Leu Trp Arg Ile Thr Asn Arg Pro Gly Asp Ala Leu Asn

50 55 60

Tyr Arg Phe Tyr Glu Arg Val Ser Ile Asp Ala Val Ser Cys Ala Val

65 70 75 80

Glu Ala Lys Leu Phe Gln Pro Asn His Pro Leu Ser Glu Leu Ile Val

85 90 95

Ser Trp Thr Ala Leu Tyr Pro Gly Ala Ala Gln Gln Ser Cys Asp Phe

100 105 110

Asp Ala Glu Gln Gly Phe Ser Lys Ile Trp Val Tyr Leu Gly Asp Met

115 120 125

Arg Pro Leu Ser Asp Ile Leu Ser Ala Pro His Val Pro Leu Ser Ile

130 135 140

Arg Lys His Ala Thr Thr Phe Tyr Asn Leu Gly Leu Glu Leu Val Arg

145 150 155 160

His Val Ala Ala Asp Phe Thr Ser Asn Thr Ile Asn Ile Tyr Phe Arg

165 170 175

Val Gln Gly Leu Leu Thr Leu Glu Arg Ala Arg Ser Leu Val Arg Leu

180 185 190

Ser Asp Pro Ala Tyr Leu Leu Glu Cys Gly Glu Val Glu Glu Met Arg

195 200 205

Arg Leu Leu Asn Pro Val Gly Phe Thr Phe Ala Val Thr Met Asp Tyr

210 215 220

Ser Thr Gly Asp Ile Lys Arg Val Gly Ile Tyr Ala Leu Lys Leu Ala

225 230 235 240

Pro Gly Thr Tyr Pro Ala Met Asp Glu Arg Leu Lys Ala Thr Arg Ala

245 250 255

Ile Pro Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Ile Leu Leu Ser Gln Gly Val Leu

260 265 270

Met Ala Lys Glu Val Ala Ala Ala Phe Pro Val Pro Ser Glu Thr Ala

275 280 285

Ala Val Asn Arg Pro Arg Glu Val Asp Val Glu Val Gly Val Gly Val

290 295 300

Ala Ser Phe Met Phe Gln Pro Thr Thr Pro Ile Ala Pro Thr Val Asp

305 310 315 320

Val Arg Asp Asn Val Val Val Ala Val Phe His Ala Val Glu Ser Pro

325 330 335

<210> 12

<211> 305

<212> PRT

<213> 链霉菌属CL190

<400> 12

Val Ser Gly Glu Thr Asp Ala Glu Glu Leu Cys Ser Ala Ile Glu Glu

1 5 10 15

Thr Ala Arg Leu Val Gly Ala Pro Cys Ser Arg Glu Lys Ile Trp Pro

20 25 30

Ile Leu Thr Glu Tyr Arg Ser Gly Phe Ala Glu Gly Gly Val Val Phe

35 40 45

Ser Ala Gln Ala Gly Glu Asn His Ala Gly Glu Leu Asp Tyr Gly Leu

50 55 60

Ala Val Pro Pro Arg Ile Asp Asp Pro Tyr Ala His Ala Leu Ala His

65 70 75 80

Gly Phe Val Thr Glu Thr Asp His Pro Val Ala Ala Leu Leu Ser Asp

85 90 95

Ile Arg Glu Arg Cys Ala Val Thr Glu His Phe Ala Asp Cys Gly Val

100 105 110

Val Gly Gly Phe Arg Lys Leu Tyr Ala His Phe Pro Arg Asp Leu Gln

115 120 125

Lys Val Ser Glu Ile Ala Asp Ile Pro Ser Met Pro Arg Ala Val Ala

130 135 140

Glu Asn Val Gly Leu Phe Thr Arg Tyr Gly Leu Glu Asn Val Val Met

145 150 155 160

Val Gly Val Asn Tyr Lys Asn Lys Thr Val Ser Leu Tyr Phe Gln Phe

165 170 175

Thr Ala Glu Gly Arg Pro Arg Pro Ser Ala Ile Arg Ser Met Leu Gly

180 185 190

Asp Ile Gly Met Thr Glu Pro Asn Glu Arg Met Leu Asp Phe Ala Ser

195 200 205

Asn Ser Phe Arg Ala Asn Ile Thr Leu Ser Trp Asp Ser Pro Lys Ile

210 215 220

Leu Arg Val Ala Phe Ala Pro Pro Pro Gly Ala Gly Leu Asn Leu Ser

225 230 235 240

Thr Val Pro Ile Pro Thr Gly Pro His Leu Glu Asp Phe Val Thr Arg

245 250 255

Ala Pro Arg Ala Tyr Asp Gly Glu Arg Met Asn Leu Phe Ala Val Lys

260 265 270

Trp Thr Gln Asp Lys Glu Phe Leu Glu Val Cys Ser Tyr Tyr Gln Leu

275 280 285

Pro Ala Gly Tyr Glu Pro Ile Arg Gln Met Glu Ile His Lys Glu Gln

290 295 300

Gly

305

<210> 13

<211> 299

<212> PRT

<213> 链霉菌属CL190

<400> 13

Met Pro Glu Ala Thr Lys Leu Glu Thr Val Phe Ser Ala Val Glu Glu

1 5 10 15

Thr Ala Arg Leu Val Asp Ala Pro Cys Ser Arg Glu Lys Val Trp Pro

20 25 30

Ala Leu Glu Thr Phe Gly Arg Trp Phe Asp Asp Ala His Ile Ile Phe

35 40 45

Ser Met Gly Thr Gly His Lys Tyr Arg Gly Glu Leu Ala Phe Asp Phe

50 55 60

Thr Val Pro Pro Glu Ala Gly Asp Pro Tyr Ala Ala Ala Val Ala Gly

65 70 75 80

Gly Leu Leu Glu Lys Val Asp His Pro Val Thr Gly Leu Phe Ser Glu

85 90 95

Ile Gly Asp Arg Phe Pro Val Asp Ala Tyr Ala Val Asp Tyr Gly Val

100 105 110

Arg Gly Gly Phe Lys Lys Ala Cys Val Phe Phe Pro Leu Ala Arg Pro

115 120 125

Gln Ser Met Lys Ala Leu Ala Glu Leu Pro Ser Ile Pro Pro Ala Leu

130 135 140

Ala Ala His Ala Glu Tyr Phe Ala Ala Ala Gly Leu Asp Gly Lys Val

145 150 155 160

Ser Cys Ile Gly Ile Asp Tyr Gly Ser Arg Thr Trp Asn Leu Tyr Ile

165 170 175

Ser Gly Leu Thr Pro Asp Tyr Thr Arg Pro Asp Ala Ile Val Ala Thr

180 185 190

Leu Gly Glu Met Gly Leu Ser Lys Pro Ser Glu His Met Leu Glu Phe

195 200 205

Ile Ser Thr Ser Phe Ala Met Tyr Pro Thr Phe Gly Trp Asp Thr Thr

210 215 220

Arg Ile Glu Arg Met Cys Phe Ser Thr Arg Thr Ser Asp Pro Asn Leu

225 230 235 240

Leu Pro Ala Arg Ile Glu Pro Asp Val Ala Lys Phe Ala Arg Asp Met

245 250 255

Pro Thr Val His Gly Gly Glu Pro Ser Tyr Val Tyr Ala Gly Thr Val

260 265 270

Ala Arg Gly Glu Glu Phe Phe Lys Leu Ala Ser Tyr Tyr Gln Met Ser

275 280 285

Ser Lys Val Ser Glu Arg Val Arg Pro Ala Asp

290 295

<210> 14

<211> 304

<212> PRT

<213> 链霉菌属CL190

<400> 14

Met Ser Gly Ala Lys Asp Val Glu Arg Val Tyr Ser Ala Met Glu Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Leu Leu Asn Val Pro Val Ala Arg Asp Lys Ile Trp Pro

20 25 30

Val Leu Thr Ala Tyr Gln Asp Ala Leu Ala Asp Ala Val Ile Val Phe

35 40 45

Ser Met Ala Gly Gly Arg Arg Ser Thr Glu Leu Asp Phe Ser Ile Ser

50 55 60

Val Pro Thr Asp His Gly Asp Pro Phe Thr Thr Ala Leu Glu Arg Gly

65 70 75 80

Leu Thr Glu Lys Glu Asn His Pro Val Asp Asn Leu Leu Ala Glu Leu

85 90 95

Arg Asp Gly Phe Pro Leu Gly Met Tyr Ala Ile Asp Gly Met Val Thr

100 105 110

Thr Gly Phe Lys Lys Ala Tyr Ala Ser Phe Pro Thr Asn Glu Pro Gln

115 120 125

Pro Leu Thr Ala Leu Leu Asp Leu Pro Ser Met Pro Glu Ser Ala Arg

130 135 140

Ala Asn Ala Glu Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Lys Val Gln Met

145 150 155 160

Val Ser Val Asp Tyr Pro Lys Arg Gln Val Asn Leu Tyr Phe Ser Asp

165 170 175

Leu Asn Ala Asp His Leu Thr Pro Glu Glu Val Lys Ser Thr Ala Ser

180 185 190

Glu Met Gly Leu Val Glu Pro Thr Asp Met Ala Leu Asp Phe Ala Thr

195 200 205

Gly Ser Phe Ala Val Tyr Pro Thr Leu Gly Tyr Asp Ser Asp Val Val

210 215 220

Asp Arg Ile Thr Tyr Ala Val Ile Ser Val Asp Pro Thr Leu Ala Pro

225 230 235 240

Thr Thr Ser Glu Pro Glu Lys Thr Gln Ile Thr Thr Tyr Ala Asn Ser

245 250 255

Ala Pro Tyr Ala Tyr Ala Gly Glu Asn Arg Thr Leu Val Tyr Gly Phe

260 265 270

Thr Leu Thr Ser Lys Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gly Ser Tyr Tyr Gln

275 280 285

Ile Thr Asp Leu Gln Arg Thr Leu Val Lys Ala Phe Glu Ala Leu Asp

290 295 300

<210> 15

<211> 299

<212> PRT

<213> 链霉菌属CL190

<400> 15

Met Ser Ala Glu Pro Ala Ile Glu Arg Leu Cys Val Ala Ala Glu Asp

1 5 10 15

Ala Ala Gly Ile Val Gly Leu Glu Cys Pro Arg Glu Lys Met Thr Ala

20 25 30

Val Leu Thr Ala Phe Pro Asn Val Val Thr Asp Ser Thr Val Val Phe

35 40 45

Asn Val Val Asn Lys Gly Gly Arg Val Gly Asp Met Ser Phe Asp Phe

50 55 60

Thr Val Pro Leu Ala Ala Gly Asp Pro Tyr Glu Arg Ala Leu Ala His

65 70 75 80

Gly Leu Ala Glu Lys Thr Asn His Pro Val Arg Gly Met Phe Ala Asp

85 90 95

Met Leu Thr Thr Leu Pro Val Asp Cys Tyr Gly Val Asp Tyr Gly Val

100 105 110

Asn Gly Gly Phe Asn Lys Ala Tyr Ala Val Phe Pro Met Gly Arg Leu

115 120 125

Gln Glu Leu Asp Lys Leu Ala Ala Val Pro Ala Met Ala Asp Thr Leu

130 135 140

Ser Lys Trp Met Gly Gln Leu Val Asp Tyr Gly Leu Asp Gly Arg Val

145 150 155 160

Ser Thr Val Ala Val Asp His Ala Asn Arg Thr Trp Asn Val Tyr Phe

165 170 175

Asn Gly Leu Ser Ala Glu His Phe Glu Arg Pro Thr Leu Gln Ala Met

180 185 190

Ile Arg Asp Phe Gly Leu Pro Glu Pro Ser Ala Gln Leu Leu Asp Phe

195 200 205

Ala Glu Thr Ser Ser Ala Leu Tyr Pro Thr Phe Ser Trp Asp Ser Pro

210 215 220

Glu Ile Glu Arg Val Ser Phe Ser Thr Arg Thr Thr Asp Pro Asn Ala

225 230 235 240

Leu Pro Ala His Val Glu Pro Lys Leu Gly Ala Leu Ala Ala Asn Ala

245 250 255

Pro Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp Arg Arg Leu Val Phe Ala Gly Ala Leu

260 265 270

Thr Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Lys Leu Ala Thr Tyr Tyr Gln Met Ala

275 280 285

Thr Ala Ala His Asp Arg Val Arg Arg Gly Ser

290 295

<210> 16

<211> 296

<212> PRT

<213> 链霉菌属CL190

<400> 16

Met Ser Ala Thr Ala Glu Met Asp Glu Leu Tyr Ala Val Ile Glu Gln

1 5 10 15

Ser Ala Arg Thr Leu Gly Val Pro Cys Ala Pro Glu Lys Val Arg Pro

20 25 30

Val Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ala Phe Gly His Ala Ala Thr Val Val

35 40 45

Ala Phe Arg Val Ala Thr Ser Ile Arg His Ala Gly Glu Leu Asp Cys

50 55 60

Arg Phe Thr Thr His Pro Asp Glu Arg Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Leu

65 70 75 80

Ala Ala Gly Leu Ala Gly Arg Thr Asp His Pro Val Gly Ala Val Leu

85 90 95

Ala Gln Leu Gln Gly Arg Cys His Val Asp Ser His Gly Ile Asp Phe

100 105 110

Gly Val Val Gly Gly Phe Lys Lys Val Tyr Ala Phe Phe Thr Pro Asp

115 120 125

Asp Leu Gln Glu Val Ala Lys Phe Ala Asp Leu Pro Ala Met Pro Arg

130 135 140

Ala Leu Ala Glu His Thr Gly Phe Phe Ala Arg His Gly Leu Ala Asp

145 150 155 160

Arg Val Gly Val Val Gly Val Asp Tyr Gly His Arg Thr Leu Asn Val

165 170 175

Tyr Phe Asn Asp Val Pro Ala Gln Leu Phe Glu Pro Gly Thr Ile Thr

180 185 190

Ala Thr Leu Arg Glu Leu Gly Met Ala Arg Pro Ser Glu Gln Met Leu

195 200 205

Lys Leu Gly Arg Glu Ala Phe Gly Leu Tyr Val Thr Leu Gly Trp Asp

210 215 220

Ser Pro Arg Ile Glu Arg Ile Cys Tyr Ala Val Thr Thr Ala Asp Leu

225 230 235 240

Ala Ala Leu Pro Val Pro Val Glu Pro Glu Ile Glu Arg Phe Val Arg

245 250 255

Gly Val Pro Ala Asp Asp Gly Asp Arg Lys Phe Val Tyr Gly Val Ala

260 265 270

Val Ala Pro Glu Gly Glu Tyr Tyr Lys Leu Glu Ser His Tyr Arg Trp

275 280 285

Lys Pro Gly Thr Met Asp Phe Ile

290 295

<210> 17

<211> 305

<212> PRT

<213> 链霉菌属CL190

<400> 17

Met Ser Gly Thr Ala Glu Leu Glu Lys Val Tyr Ser Ala Ile Glu Glu

1 5 10 15

Ser Ala Arg Leu Val Gly Val Ala Cys Ser Arg Asp Asn Val Trp Pro

20 25 30

Ile Leu Thr Ala Phe Gly Glu Ser Ile Glu Asp Ala Leu Met Val Phe

35 40 45

Ser Leu Gln Thr Gly Gly Arg His Ala Gly Glu Leu Asp Tyr Ser Phe

50 55 60

Thr Ala Pro Pro Gly Ile Gly Asp Pro Tyr Pro Arg Ala Leu Ser Tyr

65 70 75 80

Gly Phe Val Thr Glu Thr Asp His Pro Val Gly Ser Val Leu Ser Asp

85 90 95

Leu Gln Gly Arg Trp Ala Ile Arg Glu His Phe Val Asp Cys Gly Val

100 105 110

Thr Gly Gly Phe Lys Lys Leu Tyr Ala His Phe Pro Gln Asp Leu Gln

115 120 125

Pro Ala Ala Arg Leu Ala Glu Ile Pro Ser Val Pro Arg Ala Val Ala

130 135 140

Asp Asn Ala Gly Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Arg Val Ala Met

145 150 155 160

Val Gly Val Asp Tyr Gln Arg Arg Thr Met Asn Leu Tyr Phe Gln Phe

165 170 175

Thr Pro Asp Gly Arg Pro Glu Pro Gly Ala Leu Arg Ser Met Leu Arg

180 185 190

Glu Ile Gly Leu His Glu Ala Asp Glu Gly Met Leu Glu Phe Ala Ser

195 200 205

Arg Ser Met Arg Ala Asn Ile Thr Phe Ser Trp Asp Thr Ser Arg Ile

210 215 220

Val Arg Val Ala Phe Ala Pro Pro Pro Gly Lys Gly Leu Asp Pro Ala

225 230 235 240

Ala Val Pro Ala Pro Ile Glu Pro His Ile Ala Arg Phe Ala Thr Ser

245 250 255

Ala Pro Tyr Ala Tyr Ala Gly Glu Arg Met Asn Leu Phe Gly Val Lys

260 265 270

Trp Phe Pro Asp Gly Glu Phe Ile Asp Val Cys Ala Tyr Tyr Gln Leu

275 280 285

Ser Ala Gly Tyr Glu Pro Val Arg Leu Met Glu Thr His Lys Asn Pro

290 295 300

Thr

305

<210> 18

<211> 296

<212> PRT

<213> 暗黑链霉菌

<400> 18

Met Ser Gly Thr Pro Glu Val Ala Glu Leu Tyr Ser Ala Ile Glu Glu

1 5 10 15

Ser Ala Arg Leu Leu Asp Val Ala Cys Ser Arg Asp Lys Val Trp Pro

20 25 30

Ile Leu Thr Thr Tyr Gly Asp Ala Phe Ser His Ala Ala Thr Val Val

35 40 45

Ala Phe Arg Val Ala Thr Gly Gly Arg His Val Gly Glu Leu Asp Cys

50 55 60

Arg Phe Thr Thr His Pro Asn Asp Arg Asp Pro Tyr Ala Phe Ala Leu

65 70 75 80

Ser Asn Gly Leu Thr Arg Gln Thr Asp His Pro Val Gly Ala Leu Leu

85 90 95

Leu Asp Leu Gln Gly Arg Cys Pro Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Asp Phe

100 105 110

Gly Val Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Tyr Ala Phe Phe Thr Pro Asp

115 120 125

Asn Leu Gln Lys Leu Ser Arg Ile Ala Asp Leu Pro Ser Met Pro Gly

130 135 140

Ser Leu Ala Glu Asn Gly Asp Phe Phe Ala Arg His Gly Leu Asp Asp

145 150 155 160

Arg Val Gly Val Ile Gly Ile Asp Tyr Pro His Arg Thr Val Asn Val

165 170 175

Tyr Phe Asn Glu Val Pro Ala Glu Cys Phe Glu Ser Lys Thr Ile Leu

180 185 190

Ser Met Leu Arg Glu Ile Gly Leu Pro Glu Pro Ser Glu Gln Met Leu

195 200 205

Arg Leu Gly Gln Glu Ala Phe Gly Leu Tyr Val Thr Leu Asn Trp Asp

210 215 220

Ser Ser Lys Ile Glu Arg Ile Cys Tyr Ala Val Thr Thr Ala Asp Leu

225 230 235 240

Ala Thr Leu Pro Val Arg Met Glu Pro Glu Ile Glu Gln Phe Val Lys

245 250 255

Asp Val Pro Asn Gly Gly Ala Asp Arg Lys Phe Val Tyr Gly Val Ala

260 265 270

Ser Ser Pro Glu Gly Glu Tyr Tyr Lys Leu Glu Ser His Tyr Lys Trp

275 280 285

Lys Pro Gly Met Met Asp Phe Ile

290 295

<210> 19

<211> 304

<212> PRT

<213> 肉桂地链霉菌

<400> 19

Met Ser Pro Val Thr Gly Thr Glu Glu Val Tyr Ala Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Arg Leu Ala Gly Val Pro Cys Thr Arg Glu Lys Val His Pro

20 25 30

Val Leu Ser Ala Tyr Gly Glu Gly Leu Glu Arg Ala Gly Val Val Tyr

35 40 45

Ser Val Ser Thr Ser His Ser Thr Pro Thr Glu Leu Asp Tyr Thr Val

50 55 60

Thr Val Pro Ala Ala Gly Glu Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Val Arg His

65 70 75 80

Gly Phe Val Thr Pro Asp Gly His Pro Val His Thr Leu Leu Ser His

85 90 95

Leu Gln Ser Arg Cys Glu Ile Ser Glu Tyr Leu Val Asp Gly Gly Val

100 105 110

Val Gly Gly Phe Asn Lys Ile Tyr Ala His Phe Pro Gln Asp Val Gln

115 120 125

Lys Ile Ser Arg Leu Ala Glu Leu Pro Gly Met Pro Pro Ala Leu Ala

130 135 140

Arg Cys Ala Ala Leu Leu Glu Arg His Gly Leu Ser Asp Val Ala Met

145 150 155 160

Ile Gly Ile Asp Tyr Pro Arg Arg Thr Leu Asn Leu Tyr Phe Thr Gln

165 170 175

Leu Ser Glu Glu Cys Arg Ala Pro Gln Thr Ile Leu Ser Leu His Arg

180 185 190

Glu Ile Gly Leu Pro Ala Pro Gly Gln Pro Met Leu Asp Phe Ala Arg

195 200 205

Arg Ser Phe Arg Ile Tyr Thr Thr Leu Ser Trp Asp Ser Ala Gly Ile

210 215 220

Glu Arg Ile Cys Tyr Ala Pro Pro Pro Ala Arg Gly Trp Asp Pro Ala

225 230 235 240

Ala Leu Pro Ala Glu Ile Thr Glu Gln Val Arg Gly Phe Val Asp Gly

245 250 255

Ala Pro Arg Ala Tyr Glu Gly Glu Pro Ile Val Ile Ala Ala Val Lys

260 265 270

Trp Ala Pro Glu Gly Pro Tyr Leu Asn Leu Gly Pro Tyr Tyr Gln Leu

275 280 285

Ser Pro Leu Met Arg Lys Val Ile Ser Ala Val His Asn Lys Glu Ile

290 295 300

<210> 20

<211> 303

<212> PRT

<213> 绿青链霉菌

<400> 20

Met Glu Gly Glu Met Ser Glu Ala Ser Glu Leu Ala Val Ile Tyr Ser

1 5 10 15

Ala Ile Glu Glu Thr Ala Gln Leu Leu Asp Val Pro Cys Ser Arg Asp

20 25 30

Lys Val Gln Pro Ala Leu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Leu Thr Asp Ala

35 40 45

His Ile Val Phe Ser Met Ala Thr Gly Glu Arg Tyr Lys Gly Glu Leu

50 55 60

Ala Phe Asp Phe Thr Val Pro Thr Ala Ala Gly Asp Pro Tyr Ala Ile

65 70 75 80

Ala Leu Ala Asn Gly Leu Val Asp Glu Thr Asp His Pro Ile Arg Ser

85 90 95

Leu Phe Ser Asp Val Gln Glu Arg Cys Pro Val Asp Ser Tyr Gly Val

100 105 110

Asp Tyr Gly Leu Val Gly Gly Phe Lys Lys Thr Tyr Val Ser Phe Pro

115 120 125

Leu Gly Asp Leu Gln Gly Leu Ser Thr Leu Val Asp Val Pro Ser Met

130 135 140

Pro Arg Ala Leu Ala Glu His Ala Asp Phe Phe Ala Ser His Gly Leu

145 150 155 160

Asp Asp Lys Val Ser Ala Ile Ala Ile Asp Tyr Ala His Arg Thr Trp

165 170 175

Asn Val Tyr Phe Ser Gly Ile Pro Ala Glu Val Lys Glu Pro Gln Thr

180 185 190

Leu Arg Ser Val Leu Gln Arg Phe Gly Leu Pro Glu Pro Ser Glu Arg

195 200 205

Leu Met Glu Phe Ile Arg Thr Ser Phe Ala Met Tyr Thr Thr Phe Gly

210 215 220

Trp Asp Ser Thr Lys Ala Glu Arg Ile Cys Phe Ser Ala Arg Ser Ser

225 230 235 240

Asp Pro Met Ala Leu Pro Ala Gln Phe Glu Pro Gln Ile Ala Lys Phe

245 250 255

Ala Lys Ser Ala Pro Tyr Thr Tyr Thr Gly Glu Arg Val Leu Thr Tyr

260 265 270

Ala Gly Ala Leu Ser Pro Ser Glu Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Ser Phe

275 280 285

Tyr Gln Lys Thr Ser Lys Leu Ser Asp Arg Val Arg Pro Ala Thr

290 295 300

<210> 21

<211> 305

<212> PRT

<213> 唐德链霉菌

<400> 21

Met Ser Gly Ala Ala Asp Val Glu Arg Val Tyr Ala Ala Met Glu Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Leu Leu Asp Val Ser Cys Ala Arg Glu Lys Ile Tyr Pro

20 25 30

Leu Leu Thr Val Phe Gln Asp Thr Leu Thr Asp Gly Val Val Val Phe

35 40 45

Ser Met Ala Ser Gly Arg Arg Ser Thr Glu Leu Asp Phe Ser Ile Ser

50 55 60

Val Pro Val Ser Gln Gly Asp Pro Tyr Ala Thr Val Val Lys Glu Gly

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Thr Gly Ser Pro Val Asp Glu Leu Leu Ala Asp Thr

85 90 95

Val Lys His Leu Pro Val Ser Met Phe Ala Ile Asp Gly Glu Val Thr

100 105 110

Gly Gly Phe Lys Lys Thr Tyr Ala Phe Phe Pro Thr Asp Asp Met Pro

115 120 125

Gly Val Ala Gln Leu Thr Glu Ile Pro Ser Met Pro Ala Ser Val Ala

130 135 140

Glu Asn Ala Glu Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Lys Val Gln Met

145 150 155 160

Thr Ser Met Asp Tyr Lys Lys Arg Gln Val Asn Leu Tyr Phe Ser Asp

165 170 175

Leu Lys Gln Glu Tyr Leu Gln Pro Glu Ala Val Val Ala Leu Ala Arg

180 185 190

Glu Leu Gly Leu Gln Val Pro Gly Glu Leu Gly Leu Glu Phe Cys Lys

195 200 205

Arg Ser Phe Ala Val Tyr Pro Thr Leu Asn Trp Asp Thr Gly Lys Ile

210 215 220

Asp Arg Leu Cys Phe Ala Ala Ile Ser Thr Asp Pro Thr Leu Val Pro

225 230 235 240

Ser Thr Asp Glu Arg Asp Ile Glu Met Phe Arg Glu Tyr Ala Thr Lys

245 250 255

Ala Pro Tyr Ala Tyr Val Gly Glu Lys Arg Thr Leu Val Tyr Gly Leu

260 265 270

Thr Leu Ser Ser Thr Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Tyr Tyr His

275 280 285

Ile Thr Asp Ile Gln Arg Gln Leu Leu Lys Ala Phe Asp Ala Leu Glu

290 295 300

Asp

305

<210> 22

<211> 296

<212> PRT

<213> 相模原小单孢菌

<400> 22

Met Pro Gly Thr Ser Glu Ala Ala Glu Leu Cys Ser Thr Ile Glu Glu

1 5 10 15

Ser Ala Arg Leu Leu Asn Val Ala Tyr Ser Arg Asp Arg Val Trp Ser

20 25 30

Leu Leu Ser Ala Tyr Gly Asp Ala Phe Ala His Pro Gly Ala Val Val

35 40 45

Ala Phe Arg Val Ala Thr Ala Met Arg His Val Gly Glu Leu Asp Cys

50 55 60

Arg Phe Thr Thr His Pro Asp Asp Arg Asp Pro Tyr Ala Arg Ala Leu

65 70 75 80

Ser His Gly Leu Thr Pro Glu Thr Asp His Pro Val Gly Ser Leu Leu

85 90 95

Ala Glu Val Gln Gly Arg Cys Pro Val Glu Ser His Gly Ile Asp Phe

100 105 110

Gly Val Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Tyr Ala Phe Phe Thr Pro Asp

115 120 125

Asp Leu Gln Lys Thr Ser Lys Leu Ala Glu Ile Pro Ala Met Pro Arg

130 135 140

Ser Leu Ala Gly Asn Val Glu Phe Phe Ala Arg His Gly Leu Asp Asp

145 150 155 160

Arg Val Gly Val Phe Gly Ile Asp Tyr Pro Ser Arg Thr Val Asn Val

165 170 175

Tyr Phe Asn Asp Val Pro Ala Gly Ser Phe Asp Pro Glu Thr Ile Arg

180 185 190

Ser Thr Leu Arg Glu Ile Gly Met Ala Ala Pro Ser Glu Arg Met Leu

195 200 205

Lys Leu Gly Glu Lys Ala Phe Gly Leu Tyr Val Thr Leu Gly Trp Glu

210 215 220

Ser Ser Arg Ile Glu Arg Ile Cys Tyr Ala Ala Ala Thr Thr Asp Leu

225 230 235 240

Thr Thr Leu Pro Val Pro Val Glu Pro Glu Ile Glu Lys Phe Val Arg

245 250 255

Ser Val Pro Tyr Gly Gly Asp Asp Arg Lys Phe Val Tyr Gly Val Ala

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gly Glu Tyr Tyr Lys Leu Glu Ser His Tyr Arg Trp

275 280 285

Lys Pro Gly Ala Met Asp Phe Ile

290 295

<210> 23

<211> 293

<212> PRT

<213> 链霉菌属

<400> 23

Met Ser Ala Gln Ala Asp Val Glu Thr Val His Ser Ala Ile Glu Lys

1 5 10 15

Ala Ala Gly Leu Leu Asn Leu Thr Cys Ser Pro Gly Thr Val Arg Pro

20 25 30

Ile Leu Glu Ala Phe Gly Pro Phe Glu Gly Gly Val Ile Phe Ser Ala

35 40 45

Ser Ala Gly Glu Gly His Ala Gly Asp Leu Asp Leu Thr Ile Gln Val

50 55 60

Pro Arg Ala Ile Asp Asp Pro Tyr Thr His Ala Leu Thr His Gly Phe

65 70 75 80

Val Pro His Thr Asp His Pro Val Ser Thr Leu Leu Ser Asp Leu Lys

85 90 95

Glu His Val Ser Val Asp Glu Phe Leu Ile Asp Phe Gly Val Ile Ala

100 105 110

Gly Phe Asn Lys Ile Tyr Val His Phe Pro Arg Asp Leu Gln Gly Val

115 120 125

Ala Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ser Met Pro Arg Ala Leu Ala Asp Asn

130 135 140

Ala Gln Leu Phe Ala Arg His Gly Leu Asp Lys Val Ala Met Leu Ser

145 150 155 160

Ile Asp Tyr His Lys Arg Thr Ile Asn Pro Phe Phe Thr Phe Pro Asn

165 170 175

Gly Leu Glu Ala Lys Thr Ile Ser Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Val

180 185 190

Glu Glu Pro Asp Glu Glu Leu Val Glu Ser Ser Ser Lys Ile Phe Arg

195 200 205

Ala Tyr Pro Thr Leu Gly Trp Glu Ser Ser Lys Ile Asp Arg Ile Ser

210 215 220

Phe Ala Arg Ser Leu Asp Leu Pro Thr Ile Arg Pro Arg Val Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ile Val Arg Phe Val Thr Gly Thr Pro Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp

245 250 255

Arg Phe Ser Ile Ser Ile Val Lys Trp Ser Pro Asp Asp Thr Trp Phe

260 265 270

Asn Val Gly Ser Tyr Phe Gln Phe Gly Pro Leu Gln Arg Glu Val Leu

275 280 285

Gly Lys Val Leu Arg

290

<210> 24

<211> 309

<212> PRT

<213> 嗜盐糖单孢菌

<400> 24

Val Pro Lys Asp Ala Asp Pro Arg Ser Ser Val Tyr Ser Ala Ile Glu

1 5 10 15

Glu Ala Ala Gly Leu Met Gly Ala Pro Cys Ser Arg Glu Arg Val Trp

20 25 30

Pro Ile Leu Thr Ala Tyr Gly Asp Gly Ile Ser Glu Ala Gly Ile Val

35 40 45

Phe Ser Val Gln Thr Gly Glu Arg His Ala Gly Glu Leu Asp Tyr Thr

50 55 60

Ile Thr Val Pro Ala Asp Gly Pro Asp Pro Tyr Thr Ser Ala Leu Ser

65 70 75 80

Asn Gly Phe Leu Glu Ala Thr Gln His Pro Val Gly Thr Leu Leu Ser

85 90 95

Asp Ile Arg Ala Arg Cys His Ile Ser Glu Tyr Phe Ile Asp Cys Gly

100 105 110

Val Val Gly Gly Phe Asn Lys Val Tyr Ala His Phe Pro His Asp Pro

115 120 125

Leu Ser Val Glu Arg Leu Ala Glu Val Pro Ser Leu Pro Arg Ser Leu

130 135 140

Ala Asp Asn Leu Gly Phe Phe Leu Arg His Ala Leu Arg Asp Val Ala

145 150 155 160

Met Ile Ala Ile Asp Tyr Arg Lys Lys Thr Val Asn Leu Tyr Phe Ala

165 170 175

Gln Leu Ser Ala Glu Cys Leu Arg Ser Ala Asn Ile Arg Ala Met Leu

180 185 190

Arg Glu Ser Gly Leu Ser Glu Leu Asp Gly Pro Met Leu Asp Phe Ala

195 200 205

Leu Gly Ser Phe Arg Ile Tyr Val Thr Leu Ala Trp Asp Ser Ala Gly

210 215 220

Val Glu Arg Ile Ser Phe Ala Ser Leu Met Ser Ser Gly Trp Val Asn

225 230 235 240

Ala Ala Leu Ser Glu Phe Pro Val Arg Ile Glu Pro Glu Ile Glu Arg

245 250 255

Phe Val Lys Asn Ala Pro Gln Ala Tyr Ser Gly Asp Arg Val Arg Ile

260 265 270

Leu Ala Ile Lys Ser Ser Pro Gly Asp Glu Cys Leu Asn Phe Gly Ser

275 280 285

Tyr Tyr Gln Ile Ser Pro Val Val Arg Asn Leu Leu Ala Ala Arg Ala

290 295 300

Gly Asp Ala Glu Gln

305

<210> 25

<211> 298

<212> PRT

<213> 链霉菌属

<400> 25

Met Ser Gly Thr Ala Asp Ile Glu Arg Leu Tyr Pro Val Val Glu Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Leu Leu Asp Ile Ala Cys Pro Pro Glu Arg Met Arg Pro

20 25 30

Val Leu Thr Ala Phe Arg Asp Ala Leu Ala Asp Pro Val Val Phe Asn

35 40 45

Ala Val Thr Lys Gly Gly Arg Ile Ala Asp Leu Ser Phe Asp Phe Thr

50 55 60

Leu Pro Ala Ser Ala Gly Asp Pro Tyr Ala Ile Ala Val Ala His Gly

65 70 75 80

Leu Ala Glu Glu Thr Asp His Pro Ile Arg Thr Leu Phe Ser Asp Leu

85 90 95

Arg Ala Arg Leu Pro Val Gln Gly Tyr Gly Val Asp Tyr Gly Val Asn

100 105 110

Gly Gly Phe Asn Lys Thr Tyr Ala Phe Phe Pro Leu Gly Asp Leu Gln

115 120 125

Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Pro Ser Met Pro Pro Ala Leu Ser

130 135 140

Glu His Leu Ala Leu Phe Thr Glu His Gly Leu Gly His Lys Val Ser

145 150 155 160

Ala Leu Ala Ile Asp Tyr Ala Arg Arg Thr Trp Asn Val Tyr Phe Asn

165 170 175

Gly Leu Pro Ala Asp Phe Val Arg Arg Thr Ala Val Leu Pro Met Leu

180 185 190

Arg Ala Phe Gly Leu Pro Glu Pro Ser Glu Gln Leu Leu Asp Phe Ile

195 200 205

Glu Thr Ser Ser Ala Leu Tyr Pro Thr Phe Gly Trp Asp Ser Ser Lys

210 215 220

Ile Glu Arg Ile Ser Phe Ser Thr Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ala Arg Ile Glu Pro Lys Leu Glu Lys Phe Ala Arg Ser Ala Pro

245 250 255

Tyr Ala Tyr Glu Gly Glu Arg Val Leu Val Tyr Ala Gly Ala Leu Ser

260 265 270

Pro Ser Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Ala Thr Tyr Tyr Arg Met Ser Ala

275 280 285

Ala Ala His Asp Arg Val Arg Ala Ala Asn

290 295

<210> 26

<211> 306

<212> PRT

<213> 链霉菌属

<400> 26

Met Ser Lys Ala Thr Glu Val Asp Arg Val Tyr Ala Ala Val Glu Lys

1 5 10 15

Ala Ala Ala Leu Ala Gly Thr Thr Cys Ala Gly Asp Lys Val Arg Pro

20 25 30

Val Leu Thr Gly His Gln Asp Leu Leu Asp Glu Ala Val Ile Val Phe

35 40 45

Ser Met Thr Ala Ser Gly Ser His Ser Gly Gly Leu Asp Leu Ser Met

50 55 60

Thr Val Pro Ala Glu His Val Asp Pro Tyr Ser Phe Ala Leu Ser Glu

65 70 75 80

Gly Leu Ile Glu Pro Thr Asp His Pro Val Gly Ser Val Ile Ser Asp

85 90 95

Phe Gln Glu Arg Phe Pro Ile Gly Met Tyr Gly Ile Asp Val Asp Val

100 105 110

Ala Gly Gly Phe Lys Lys Ala Tyr Ala Ala Phe Pro Ser Asn Asp Leu

115 120 125

Arg Glu Leu Lys Gln Leu Phe Asp Leu Pro Ser Met Pro Ser Ala Ala

130 135 140

Ala Glu Asn Ala Glu Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Arg Val Thr

145 150 155 160

Gly Val Ser Val Asp Tyr Lys Arg His Glu Leu Asn Leu Tyr Cys Asp

165 170 175

Arg Ala Thr Thr Glu Pro Leu Asp Pro Asp Tyr Val Gln Ser Met Leu

180 185 190

Arg Asp Met Gly Leu Lys Glu Ala Ser Glu Gln Gly Leu Glu Phe Ala

195 200 205

Lys Lys Thr Phe Ala Ile Tyr Pro Thr Leu Asn Trp Asp Ser Ser Glu

210 215 220

Ile Val Arg Ile Cys Phe Ala Val Ile Thr Thr Asp Pro Ala Thr Thr

225 230 235 240

Pro Thr Arg Ser Glu Pro Glu Leu Gly Gln Met Trp Glu Tyr Ala Asn

245 250 255

Thr Ala Pro Tyr Ala Tyr Val Gly Glu Gln Arg Ala Leu Val Tyr Gly

260 265 270

Leu Ala Leu Ser Pro Glu Lys Glu Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Tyr Tyr

275 280 285

Gln Ile Ser Asp Tyr Gln Arg Lys Leu Val Lys Ala Phe Asp Ala Leu

290 295 300

Pro Glu

305

<210> 27

<211> 311

<212> PRT

<213> 链霉菌属

<400> 27

Met Tyr Gly Gly Thr Glu Val Glu Glu Val Tyr Ser Ala Leu Glu Lys

1 5 10 15

Ser Ala Gly Leu Val Gly Val Pro Cys Asn Arg Asp Lys Val Trp Pro

20 25 30

Ala Leu Ser Thr Tyr Gln Asp Ala Leu Gly Glu Ala Val Ile Val Phe

35 40 45

Ser Val Ala Thr Asp Glu Arg His Ala Gly Glu Leu Asp Tyr Thr Ile

50 55 60

Thr Val Pro Thr Gly Gly Ala Asp Pro Tyr Ala Leu Ala Leu Ala Lys

65 70 75 80

Gly Leu Thr Pro Glu Thr Asp His Pro Val Gly Thr Leu Leu Ala Gly

85 90 95

Val Gln Glu Arg Cys Pro Val Ala Gly Tyr Ala Val Asp Cys Gly Val

100 105 110

Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Tyr Ser Phe Phe Pro Gln Asp Asp Leu

115 120 125

Gln Gly Leu Ala Lys Leu Ala Glu Ile Pro Ser Met Pro Arg Ala Leu

130 135 140

Ala Glu Asn Ala Ala Leu Phe Ala Arg His Gly Leu Asp His Lys Val

145 150 155 160

Thr Met Leu Gly Ile Asp Tyr Gln Arg Glu Ser Val Asn Leu Tyr Phe

165 170 175

Gly Lys Leu Pro Glu Glu Cys Leu Gln Pro Asp Ser Ile Arg Ala Ile

180 185 190

Leu Arg Asp Ile Gly Leu Pro Glu Pro Thr Glu Pro Met Leu Glu Phe

195 200 205

Ala Arg Lys Ser Phe Ala Ile Tyr Val Thr Leu Ser Trp Asp Ala Ala

210 215 220

Lys Val Glu Arg Ile Cys Phe Ala Val Pro Pro Gly Arg Asp Leu Ile

225 230 235 240

Thr Leu Asp Pro Ser Ala Leu Pro Ala Arg Ile Ala Pro Glu Ile Glu

245 250 255

His Phe Ala Arg Asn Ser Pro Tyr Ala Tyr Pro Gly Asp Arg Met Leu

260 265 270

Val Tyr Gly Val Thr Trp Ser Pro Glu Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gly

275 280 285

Ser Tyr Tyr Gln Leu Pro Val Gln Thr Arg Lys Leu Leu Val Ala Phe

290 295 300

Asp Ser Val Lys Asp Gln Glu

305 310

<210> 28

<211> 310

<212> PRT

<213> 链霉菌属

<400> 28

Met Pro Glu Ser Lys Asn Ala Glu Ala Val Tyr Ser Ala Ile Glu Glu

1 5 10 15

Ser Ala Gly Leu Leu Asp Ile Pro Cys Ser Arg Gln Lys Val Met Ser

20 25 30

Val Leu Ser Ala Phe Gly Asp Gly Val Ser Glu Glu Ser Val Ile Val

35 40 45

Met Ala Met Ala Gly Gly Glu Arg His Gly Gly Asp Ile Asp Tyr Asn

50 55 60

Phe Thr Val Pro Thr Glu Val Gly Asp Pro Tyr Glu Ile Ala Val Ala

65 70 75 80

Asn Gly Trp Ile Glu Ala Leu Asp His Pro Ile Ala Asn Leu Leu Pro

85 90 95

Glu Ile Val Glu Ser Ser Pro Val Thr Phe Tyr Gly Val Glu Ala Gly

100 105 110

Val Val Glu Gly Phe Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Phe Pro Leu Asp Asn

115 120 125

Leu Gly Lys Leu Ser Thr Leu Ala Ser Leu Pro Ser Met Pro Arg Ser

130 135 140

Val Ala Glu His Ala Arg Thr Phe Asp Gly Leu Asn Gly Met Gly Asp

145 150 155 160

Arg Ile Ser Ile Ile Gly Ile Asp Tyr Ile Lys Arg Thr Val Asn Val

165 170 175

Tyr Phe Met Ala Gly Thr Leu Gly Glu Lys Ser Val Leu Ser Leu Leu

180 185 190

Glu Asp Thr Asn Leu Pro Ala Pro Thr Pro Asp Phe Leu Glu Phe Val

195 200 205

Gln Asn Ser Phe Ser Ile Tyr Pro Thr Phe Thr Tyr Glu Ser Ser Asp

210 215 220

Ile His Arg Ile Cys Phe Ser Ser Val Ser Pro Asp Asp Thr Ala Tyr

225 230 235 240

Pro Thr Thr Leu His Glu Glu Ile Ala Arg Phe Thr Lys Asn Ala Pro

245 250 255

Tyr Glu Tyr Asp Gly Ala Arg Val Leu Val Tyr Gly Ala Thr Ile Ser

260 265 270

Arg Arg Glu Glu Tyr His Lys Leu Gly Val Tyr Phe Arg Arg Pro Pro

275 280 285

Ala Phe Trp Asp Asn Leu Pro Leu Ala Ala Thr Phe Glu Lys Leu Ala

290 295 300

Ala Ala His Arg Gly Ala

305 310

<210> 29

<211> 302

<212> PRT

<213> 链霉菌属

<400> 29

Met Ser Glu Thr Ala Glu Leu Thr Lys Leu Tyr Ser Ile Ile Glu Lys

1 5 10 15

Thr Ala Gln Val Val Asp Val Thr Ala Ser Arg Asp Lys Val Gln Pro

20 25 30

Ile Leu Gln Ala Phe Gln Asp Val Phe Gly Gln Ser Val Ile Ser Phe

35 40 45

Arg Ala Ser Thr Gly Arg Thr Ser Ser Glu Glu Leu Asp Cys Arg Phe

50 55 60

Thr Met Leu Pro Lys Gly Phe Asp Pro Tyr Ala Arg Ala Leu Glu His

65 70 75 80

Gly Leu Thr Pro Lys Gln Asp His Pro Val Gly Thr Leu Leu Lys Glu

85 90 95

Val His Gln Glu Leu Pro Ile Asp Ser Cys Gly Val Asp Phe Gly Val

100 105 110

Val Gly Gly Phe Ala Lys Thr Trp Ser Phe Pro Ser Ala Ala Asn Leu

115 120 125

Leu Ser Ile Ser Gln Leu Thr Glu Leu Pro Ser Ile Pro Gly Gly Val

130 135 140

Ala Glu Asn Leu Asp Phe Phe Lys Lys Tyr Gly Leu Asp Asp Ile Val

145 150 155 160

Ser Thr Val Gly Ile Asp Tyr Thr Asn Arg Thr Met Asn Leu Tyr Phe

165 170 175

Gly Ala Gly Glu His Arg Cys Arg Pro Asn Val Ser Arg Ala Lys Gly

180 185 190

Val Lys Ala Ile Leu Lys Glu Cys Gly Leu Pro Glu Pro Ser Glu Glu

195 200 205

Leu Leu Lys Leu Ala Glu Arg Ala Phe Ser Ile Tyr Ile Thr Met Asn

210 215 220

Trp Asp Ser Pro Lys Ile Leu Arg Val Ser Tyr Ala Ala Met Thr Pro

225 230 235 240

Lys Pro Arg Ser Leu Ala Val Lys Met Ala Pro Ala Phe Asp Gln Leu

245 250 255

Leu Asn Asn Ala Pro Tyr Ser Thr Glu Gly His Asn Phe Val Tyr Gly

260 265 270

Ile Ala Ala Thr Pro Lys Gly Glu Tyr His Lys Ile Ala Ser Tyr Tyr

275 280 285

Gln Trp Gln Thr Arg Val Glu Gly Leu Leu His Ser Glu Ser

290 295 300

<210> 30

<211> 300

<212> PRT

<213> 肉桂地链霉菌

<400> 30

Met Met Ser Gly Thr Ala Asp Leu Ala Gly Val Tyr Ala Ala Val Glu

1 5 10 15

Glu Ser Ala Gly Leu Leu Asp Val Ser Cys Ala Arg Glu Lys Val Trp

20 25 30

Pro Ile Leu Ala Ala Phe Glu Asp Val Leu Pro Thr Ala Val Ile Ala

35 40 45

Phe Arg Val Ala Thr Asn Ala Arg His Glu Gly Glu Phe Asp Cys Arg

50 55 60

Phe Thr Val Pro Gly Ser Ile Asp Pro Tyr Ala Val Ala Leu Asp Lys

65 70 75 80

Gly Leu Thr His Arg Ser Gly His Pro Ile Glu Thr Leu Val Ala Asp

85 90 95

Val Gln Lys His Cys Ala Val Asp Ser Tyr Gly Val Asp Phe Gly Val

100 105 110

Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Trp Val Tyr Phe Pro Gly Gly Arg His

115 120 125

Glu Ser Leu Ala His Leu Gly Glu Ile Pro Ser Met Pro Pro Gly Leu

130 135 140

Ala Ala Thr Glu Gly Phe Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Ala Asp Lys Val

145 150 155 160

Asp Leu Ile Gly Val Asp Tyr Ala Ser Lys Thr Met Asn Val Tyr Phe

165 170 175

Ala Ala Ser Pro Glu Val Val Ser Ala Pro Thr Val Leu Ala Met His

180 185 190

Arg Glu Ile Gly Leu Pro Asp Pro Ser Glu Gln Met Leu Asp Phe Cys

195 200 205

Ser Arg Ala Phe Gly Val Tyr Thr Thr Leu Asn Trp Asp Ser Ser Lys

210 215 220

Val Glu Arg Ile Ala Tyr Ser Val Lys Thr Glu Asp Pro Leu Glu Leu

225 230 235 240

Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Glu Gln Phe Leu Lys Ser Val Pro

245 250 255

Tyr Gly Ile Asp Thr Pro Lys Met Val Tyr Ala Ala Val Thr Ala Gly

260 265 270

Gly Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gln Ser Tyr Tyr Gln Trp Arg Thr Asp

275 280 285

Ser Arg Leu Asn Leu Ser Tyr Ile Gly Gly Arg Ser

290 295 300

<210> 31

<211> 298

<212> PRT

<213> Nocardia concava

<400> 31

Met Gly Thr Ser Glu Leu Val Thr Leu Glu Arg Ile Arg Arg Asp Leu

1 5 10 15

Gln Glu Phe Ala Arg Leu Ala Glu Ala Pro Tyr Glu Ala Ala Ala Val

20 25 30

Asp Pro Val Leu Asp Ala Leu Glu Glu Leu Trp Thr Thr Ser Ile Leu

35 40 45

Gly Val Arg Thr Thr Thr His Pro Val Pro Arg Arg Arg Leu Asn Val

50 55 60

Arg Leu Met Asn Ser Gly Ser Gly Ala Asp Pro Val Thr Thr Leu Arg

65 70 75 80

Glu Ala Gly Leu Leu Glu Phe Thr Gly His Pro Met Glu Gln Leu Leu

85 90 95

Thr Glu Ile Pro Ala Ala Val Pro Val Leu Phe Gly Val Asp Val Gly

100 105 110

Val Ala Gln Gly Val Glu Lys Val Trp Met Met Phe Pro Glu Pro Ile

115 120 125

Ser Val Gln Arg Val Leu Ala Phe Pro Gly Ile Pro Asp Ala Ala Arg

130 135 140

Thr His Ala Pro His Leu Asn Arg Tyr Gly Gly Glu Ile Ala Ile Met

145 150 155 160

Ala Leu Asp Phe Ala Ser Arg Thr Met Asn Leu Tyr Ser Gln Val Phe

165 170 175

Ala Pro Gly Leu Leu Thr Ala Thr Asp Ile Thr Thr Ile Leu Ala Asp

180 185 190

Leu Glu Phe Ala Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ser Leu Leu Arg Gln

195 200 205

Thr Phe Asn Leu Tyr Arg Thr Phe Ser Trp Thr Ser Pro Arg Met Gln

210 215 220

Arg Ile Cys Phe Pro Val Arg His Gln Pro Ala Thr Phe Pro Thr His

225 230 235 240

Leu Asp Pro Val Leu Ala Arg Phe Val Ser Ala Ala Pro Tyr Ala Gly

245 250 255

Thr Gly Ser Gln Thr Phe Thr Phe Tyr Thr Ala Tyr Gly Pro Thr Asp

260 265 270

Arg Tyr Tyr Lys Ile Gln Ala Glu Tyr Thr Ser Pro Arg His Ile Pro

275 280 285

Phe Pro Gly Gly Thr Glu Pro Pro Val Asn

290 295

<210> 32

<211> 293

<212> PRT

<213> 叶柄粘球菌

<400> 32

Met Pro Ala Leu Ser Leu Gly Leu Glu Arg Leu Cys Ala Asp Val Glu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ser Phe Ser Arg Glu Val Thr Arg

20 25 30

Asn Val Leu Lys Ser Tyr Pro Arg Phe Phe Thr Ser Ser Ala Val Ser

35 40 45

Phe Arg Thr Ser Thr Arg Lys Pro Glu Lys Arg Glu Leu Asn Val Arg

50 55 60

Phe Val Glu Leu Glu Thr Pro Glu Asp Pro His Ala Val Ala Leu Ala

65 70 75 80

Glu Gly Leu Ile His Arg Ser Gly His Pro Ile Asp Asp Leu Phe Glu

85 90 95

Gln Val Gln Arg Asn Val Pro Ile Leu Gly Tyr Gly Leu Asp Phe Gly

100 105 110

Val Ala Tyr Gly Val Glu Lys Ile Trp Pro Phe Phe Pro His Arg Pro

115 120 125

Gln Pro Leu Glu Val Leu Arg Thr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val

130 135 140

Gln Ala His Ser Gly Phe Leu Val Glu His Asp Leu Thr Asp Leu Ser

145 150 155 160

Leu Phe Ala Leu Asp Tyr Arg Ser Arg Ser Val Asn Leu Tyr Phe Met

165 170 175

Cys Arg Pro Gly His Phe Ser Thr Ala Gln Leu Ala Asp Leu Leu Gly

180 185 190

Gly Leu Gly Phe Glu Ser Pro Gly Glu Glu Leu Leu Glu His Cys Thr

195 200 205

Arg Ala Val Pro Ile Tyr Phe Thr Phe Arg Trp Asp Arg Pro Arg Ile

210 215 220

Glu Arg Val Cys Phe Gly Val Ile Ala Pro Gly Pro Gly Leu Leu Pro

225 230 235 240

Thr His Leu His Pro Ile Ile Gly Gln Phe Ala Ala Gly Val Pro Phe

245 250 255

Ala Thr Glu Arg Arg Asn Phe Ile Tyr Ser Val Thr Val Ser Arg Glu

260 265 270

Glu Thr Phe Ile Lys Ile Glu Asn Asp Tyr Ser Gly Thr Met Thr Ala

275 280 285

Leu Met Gln Val Phe

290

<210> 33

<211> 300

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 细菌或真菌异戊二烯基转移酶

<400> 33

Met Met Ser Gly Thr Ala Asp Leu Ala Gly Val Tyr Ala Ala Val Glu

1 5 10 15

Glu Ser Ala Gly Leu Leu Asp Val Ser Cys Ala Arg Glu Lys Val Trp

20 25 30

Pro Ile Leu Ala Ala Phe Glu Asp Val Leu Pro Thr Ala Val Ile Ala

35 40 45

Phe Arg Val Ala Thr Asn Ala Arg His Glu Gly Glu Phe Asp Cys Arg

50 55 60

Phe Thr Val Pro Gly Ser Ile Asp Pro Tyr Ala Val Ala Leu Asp Lys

65 70 75 80

Gly Leu Thr His Arg Ser Gly His Pro Ile Glu Thr Leu Val Ala Asp

85 90 95

Val Gln Lys His Cys Ala Val Asp Ser Tyr Gly Val Asp Phe Gly Val

100 105 110

Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Trp Val Tyr Phe Pro Gly Gly Arg His

115 120 125

Glu Ser Leu Ala His Leu Gly Glu Ile Pro Ser Met Pro Pro Gly Leu

130 135 140

Ala Ala Thr Glu Gly Phe Phe Ala Arg Tyr Gly Leu Ala Asp Lys Val

145 150 155 160

Asp Leu Ile Gly Val Asp Tyr Ala Ser Lys Thr Met Asn Val Tyr Phe

165 170 175

Ala Ala Ser Pro Glu Val Val Ser Ala Pro Thr Val Leu Ala Met His

180 185 190

Arg Glu Ile Gly Leu Pro Asp Pro Ser Glu Gln Met Leu Asp Phe Cys

195 200 205

Ser Arg Ala Phe Gly Val Tyr Thr Thr Leu Asn Trp Asp Ser Ser Lys

210 215 220

Val Glu Arg Ile Ala Tyr Ser Val Lys Thr Glu Asp Pro Leu Glu Leu

225 230 235 240

Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Glu Gln Phe Leu Lys Ser Val Pro

245 250 255

Tyr Gly Ile Asp Thr Pro Lys Met Val Tyr Ala Ala Val Thr Ala Gly

260 265 270

Gly Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gln Ser Tyr Tyr Gln Trp Arg Thr Asp

275 280 285

Ser Arg Leu Asn Leu Ser Tyr Ile Gly Gly Arg Ser

290 295 300

<210> 34

<211> 304

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 未知

<400> 34

Met Ser Pro Val Thr Gly Thr Glu Glu Val Tyr Ala Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Arg Leu Ala Gly Val Pro Cys Thr Arg Glu Lys Val His Pro

20 25 30

Val Leu Ser Ala Tyr Gly Glu Gly Leu Glu Arg Ala Gly Val Val Tyr

35 40 45

Ser Val Ser Thr Ser His Ser Thr Pro Thr Glu Leu Asp Tyr Thr Val

50 55 60

Thr Val Pro Ala Ala Gly Glu Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Val Arg His

65 70 75 80

Gly Phe Val Thr Pro Asp Gly His Pro Val His Thr Leu Leu Ser His

85 90 95

Leu Gln Ser Arg Cys Glu Ile Ser Glu Tyr Leu Val Asp Gly Gly Val

100 105 110

Val Gly Gly Phe Asn Lys Ile Tyr Ala His Phe Pro Gln Asp Val Gln

115 120 125

Lys Ile Ser Arg Leu Ala Glu Leu Pro Gly Met Pro Pro Ala Leu Ala

130 135 140

Arg Cys Ala Ala Leu Leu Glu Arg His Gly Leu Ser Asp Val Ala Met

145 150 155 160

Ile Gly Ile Asp Tyr Pro Arg Arg Thr Leu Asn Leu Tyr Phe Thr Gln

165 170 175

Leu Ser Glu Glu Cys Arg Ala Pro Gln Thr Ile Leu Ser Leu His Arg

180 185 190

Glu Ile Gly Leu Pro Ala Pro Gly Gln Pro Met Leu Asp Phe Ala Arg

195 200 205

Arg Ser Phe Arg Ile Tyr Thr Thr Leu Ser Trp Asp Ser Ala Gly Ile

210 215 220

Glu Arg Ile Cys Tyr Ala Pro Pro Pro Ala Arg Gly Trp Asp Pro Ala

225 230 235 240

Ala Leu Pro Ala Glu Ile Thr Glu Gln Val Arg Gly Phe Val Asp Gly

245 250 255

Ala Pro Arg Ala Tyr Glu Gly Glu Pro Ile Val Ile Ala Ala Val Lys

260 265 270

Trp Ala Pro Glu Gly Pro Tyr Leu Asn Leu Gly Pro Tyr Tyr Gln Leu

275 280 285

Ser Pro Leu Met Arg Lys Val Ile Ser Ala Val His Asn Lys Glu Ile

290 295 300

<210> 35

<211> 307

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 未知

<400> 35

Met Pro Gly Thr Asp Asp Val Ala Val Asp Val Ala Ser Val Tyr Ser

1 5 10 15

Ala Ile Glu Lys Ser Ala Gly Leu Leu Asp Val Thr Ala Ala Arg Glu

20 25 30

Val Val Trp Pro Val Leu Thr Ala Phe Glu Asp Val Leu Glu Gln Ala

35 40 45

Val Ile Ala Phe Arg Val Ala Thr Asn Ala Arg His Glu Gly Asp Phe

50 55 60

Asp Val Arg Phe Thr Val Pro Glu Glu Val Asp Pro Tyr Ala Val Ala

65 70 75 80

Leu Ser Arg Ser Leu Ile Ala Lys Thr Asp His Pro Val Gly Ser Leu

85 90 95

Leu Ser Asp Ile Gln Gln Leu Cys Ser Val Asp Thr Tyr Gly Val Asp

100 105 110

Leu Gly Val Lys Ser Gly Phe Lys Lys Val Trp Val Tyr Phe Pro Ala

115 120 125

Gly Glu His Glu Thr Leu Ala Arg Leu Thr Gly Leu Thr Ser Met Pro

130 135 140

Gly Ser Leu Ala Gly Asn Val Asp Phe Phe Thr Arg Tyr Gly Leu Ala

145 150 155 160

Asp Lys Val Asp Val Ile Gly Ile Asp Tyr Arg Ser Arg Thr Met Asn

165 170 175

Val Tyr Phe Ala Ala Pro Ser Glu Cys Phe Glu Arg Glu Thr Val Leu

180 185 190

Ala Met His Arg Asp Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ser Glu Gln Met Phe

195 200 205

Lys Phe Cys Glu Asn Ser Phe Gly Leu Tyr Thr Thr Leu Asn Trp Asp

210 215 220

Thr Met Glu Ile Glu Arg Ile Ser Tyr Gly Val Lys Thr Glu Asn Pro

225 230 235 240

Met Thr Phe Phe Ala Arg Leu Gly Thr Lys Val Glu His Phe Val Lys

245 250 255

Asn Val Pro Tyr Gly Val Asp Thr Gln Lys Met Val Tyr Ala Ala Val

260 265 270

Thr Ser Ser Gly Glu Glu Tyr Tyr Lys Leu Gln Ser Tyr Tyr Arg Trp

275 280 285

Arg Ser Val Ser Arg Leu Asn Ala Ala Tyr Ile Ala Ala Arg Asp Lys

290 295 300

Glu Ser Thr

305

<210> 36

<211> 327

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 未知

<400> 36

Met Val Gly Ser His Thr Arg Ile Ser Gln Asn Leu Ile Gly Ile Asp

1 5 10 15

Cys Leu Glu Cys Leu Val Ser Gly Ala Thr Gly Ala Glu Lys Leu Tyr

20 25 30

Ser Ala Ile Glu Glu Ser Ala Arg Met Val Asp Ala Pro Phe Ser Arg

35 40 45

Asp Lys Val Trp Pro Thr Leu Ser Ala Phe Glu Gly Gly Phe Ser Asp

50 55 60

Ala Gly Gly Val Ile Leu Ser Leu Gln Ala Gly Thr His Val Pro Glu

65 70 75 80

Met Glu Tyr Ser Ala Gln Val Ser Pro Gly Ile Ser Asp Pro Tyr Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Ala Ser Gly Ile Leu Thr Glu Thr Asp His Pro Val Ser

100 105 110

Thr Val Leu Ala Glu Ile Val Ser Leu Ala Pro Thr Ser Glu His Tyr

115 120 125

Ile Asp Cys Gly Ile Val Gly Gly Phe Lys Lys Ile Tyr Ala Asn Phe

130 135 140

Pro His Asp Gln Gln Thr Val Ala Ala Leu Ala Gly Leu Pro Ser Met

145 150 155 160

Pro Arg Ala Val Gly Gly Asn Ala Glu Phe Phe Ala Arg His Gly Leu

165 170 175

Asp Arg Val Ala Leu Ile Gly Val Asp Tyr Val Asn Lys Thr Ile Asn

180 185 190

Leu Tyr Phe Gln Val Ser Ala Ala Thr Ala Gly Asn Leu Asp Gln Lys

195 200 205

Thr Val Ser Ala Met Leu His Glu Thr Gly Met Ser Glu Pro Ser Asp

210 215 220

Ala Met Val Ala Tyr Ala Cys Gln Ala Tyr Arg Ile Tyr Thr Thr Leu

225 230 235 240

Ser Trp Asp Ala Glu Glu Ile Leu Arg Ile Ala Phe Ala Pro Lys Pro

245 250 255

Arg Arg Gly Ile Asp Pro Ala Asp Leu Pro Ala Arg Leu Glu Pro Arg

260 265 270

Ile Glu Lys Phe Leu Arg Ala Thr Pro His Lys Tyr Pro Gly Ala Leu

275 280 285

Ile Asn Ala Thr Ala Ala Lys Trp Ser Pro Glu Arg Glu Val Leu Asp

290 295 300

Leu Ala Ala His Tyr Gln Val Ser Ala Val Gln Met Lys Ala Ile Glu

305 310 315 320

Ala Glu Glu Gly Gln Ala Ser

325

<210> 37

<211> 10584

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有盘基网柄菌DiPKS(G1516D; G1518A)编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> LV3

<222> (1)..(40)

<220>

<221> 酿酒酵母GAL1启动子

<222> (41)..(482)

<220>

<221> L1

<222> (483)..(522)

<220>

<221> DiPKS

<222> (523)..(9966)

<220>

<221> C-甲基转移酶结构域

<222> (5050)..(5412)

<220>

<221> 基序1

<222> (5050)..(5076)

<220>

<221> G1516D

<222> (5068)..(5070)

<220>

<221> G1518A

<222> (5074)..(5076)

<220>

<221> 基序2

<222> (5309)..(5331)

<220>

<221> 基序3

<222> (5389)..(5421)

<220>

<221> L2

<222> (9967)..(10006)

<220>

<221> PRM9t

<222> (10007)..(10544)

<220>

<221> LV5

<222> (10545)..(10584)

<400> 37

aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc cggattagaa gccgccgagc 60

gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 120

tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 180

tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 240

tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 300

tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 360

aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 420

aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 480

agctagaaaa tttattataa aaggaagaga aataattaaa caatgaacaa gaactccaaa 540

atccagtccc caaactcttc tgatgttgct gttattggtg ttggttttag attcccaggt 600

aactctaatg acccagaatc tttgtggaac aacttgttgg atggtttcga tgctattacc 660

caagtcccaa aagaaagatg ggctacttct tttagagaga tgggtttgat caagaacaag 720

ttcggtggtt tcttgaagga ttctgaatgg aagaatttcg accctttgtt ctttggtatc 780

ggtccaaaag aagctccatt cattgatcca caacaaaggt tgttgttgtc catcgtttgg 840

gaatctttgg aagatgctta catcagacca gatgaattga gaggttctaa cactggtgtt 900

ttcatcggtg tttctaacaa cgattacacc aagttgggtt tccaagacaa ctactctatt 960

tctccataca ctatgaccgg ctctaactct tcattgaact ccaacagaat ttcctactgc 1020

ttcgatttta gaggtccatc cattactgtt gataccgctt gttcttcttc cttggtttct 1080

gttaatttgg gtgtccaatc catccaaatg ggtgaatgta agattgctat ttgcggtggt 1140

gttaacgctt tgtttgatcc atctacatct gttgcctttt ccaagttggg tgttttgtct 1200

gaaaatggca gatgcaactc ttttagtgat caagcctctg gttacgttag atctgaaggt 1260

gctggtgttg ttgttttgaa gtctttggaa caagctaagt tggatggtga tagaatctac 1320

ggtgttatca agggtgtttc ctctaatgaa gatggtgctt ctaatggtga caagaactct 1380

ttgactactc catcttgtga agcccaatcc attaacattt ctaaggctat ggaaaaggcc 1440

tccttgtctc catctgatat ctattacatt gaagcccatg gtactggtac tccagttggt 1500

gatccaattg aagttaaggc cttgtccaag atcttctcca actctaacaa caaccagttg 1560

aacaacttct ctaccgatgg taatgataac gatgatgatg atgacgataa cacctctcca 1620

gaaccattat tgattggctc attcaagtcc aacatcggtc atttggaatc tgctgctggt 1680

attgcttctt tgattaagtg ttgcttgatg ttgaagaaca ggatgttggt tccatccatt 1740

aactgctcta atttgaaccc atccattcca ttcgatcagt acaacatctc cgttatcaga 1800

gaaatcagac aattcccaac cgataagttg gttaacatcg gtatcaattc tttcggtttc 1860

ggtggttcta actgccattt gattattcaa gagtacaaca acaacttcaa gaacaactct 1920

accatctgca ataacaacaa caacaacaat aacaacatcg actacttgat cccaatctcc 1980

tctaagacta agaagtcctt ggataagtac ttgattttga tcaagaccaa ctccaactac 2040

cacaaggata tttctttcga tgacttcgtc aagttccaaa tcaagtctaa gcagtacaac 2100

ttgtccaaca gaatgactac cattgctaac gattggaact ccttcattaa gggttctaac 2160

gaattccaca acttgatcga atctaaggat ggtgaaggtg gttcttcatc ttctaacaga 2220

ggtattgatt ccgccaatca aatcaacact actactacct ctaccatcaa cgatatcgaa 2280

cctttgttgg ttttcgtttt ctgtggtcaa ggtccacaat ggaatggtat gattaagacc 2340

ttgtacaact ccgagaacgt tttcaagaac accgttgatc atgttgacag catcttgtac 2400

aagtacttcg gttactccat tttgaacgtc ttgtctaaga tcgatgataa cgacgattcc 2460

atcaaccatc caatagttgc tcaaccatct ttgttcttgt tgcaaattgg tttggtcgag 2520

ttgtttaagt actggggtat ctacccatct atctctgttg gtcattcttt cggtgaagtc 2580

tcttcttatt acttgtccgg tatcatctct ttggaaaccg cttgtaaaat cgtctacgtc 2640

agatcctcta atcagaacaa aactatgggt tccggtaaga tgttggttgt ttctatgggt 2700

tttaagcaat ggaacgatca attctctgct gaatggtccg atattgaaat tgcttgttac 2760

aacgctccag attccatagt tgttactggt aacgaagaaa gattgaaaga attgtccatc 2820

aagttgtccg acgaatccaa tcaaattttc aacaccttct tgaggtcccc atgttctttt 2880

cattcttccc atcaagaagt catcaagggt tctatgttcg aagagttgtc taacttgcaa 2940

tctactggtg aaaccgaaat ccctttgttc tctactgtta ctggtagaca agttttgtct 3000

ggtcatgtta ctgctcaaca catctacgat aatgttagag aaccagtctt gttccaaaag 3060

acgattgaat ccattacctc ctacatcaag tctcactacc catccaatca aaaggttatc 3120

tacgttgaaa ttgctccaca cccaaccttg ttttcattga tcaaaaagtc catcccatcc 3180

tccaacaaga attcctcttc tgttttgtgt ccattgaaca gaaaagaaaa ctccaacaac 3240

tcctacaaga agttcgtttc tcagttgtac ttcaacggtg ttaacgttga cttcaacttc 3300

cagttgaact ccatttgcga taacgttaac aacgatcacc atttgaacaa cgtcaagcaa 3360

aactccttca aagagactac caattccttg ccaagatacc aatgggaaca agatgaatat 3420

tggtccgaac cattgatctc cagaaagaat agattggaag gtccaactac ttccttgttg 3480

ggtcatagaa ttatctacag cttcccagtt ttccaatccg ttttggactt gcaatctgac 3540

aactacaaat acttgttgga ccacttggtt aacggtaagc cagtttttcc aggtgctggt 3600

tatttggata tcatcatcga attcttcgac taccaaaagc agcagttgaa ttcctctgat 3660

tcctctaact cctacatcat caacgttgac aagatccaat tcttgaaccc aattcacttg 3720

accgaaaaca agttgcaaac cttgcaatct tctttcgaac ctatcgttac taagaagtct 3780

gccttctctg ttaacttctt catcaaggat accgtcgagg atcaatctaa ggttaagtct 3840

atgtctgacg aaacttggac taacacttgt aaggctacca tttccttgga acaacaacag 3900

ccatctccat cttctacttt gactttgtct aagaagcaag acttgcagat cttgagaaac 3960

agatgcgata ttagcaagct agacaagttt gagttgtacg acaagatctc taagaatttg 4020

ggcttgcagt acaactcctt gtttcaagtt gttgatacca tcgaaactgg taaggattgc 4080

tcttttgcta ctttgtcttt gccagaagat actttgttca ccaccatttt gaacccatgc 4140

ttgttggata actgtttcca tggtttgttg accttgatca acgaaaaggg ttctttcgtt 4200

gtcgagtcca tttcttctgt ttctatctac ttggagaaca tcggttcctt caatcaaact 4260

tctgttggta acgtccagtt ctacttgtac accactattt ctaaagccac ctcctttagt 4320

tctgaaggta cttgtaagtt gttcaccaag gatggttcct tgattttgtc tatcggtaag 4380

ttcatcatca agtccaccaa tccaaagtct actaagacca acgaaactat cgaatctcca 4440

ttggacgaaa ccttctctat tgaatggcaa tctaaggatt ctccaattcc aaccccacaa 4500

caaatccaac aacaatctcc attgaactct aacccatcct tcattagatc taccatcttg 4560

aaggacatcc agttcgaaca atactgctcc tccattatcc acaaagaatt gatcaaccac 4620

gaaaagtaca agaaccagca atccttcgat atcaactcct tggaaaacca cttgaacgat 4680

gaccaattga tggaatcctt gtccatctcc aaagaatact tgagattctt caccaggatc 4740

atctccatca ttaagcaata cccaaagatc ttgaacgaaa aagagctaaa agaattgaaa 4800

gaaatcatcg aattgaagta cccatccgaa gttcagttgt tggaattcga agttatcgag 4860

aaggtgtcca tgattatccc aaagttgttg ttcgaaaacg acaagcaatc ttccatgacc 4920

ttgttccaag ataacttgtt gaccaggttc tactccaatt ctaactctac cagattctac 4980

ttggaaaggg tttccgaaat ggtcttggaa tctattagac caatcgtcag agaaaagagg 5040

gtgttcagaa ttttggaaat tggtgctgat acagcctctt tgtctaatgt tgttttgact 5100

aagttgaaca cctacttgtc caccttgaat tctaatggtg gttctggtta caacatcatc 5160

attgagtaca ccttcaccga tatttccgcc aacttcatta ttggtgaaat ccaagaaacc 5220

atgtgcaact tgtacccaaa cgttactttc aagttctccg tcttggactt ggagaaagag 5280

attattaact cctccgattt cttgatgggt gattacgata tagttttgat ggcctacgtt 5340

atccatgccg tttctaacat taagttctcc atcgaacagt tgtacaagtt gttgtctcca 5400

agaggttggt tgttgtgtat tgaacctaag tccaacgttg tgttctccga tttggttttc 5460

ggttgtttta atcagtggtg gaactactac gatgatatta gaactaccca ctgctccttg 5520

tctgaatctc aatggaatca gttgttgttg aaccagtcct tgaacaacga atcctcttct 5580

tcttctaact gttacggtgg tttctccaac gtttctttta ttggtggtga aaaggatgtc 5640

gactcccatt ctttcatatt gcactgccaa aaagaatcca tctcccaaat gaagttagcc 5700

accactatta acaacggttt gtcatctggt tccatcgtta tcgttttgaa ctctcaacaa 5760

ttgaccaaca tgaagtccta cccaaaggtt attgagtata ttcaagaggc tacctctttg 5820

tgcaagacca ttgaaattat cgattccaag gacgtcttga actctaccaa ttcagttttg 5880

gaaaagatcc aaaagtcctt gttggtgttc tgtttgttgg gttatgactt gttggagaac 5940

aactaccaag aacagtcttt cgaatacgtt aagttgttga acttgatctc tactaccgcc 6000

tcttcatcta atgataagaa accaccaaag gtcttgttga tcaccaagca atctgaaaga 6060

atctccaggt ctttctactc cagatccttg attggtattt ccagaacctc tatgaacgag 6120

tacccaaatt tgtccattac ctctatcgat ttggatacca acgactactc attgcagtct 6180

ttgttgaagc caatcttcag caactctaag ttttccgaca acgagttcat cttcaaaaag 6240

ggcttgatgt tcgtgtccag gatctttaag aacaagcagt tgctagaatc ctccaacgct 6300

tttgaaactg actcttctaa cttgtactgt aaggcctctt ctgacttgtc ttacaagtac 6360

gctattaagc agtctatgtt gaccgaaaat cagatcgaaa tcaaggttga atgcgtcggt 6420

attaacttca aggacaacct attctacaag ggcttgttgc cacaagaaat tttcagaatg 6480

ggtgacatct acaatccacc atatggtttg gaatgctctg gtgttattac cagaattggt 6540

tctaacgtca ccgaatactc agttggtcaa aatgtttttg gtttcgccag acattctttg 6600

ggttctcatg ttgttaccaa caaggatttg gttatcttga agccagatac catctcattt 6660

tctgaagctg cttctatccc agttgtttac tgtactgctt ggtactcctt gttcaacatt 6720

ggtcagttgt ctaacgaaga atccatccta attcattctg ctactggtgg tgtaggtttg 6780

gcttctttga atttgttgaa aatgaagaat cagcaacagc aaccattgac caatgtttat 6840

gctactgttg gctctaacga gaagaagaag ttcttgatcg ataacttcaa caacttgttc 6900

aaagaggacg gcgaaaacat tttctctacc agagacaaag aatactccaa ccagttggaa 6960

tccaagatcg atgttatttt gaacaccttg tccggtgaat tcgtcgaatc taatttcaag 7020

tccttgagat ccttcggtag attgattgat ttgtctgcta ctcacgttta cgccaatcaa 7080

caaattggtc taggtaactt caagttcgac cacttgtatt ctgctgttga cttggaaaga 7140

ttgatcgacg aaaaacctaa gttgttgcag tccatcttgc aaagaattac caactctatc 7200

gtcaacggtt ccttggaaaa aattccaatt accatcttcc catccaccga aactaaggat 7260

gctatcgaat tattgtccaa gagatcccat atcggtaaag ttgttgtaga ttgcaccgat 7320

atctctaagt gtaatcctgt tggtgatgtg atcaccaact tctctatgag attgccaaag 7380

ccaaactacc agttgaattt gaactccacc ttgttgatta ctggtcagtc tggtttgtct 7440

atccctttgt tgaattggtt gttgtctaag tctggtggta acgttaagaa cgttgtcatc 7500

atttctaagt ccaccatgaa gtggaagttg cagactatga tttcccattt cgtttccggt 7560

ttcggtatcc attttaacta cgttcaagtc gacatctcca actacgatgc tttgtctgaa 7620

gctattaagc aattgccatc tgatttgcca ccaatcacct ctgtttttca tttggctgct 7680

atctacaacg atgttccaat ggatcaagtt accatgtcta ccgttgaatc tgttcataac 7740

cctaaagttt tgggtgccgt taacttgcat agaatctctg tttcttttgg ttggaagttg 7800

aaccacttcg tcttgttctc ttctattact gctattaccg gttacccaga ccaatctatc 7860

tacaattctg ccaactctat tttggacgct ttgtccaact ttagaaggtt tatgggtttg 7920

ccatccttct ccattaactt gggtccaatg aaggatgaag gtaaggtttc taccaacaag 7980

agcatcaaga agctattcaa gtctagaggt ttgccaagcc tatccttgaa caagttattt 8040

ggtttgttgg aggtcgtcat caacaaccca tctaatcatg ttatcccatc ccaattgatt 8100

tgctccccaa tcgatttcaa gacctacatc gaatctttct caactatgag gccaaagttg 8160

ttacacttgc aacctaccat ttccaagcag caatcttcta tcattaacga ttctaccaag 8220

gcttcctcca acatttcatt gcaagataag atcacctcca aggtgtctga tttgttgtcc 8280

attccaatct ccaagatcaa cttcgatcat ccattgaaac actacggctt ggattctttg 8340

ttgaccgttc aattcaaatc ctggatcgac aaagaattcg aaaagaactt gttcacccat 8400

atccaattgg ccaccatctc tattaactca ttcttggaaa aggtgaacgg cttgtctaca 8460

aacaataaca acaacaacaa ttccaacgtc aagtcctctc catccattgt caaagaagaa 8520

atcgttacct tggacaagga tcaacaacca ttgctattga aagaacacca gcacattatc 8580

atctccccag atattagaat caacaagcca aagagggaat ccttgattag aaccccaatc 8640

ttgaacaaat tcaaccagat caccgaatcc attatcactc catctacacc atctttgtcc 8700

caatccgatg ttttgaaaac tccaccaatc aagtctttga acaacactaa gaactccagc 8760

ttgattaaca ccccaccaat tcaatctgtc caacaacatc aaaagcaaca acaaaaggtc 8820

caagtcatcc aacaacagca acaaccatta tccagattgt cctacaagag caacaacaac 8880

tctttcgttt tgggtatcgg tatttctgtt ccaggtgaac ctatttccca acaatccttg 8940

aaagactcca tctccaatga cttttctgat aaggctgaaa ctaacgagaa ggtcaagaga 9000

atctttgagc aatctcaaat caagaccaga cacttggtta gagattacac taagccagag 9060

aactccatca agttcagaca tttggaaacc attaccgatg tgaacaacca gttcaagaaa 9120

gttgttccag atttggctca acaagcctgt ttgagagctt tgaaagattg gggtggtgat 9180

aagggtgata ttacccatat agtttctgtt acctccaccg gtattatcat cccagatgtt 9240

aatttcaagt tgatcgactt gttgggcttg aacaaggatg ttgaaagagt gtctttgaac 9300

ctaatgggtt gtttggctgg tttgagttct ttgagaactg ctgcttcttt ggctaaggct 9360

tctccaagaa atagaatttt ggttgtctgt accgaagtct gctccttgca tttttctaat 9420

actgatggtg gtgatcaaat ggtcgcctct tctatttttg ctgatggttc tgctgcttac 9480

attattggtt gtaacccaag aattgaagaa accccattat acgaagtcat gtgctccatt 9540

aacagatctt tcccaaatac cgaaaacgcc atggtttggg atttggaaaa agaaggttgg 9600

aacttgggtt tggatgcttc tattccaatt gtcattggtt ctggtattga agccttcgtt 9660

gatactttgt tggataaggc taagttgcaa acttccactg ctatttctgc taaggattgc 9720

gaattcttga ttcatactgg tggcaagtcc atcttgatga acatcgaaaa ttccttgggt 9780

atcgacccaa agcaaactaa gaatacttgg gatgtttacc atgcctacgg caatatgtca 9840

tctgcctctg ttattttcgt tatggatcat gccagaaagt ccaagtcttt gccaacttac 9900

tcaatttctt tggcttttgg tccaggtttg gcttttgaag gttgtttctt gaagaacgtc 9960

gtctaaagac ataaaactga aacaacacca attaataata gactttacag aagacgggag 10020

acactagcac acaactttac caggcaaggt atttgacgct agcatgtgtc caattcagtg 10080

tcatttatga ttttttgtag taggatataa atatatacag cgctccaaat agtgcggttg 10140

ccccaaaaac accacggaac ctcatctgtt ctcgtacttt gttgtgacaa agtagctcac 10200

tgccttatta tcacattttc attatgcaac gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatgcct 10260

ctagagatga aaaacaatcg taaaagggtc ctgcgtaatt gaaacatttg atcagtatgc 10320

agtggcacag aaacaaccag gaatactata gtcataggca atacaaggta tatattggct 10380

atgcagaccc ctccagaaag taccgacgtc aagttagata cacttaacga acctagtgca 10440

catttaattg agaaaaatgt ggctcttcct aaggacatat tccgttcgta cttgagttat 10500

tggatctatg aaatcgctcg ctatacacca gtcatgattt tgtccctctt tatattacat 10560

caaaataaga aaataattat aaca 10584

<210> 38

<211> 10584

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有盘基网柄菌DiPKS(G1516R)编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> LV3

<222> (1)..(40)

<220>

<221> 酿酒酵母GAL1启动子

<222> (41)..(482)

<220>

<221> L1

<222> (483)..(522)

<220>

<221> DiPKS

<222> (523)..(9966)

<220>

<221> C-甲基转移酶结构域

<222> (5050)..(5412)

<220>

<221> G1516R

<222> (5069)..(5070)

<220>

<221> 基序2

<222> (5309)..(5331)

<220>

<221> 基序3

<222> (5389)..(5421)

<220>

<221> Type III PKS结构域

<222> (8881)..(9966)

<220>

<221> L2

<222> (9967)..(10006)

<220>

<221> PRM9t

<222> (10007)..(10544)

<220>

<221> LV5

<222> (10545)..(10584)

<400> 38

aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc cggattagaa gccgccgagc 60

gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 120

tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 180

tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 240

tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 300

tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 360

aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 420

aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 480

agctagaaaa tttattataa aaggaagaga aataattaaa caatgaacaa gaactccaaa 540

atccagtccc caaactcttc tgatgttgct gttattggtg ttggttttag attcccaggt 600

aactctaatg acccagaatc tttgtggaac aacttgttgg atggtttcga tgctattacc 660

caagtcccaa aagaaagatg ggctacttct tttagagaga tgggtttgat caagaacaag 720

ttcggtggtt tcttgaagga ttctgaatgg aagaatttcg accctttgtt ctttggtatc 780

ggtccaaaag aagctccatt cattgatcca caacaaaggt tgttgttgtc catcgtttgg 840

gaatctttgg aagatgctta catcagacca gatgaattga gaggttctaa cactggtgtt 900

ttcatcggtg tttctaacaa cgattacacc aagttgggtt tccaagacaa ctactctatt 960

tctccataca ctatgaccgg ctctaactct tcattgaact ccaacagaat ttcctactgc 1020

ttcgatttta gaggtccatc cattactgtt gataccgctt gttcttcttc cttggtttct 1080

gttaatttgg gtgtccaatc catccaaatg ggtgaatgta agattgctat ttgcggtggt 1140

gttaacgctt tgtttgatcc atctacatct gttgcctttt ccaagttggg tgttttgtct 1200

gaaaatggca gatgcaactc ttttagtgat caagcctctg gttacgttag atctgaaggt 1260

gctggtgttg ttgttttgaa gtctttggaa caagctaagt tggatggtga tagaatctac 1320

ggtgttatca agggtgtttc ctctaatgaa gatggtgctt ctaatggtga caagaactct 1380

ttgactactc catcttgtga agcccaatcc attaacattt ctaaggctat ggaaaaggcc 1440

tccttgtctc catctgatat ctattacatt gaagcccatg gtactggtac tccagttggt 1500

gatccaattg aagttaaggc cttgtccaag atcttctcca actctaacaa caaccagttg 1560

aacaacttct ctaccgatgg taatgataac gatgatgatg atgacgataa cacctctcca 1620

gaaccattat tgattggctc attcaagtcc aacatcggtc atttggaatc tgctgctggt 1680

attgcttctt tgattaagtg ttgcttgatg ttgaagaaca ggatgttggt tccatccatt 1740

aactgctcta atttgaaccc atccattcca ttcgatcagt acaacatctc cgttatcaga 1800

gaaatcagac aattcccaac cgataagttg gttaacatcg gtatcaattc tttcggtttc 1860

ggtggttcta actgccattt gattattcaa gagtacaaca acaacttcaa gaacaactct 1920

accatctgca ataacaacaa caacaacaat aacaacatcg actacttgat cccaatctcc 1980

tctaagacta agaagtcctt ggataagtac ttgattttga tcaagaccaa ctccaactac 2040

cacaaggata tttctttcga tgacttcgtc aagttccaaa tcaagtctaa gcagtacaac 2100

ttgtccaaca gaatgactac cattgctaac gattggaact ccttcattaa gggttctaac 2160

gaattccaca acttgatcga atctaaggat ggtgaaggtg gttcttcatc ttctaacaga 2220

ggtattgatt ccgccaatca aatcaacact actactacct ctaccatcaa cgatatcgaa 2280

cctttgttgg ttttcgtttt ctgtggtcaa ggtccacaat ggaatggtat gattaagacc 2340

ttgtacaact ccgagaacgt tttcaagaac accgttgatc atgttgacag catcttgtac 2400

aagtacttcg gttactccat tttgaacgtc ttgtctaaga tcgatgataa cgacgattcc 2460

atcaaccatc caatagttgc tcaaccatct ttgttcttgt tgcaaattgg tttggtcgag 2520

ttgtttaagt actggggtat ctacccatct atctctgttg gtcattcttt cggtgaagtc 2580

tcttcttatt acttgtccgg tatcatctct ttggaaaccg cttgtaaaat cgtctacgtc 2640

agatcctcta atcagaacaa aactatgggt tccggtaaga tgttggttgt ttctatgggt 2700

tttaagcaat ggaacgatca attctctgct gaatggtccg atattgaaat tgcttgttac 2760

aacgctccag attccatagt tgttactggt aacgaagaaa gattgaaaga attgtccatc 2820

aagttgtccg acgaatccaa tcaaattttc aacaccttct tgaggtcccc atgttctttt 2880

cattcttccc atcaagaagt catcaagggt tctatgttcg aagagttgtc taacttgcaa 2940

tctactggtg aaaccgaaat ccctttgttc tctactgtta ctggtagaca agttttgtct 3000

ggtcatgtta ctgctcaaca catctacgat aatgttagag aaccagtctt gttccaaaag 3060

acgattgaat ccattacctc ctacatcaag tctcactacc catccaatca aaaggttatc 3120

tacgttgaaa ttgctccaca cccaaccttg ttttcattga tcaaaaagtc catcccatcc 3180

tccaacaaga attcctcttc tgttttgtgt ccattgaaca gaaaagaaaa ctccaacaac 3240

tcctacaaga agttcgtttc tcagttgtac ttcaacggtg ttaacgttga cttcaacttc 3300

cagttgaact ccatttgcga taacgttaac aacgatcacc atttgaacaa cgtcaagcaa 3360

aactccttca aagagactac caattccttg ccaagatacc aatgggaaca agatgaatat 3420

tggtccgaac cattgatctc cagaaagaat agattggaag gtccaactac ttccttgttg 3480

ggtcatagaa ttatctacag cttcccagtt ttccaatccg ttttggactt gcaatctgac 3540

aactacaaat acttgttgga ccacttggtt aacggtaagc cagtttttcc aggtgctggt 3600

tatttggata tcatcatcga attcttcgac taccaaaagc agcagttgaa ttcctctgat 3660

tcctctaact cctacatcat caacgttgac aagatccaat tcttgaaccc aattcacttg 3720

accgaaaaca agttgcaaac cttgcaatct tctttcgaac ctatcgttac taagaagtct 3780

gccttctctg ttaacttctt catcaaggat accgtcgagg atcaatctaa ggttaagtct 3840

atgtctgacg aaacttggac taacacttgt aaggctacca tttccttgga acaacaacag 3900

ccatctccat cttctacttt gactttgtct aagaagcaag acttgcagat cttgagaaac 3960

agatgcgata ttagcaagct agacaagttt gagttgtacg acaagatctc taagaatttg 4020

ggcttgcagt acaactcctt gtttcaagtt gttgatacca tcgaaactgg taaggattgc 4080

tcttttgcta ctttgtcttt gccagaagat actttgttca ccaccatttt gaacccatgc 4140

ttgttggata actgtttcca tggtttgttg accttgatca acgaaaaggg ttctttcgtt 4200

gtcgagtcca tttcttctgt ttctatctac ttggagaaca tcggttcctt caatcaaact 4260

tctgttggta acgtccagtt ctacttgtac accactattt ctaaagccac ctcctttagt 4320

tctgaaggta cttgtaagtt gttcaccaag gatggttcct tgattttgtc tatcggtaag 4380

ttcatcatca agtccaccaa tccaaagtct actaagacca acgaaactat cgaatctcca 4440

ttggacgaaa ccttctctat tgaatggcaa tctaaggatt ctccaattcc aaccccacaa 4500

caaatccaac aacaatctcc attgaactct aacccatcct tcattagatc taccatcttg 4560

aaggacatcc agttcgaaca atactgctcc tccattatcc acaaagaatt gatcaaccac 4620

gaaaagtaca agaaccagca atccttcgat atcaactcct tggaaaacca cttgaacgat 4680

gaccaattga tggaatcctt gtccatctcc aaagaatact tgagattctt caccaggatc 4740

atctccatca ttaagcaata cccaaagatc ttgaacgaaa aagagctaaa agaattgaaa 4800

gaaatcatcg aattgaagta cccatccgaa gttcagttgt tggaattcga agttatcgag 4860

aaggtgtcca tgattatccc aaagttgttg ttcgaaaacg acaagcaatc ttccatgacc 4920

ttgttccaag ataacttgtt gaccaggttc tactccaatt ctaactctac cagattctac 4980

ttggaaaggg tttccgaaat ggtcttggaa tctattagac caatcgtcag agaaaagagg 5040

gtgttcagaa ttttagagat cggtgctcgt acaggctctt tgtctaatgt tgttttgact 5100

aagttgaaca cctacttgtc caccttgaat tctaatggtg gttctggtta caacatcatc 5160

attgagtaca ccttcaccga tatttccgcc aacttcatta ttggtgaaat ccaagaaacc 5220

atgtgcaact tgtacccaaa cgttactttc aagttctccg tcttggactt ggagaaagag 5280

attattaact cctccgattt cttgatgggt gattacgata tagttttgat ggcctacgtt 5340

atccatgccg tttctaacat taagttctcc atcgaacagt tgtacaagtt gttgtctcca 5400

agaggttggt tgttgtgtat tgaacctaag tccaacgttg tgttctccga tttggttttc 5460

ggttgtttta atcagtggtg gaactactac gatgatatta gaactaccca ctgctccttg 5520

tctgaatctc aatggaatca gttgttgttg aaccagtcct tgaacaacga atcctcttct 5580

tcttctaact gttacggtgg tttctccaac gtttctttta ttggtggtga aaaggatgtc 5640

gactcccatt ctttcatatt gcactgccaa aaagaatcca tctcccaaat gaagttagcc 5700

accactatta acaacggttt gtcatctggt tccatcgtta tcgttttgaa ctctcaacaa 5760

ttgaccaaca tgaagtccta cccaaaggtt attgagtata ttcaagaggc tacctctttg 5820

tgcaagacca ttgaaattat cgattccaag gacgtcttga actctaccaa ttcagttttg 5880

gaaaagatcc aaaagtcctt gttggtgttc tgtttgttgg gttatgactt gttggagaac 5940

aactaccaag aacagtcttt cgaatacgtt aagttgttga acttgatctc tactaccgcc 6000

tcttcatcta atgataagaa accaccaaag gtcttgttga tcaccaagca atctgaaaga 6060

atctccaggt ctttctactc cagatccttg attggtattt ccagaacctc tatgaacgag 6120

tacccaaatt tgtccattac ctctatcgat ttggatacca acgactactc attgcagtct 6180

ttgttgaagc caatcttcag caactctaag ttttccgaca acgagttcat cttcaaaaag 6240

ggcttgatgt tcgtgtccag gatctttaag aacaagcagt tgctagaatc ctccaacgct 6300

tttgaaactg actcttctaa cttgtactgt aaggcctctt ctgacttgtc ttacaagtac 6360

gctattaagc agtctatgtt gaccgaaaat cagatcgaaa tcaaggttga atgcgtcggt 6420

attaacttca aggacaacct attctacaag ggcttgttgc cacaagaaat tttcagaatg 6480

ggtgacatct acaatccacc atatggtttg gaatgctctg gtgttattac cagaattggt 6540

tctaacgtca ccgaatactc agttggtcaa aatgtttttg gtttcgccag acattctttg 6600

ggttctcatg ttgttaccaa caaggatttg gttatcttga agccagatac catctcattt 6660

tctgaagctg cttctatccc agttgtttac tgtactgctt ggtactcctt gttcaacatt 6720

ggtcagttgt ctaacgaaga atccatccta attcattctg ctactggtgg tgtaggtttg 6780

gcttctttga atttgttgaa aatgaagaat cagcaacagc aaccattgac caatgtttat 6840

gctactgttg gctctaacga gaagaagaag ttcttgatcg ataacttcaa caacttgttc 6900

aaagaggacg gcgaaaacat tttctctacc agagacaaag aatactccaa ccagttggaa 6960

tccaagatcg atgttatttt gaacaccttg tccggtgaat tcgtcgaatc taatttcaag 7020

tccttgagat ccttcggtag attgattgat ttgtctgcta ctcacgttta cgccaatcaa 7080

caaattggtc taggtaactt caagttcgac cacttgtatt ctgctgttga cttggaaaga 7140

ttgatcgacg aaaaacctaa gttgttgcag tccatcttgc aaagaattac caactctatc 7200

gtcaacggtt ccttggaaaa aattccaatt accatcttcc catccaccga aactaaggat 7260

gctatcgaat tattgtccaa gagatcccat atcggtaaag ttgttgtaga ttgcaccgat 7320

atctctaagt gtaatcctgt tggtgatgtg atcaccaact tctctatgag attgccaaag 7380

ccaaactacc agttgaattt gaactccacc ttgttgatta ctggtcagtc tggtttgtct 7440

atccctttgt tgaattggtt gttgtctaag tctggtggta acgttaagaa cgttgtcatc 7500

atttctaagt ccaccatgaa gtggaagttg cagactatga tttcccattt cgtttccggt 7560

ttcggtatcc attttaacta cgttcaagtc gacatctcca actacgatgc tttgtctgaa 7620

gctattaagc aattgccatc tgatttgcca ccaatcacct ctgtttttca tttggctgct 7680

atctacaacg atgttccaat ggatcaagtt accatgtcta ccgttgaatc tgttcataac 7740

cctaaagttt tgggtgccgt taacttgcat agaatctctg tttcttttgg ttggaagttg 7800

aaccacttcg tcttgttctc ttctattact gctattaccg gttacccaga ccaatctatc 7860

tacaattctg ccaactctat tttggacgct ttgtccaact ttagaaggtt tatgggtttg 7920

ccatccttct ccattaactt gggtccaatg aaggatgaag gtaaggtttc taccaacaag 7980

agcatcaaga agctattcaa gtctagaggt ttgccaagcc tatccttgaa caagttattt 8040

ggtttgttgg aggtcgtcat caacaaccca tctaatcatg ttatcccatc ccaattgatt 8100

tgctccccaa tcgatttcaa gacctacatc gaatctttct caactatgag gccaaagttg 8160

ttacacttgc aacctaccat ttccaagcag caatcttcta tcattaacga ttctaccaag 8220

gcttcctcca acatttcatt gcaagataag atcacctcca aggtgtctga tttgttgtcc 8280

attccaatct ccaagatcaa cttcgatcat ccattgaaac actacggctt ggattctttg 8340

ttgaccgttc aattcaaatc ctggatcgac aaagaattcg aaaagaactt gttcacccat 8400

atccaattgg ccaccatctc tattaactca ttcttggaaa aggtgaacgg cttgtctaca 8460

aacaataaca acaacaacaa ttccaacgtc aagtcctctc catccattgt caaagaagaa 8520

atcgttacct tggacaagga tcaacaacca ttgctattga aagaacacca gcacattatc 8580

atctccccag atattagaat caacaagcca aagagggaat ccttgattag aaccccaatc 8640

ttgaacaaat tcaaccagat caccgaatcc attatcactc catctacacc atctttgtcc 8700

caatccgatg ttttgaaaac tccaccaatc aagtctttga acaacactaa gaactccagc 8760

ttgattaaca ccccaccaat tcaatctgtc caacaacatc aaaagcaaca acaaaaggtc 8820

caagtcatcc aacaacagca acaaccatta tccagattgt cctacaagag caacaacaac 8880

tctttcgttt tgggtatcgg tatttctgtt ccaggtgaac ctatttccca acaatccttg 8940

aaagactcca tctccaatga cttttctgat aaggctgaaa ctaacgagaa ggtcaagaga 9000

atctttgagc aatctcaaat caagaccaga cacttggtta gagattacac taagccagag 9060

aactccatca agttcagaca tttggaaacc attaccgatg tgaacaacca gttcaagaaa 9120

gttgttccag atttggctca acaagcctgt ttgagagctt tgaaagattg gggtggtgat 9180

aagggtgata ttacccatat agtttctgtt acctccaccg gtattatcat cccagatgtt 9240

aatttcaagt tgatcgactt gttgggcttg aacaaggatg ttgaaagagt gtctttgaac 9300

ctaatgggtt gtttggctgg tttgagttct ttgagaactg ctgcttcttt ggctaaggct 9360

tctccaagaa atagaatttt ggttgtctgt accgaagtct gctccttgca tttttctaat 9420

actgatggtg gtgatcaaat ggtcgcctct tctatttttg ctgatggttc tgctgcttac 9480

attattggtt gtaacccaag aattgaagaa accccattat acgaagtcat gtgctccatt 9540

aacagatctt tcccaaatac cgaaaacgcc atggtttggg atttggaaaa agaaggttgg 9600

aacttgggtt tggatgcttc tattccaatt gtcattggtt ctggtattga agccttcgtt 9660

gatactttgt tggataaggc taagttgcaa acttccactg ctatttctgc taaggattgc 9720

gaattcttga ttcatactgg tggcaagtcc atcttgatga acatcgaaaa ttccttgggt 9780

atcgacccaa agcaaactaa gaatacttgg gatgtttacc atgcctacgg caatatgtca 9840

tctgcctctg ttattttcgt tatggatcat gccagaaagt ccaagtcttt gccaacttac 9900

tcaatttctt tggcttttgg tccaggtttg gcttttgaag gttgtttctt gaagaacgtc 9960

gtctaaagac ataaaactga aacaacacca attaataata gactttacag aagacgggag 10020

acactagcac acaactttac caggcaaggt atttgacgct agcatgtgtc caattcagtg 10080

tcatttatga ttttttgtag taggatataa atatatacag cgctccaaat agtgcggttg 10140

ccccaaaaac accacggaac ctcatctgtt ctcgtacttt gttgtgacaa agtagctcac 10200

tgccttatta tcacattttc attatgcaac gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatgcct 10260

ctagagatga aaaacaatcg taaaagggtc ctgcgtaatt gaaacatttg atcagtatgc 10320

agtggcacag aaacaaccag gaatactata gtcataggca atacaaggta tatattggct 10380

atgcagaccc ctccagaaag taccgacgtc aagttagata cacttaacga acctagtgca 10440

catttaattg agaaaaatgt ggctcttcct aaggacatat tccgttcgta cttgagttat 10500

tggatctatg aaatcgctcg ctatacacca gtcatgattt tgtccctctt tatattacat 10560

caaaataaga aaataattat aaca 10584

<210> 39

<211> 6034

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒

<220>

<221> LV5

<222> (1)..(40)

<220>

<221> pYES2-LEU2

<222> (1915)..(4123)

<220>

<221> LEU2 ORF

<222> (1996)..(3090)

<220>

<221> LEU2启动子

<222> (3091)..(3999)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3759)..(3760)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> LV3

<222> (5995)..(6034)

<400> 39

cctctttata ttacatcaaa ataagaaaat aattataaca cctgcattaa tgaatcggcc 60

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 120

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 180

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 240

agcccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 300

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 360

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 420

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 480

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 540

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 600

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 660

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 720

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 780

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 840

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 900

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 960

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 1020

aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 1080

tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagc 1140

gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 1200

atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 1260

tatccgcctc cattcagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 1320

ttaatagttt gcgcaacgtt gttggcattg ctacaggcat cgtggtgtca ctctcgtcgt 1380

ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 1440

tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 1500

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 1560

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 1620

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taatagtgta tcacatagca 1680

gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 1740

taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 1800

cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 1860

agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatgggtaa 1920

taactgatat aattaaattg aagctctaat ttgtgagttt agtatacatg catttactta 1980

taatacagtt ttttattaag caaggatttt cttaacttct tcggcgacag catcaccgac 2040

ttcggtggta ctgttggaac cacctaaatc accagttctg atacctgcat ccaaaacctt 2100

tttaactgca tcttcaatgg ccttaccttc ttcaggcaag ttcaatgaca atttcaacat 2160

cattgcagca gacaagatag tggcgatagg gttgacctta ttctttggca aatctggagc 2220

agaaccgtgg catggttcgt acaaaccaaa tgcggtgttc ttgtctggca aagaggccaa 2280

ggacgcagat ggcaacaaac ccaaggaacc tgggataacg gaggcttcat cggagatgat 2340

atcaccaaac atgttgctgg tgattataat accatttagg tgggttgggt tcttaactag 2400

gatcatggcg gcagaatcaa tcaattgatg ttgaaccttc aatgtaggga attcgttctt 2460

gatggtttcc tccacagttt ttctccataa tcttgaagag gccaaaacat tagctttatc 2520

caaggaccaa ataggcaatg gtggctcatg ttgtagggcc atgaaagcgg ccattcttgt 2580

gattctttgc acttctggaa cggtgtattg ttcactatcc caagcgacac catcaccatc 2640

gtcttccttt ctcttaccaa agtaaatacc tcccactaat tctctgacaa caacgaagtc 2700

agtaccttta gcaaattgtg gcttgattgg agataagtct aaaagagagt cggatgcaaa 2760

gttacatggt cttaagttgg cgtacaattg aagttcttta cggattttta gtaaaccttg 2820

ttcaggtcta acactaccgg taccccattt aggaccaccc acagcaccta acaaaacggc 2880

atcagccttc ttggaggctt ccagcgcctc atctggaagt ggaacacctg tagcatcgat 2940

agcagcacca ccaattaaat gattttcgaa atcgaacttg acattggaac gaacatcaga 3000

aatagcttta agaaccttaa tggcttcggc tgtgatttct tgaccaacgt ggtcacctgg 3060

caaaacgacg atcttcttag gggcagacat tagaatggta tatccttgaa atatatatat 3120

atattgctga aatgtaaaag gtaagaaaag ttagaaagta agacgattgc taaccaccta 3180

ttggaaaaaa caataggtcc ttaaataata ttgtcaactt caagtattgt gatgcaagca 3240

tttagtcatg aacgcttctc tattctatat gaaaagccgg ttccggcgct ctcacctttc 3300

ctttttctcc caatttttca gttgaaaaag gtatatgcgt caggcgacct ctgaaattaa 3360

caaaaaattt ccagtcatcg aatttgattc tgtgcgatag cgcccctgtg tgttctcgtt 3420

atgttgagga aaaaaataat ggttgctaag agattcgaac tcttgcatct tacgatacct 3480

gagtattccc acagttaact gcggtcaaga tatttcttga atcaggcgcc ttagaccgct 3540

cggccaaaca accaattact tgttgagaaa tagagtataa ttatcctata aatataacgt 3600

ttttgaacac acatgaacaa ggaagtacag gacaattgat tttgaagaga atgtggattt 3660

tgatgtaatt gttgggattc catttttaat aaggcaataa tattaggtat gtagatatac 3720

tagaagttct cctcgaggat ttaggaatcc ataaaaggnn atctgcaatt ctacacaatt 3780

ctagaaatat tattatcatc attttatatg ttaatattca ttgatcctat tacattatca 3840

atccttgcgt ttcagcttcc actaatttag atgactattt ctcatcattt gcgtcatctt 3900

ctaacaccgt atatgataat atactagtaa cgtaaatact agttagtaga tgatagttga 3960

tttttattcc aacataccac ccataatgta atagatctag cttatcgatg ataagctgtc 4020

aaagatgaga attaattcca cggactatag actataccta gtatactccg tctactgtac 4080

gatacacttc cgctcaggtc cttgtccttt aacgaggcct taccactctt ttgttactct 4140

attgatccag ctcagcaaag gcagtgtgat ctaagattct atcttcgcga tgtagtaaaa 4200

ctagctagac cgagaaagag actagaaatg caaaaggcac ttctacaatg gctgccatca 4260

ttattatccg atgtgacgct gcagcttctc aatgatattc gaatacgctt tgaggagata 4320

cagcctaata tccgacaaac tgttttacag atttacgatc gtacttgtta cccatcattg 4380

aattttgaac atccgaacct gggagttttc cctgaaacag atagtatatt tgaacctgta 4440

taataatata tagtctagcg ctttacggaa gacaatgtat gtatttcggt tcctggagaa 4500

actattgcat ctattgcata ggtaatcttg cacgtcgcat ccccggttca ttttctgcgt 4560

ttccatcttg cacttcaata gcatatcttt gttaacgaag catctgtgct tcattttgta 4620

gaacaaaaat gcaacgcgag agcgctaatt tttcaaacaa agaatctgag ctgcattttt 4680

acagaacaga aatgcaacgc gaaagcgcta ttttaccaac gaagaatctg tgcttcattt 4740

ttgtaaaaca aaaatgcaac gcgacgagag cgctaatttt tcaaacaaag aatctgagct 4800

gcatttttac agaacagaaa tgcaacgcga gagcgctatt ttaccaacaa agaatctata 4860

cttctttttt gttctacaaa aatgcatccc gagagcgcta tttttctaac aaagcatctt 4920

agattacttt ttttctcctt tgtgcgctct ataatgcagt ctcttgataa ctttttgcac 4980

tgtaggtccg ttaaggttag aagaaggcta ctttggtgtc tattttctct tccataaaaa 5040

aagcctgact ccacttcccg cgtttactga ttactagcga agctgcgggt gcattttttc 5100

aagataaagg catccccgat tatattctat accgatgtgg attgcgcata ctttgtgaac 5160

agaaagtgat agcgttgatg attcttcatt ggtcagaaaa ttatgaacgg tttcttctat 5220

tttgtctcta tatactacgt ataggaaatg tttacatttt cgtattgttt tcgattcact 5280

ctatgaatag ttcttactac aatttttttg tctaaagagt aatactagag ataaacataa 5340

aaaatgtaga ggtcgagttt agatgcaagt tcaaggagcg aaaggtggat gggtaggtta 5400

tatagggata tagcacagag atatatagca aagagatact tttgagcaat gtttgtggaa 5460

gcggtattcg caatgggaag ctccaccccg gttgataatc agaaaagccc caaaaacagg 5520

aagattgtat aagcaaatat ttaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta 5580

aatttttgtt aaatcagctc attttttaac gaatagcccg aaatcggcaa aatcccttat 5640

aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttccaa caagagtcca 5700

ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa gggtctatca gggcgatggc 5760

ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcagta 5820

aatcggaagg gtaaacggat gcccccattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg 5880

gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggggcta gggcggtggg aagtgtaggg 5940

gtcacgctgg gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg gggcgctaca gggcaggaat 6000

actctgaata aaacaactta tataataaaa atgc 6034

<210> 40

<211> 5056

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒

<220>

<221> LV5

<222> (1)..(40)

<220>

<221> pYES骨架

<222> (41)..(5016)

<220>

<221> AmpR

<222> (1040)..(1699)

<220>

<221> URA3

<222> (1915)..(3022)

<220>

<221> LV3

<222> (5017)..(5056)

<400> 40

cctctttata ttacatcaaa ataagaaaat aattataaca cctgcattaa tgaatcggcc 60

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 120

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 180

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 240

agcccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 300

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 360

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 420

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 480

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 540

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 600

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 660

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 720

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 780

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 840

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 900

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 960

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 1020

aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 1080

tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagc 1140

gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 1200

atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 1260

tatccgcctc cattcagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 1320

ttaatagttt gcgcaacgtt gttggcattg ctacaggcat cgtggtgtca ctctcgtcgt 1380

ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 1440

tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 1500

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 1560

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 1620

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taatagtgta tcacatagca 1680

gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 1740

taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 1800

cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 1860

agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatgggtaa 1920

taactgatat aattaaattg aagctctaat ttgtgagttt agtatacatg catttactta 1980

taatacagtt ttttagtttt gctggccgca tcttctcaaa tatgcttccc agcctgcttt 2040

tctgtaacgt tcaccctcta ccttagcatc ccttcccttt gcaaatagtc ctcttccaac 2100

aataataatg tcagatcctg tagagaccac atcatccacg gttctatact gttgacccaa 2160

tgcgtctccc ttgtcatcta aacccacacc gggtgtcata atcaaccaat cgtaaccttc 2220

atctcttcca cccatgtctc tttgagcaat aaagccgata acaaaatctt tgtcgctctt 2280

cgcaatgtca acagtaccct tagtatattc tccagtagat agggagccct tgcatgacaa 2340

ttctgctaac atcaaaaggc ctctaggttc ctttgttact tcttctgccg cctgcttcaa 2400

accgctaaca atacctgggc ccaccacacc gtgtgcattc gtaatgtctg cccattctgc 2460

tattctgtat acacccgcag agtactgcaa tttgactgta ttaccaatgt cagcaaattt 2520

tctgtcttcg aagagtaaaa aattgtactt ggcggataat gcctttagcg gcttaactgt 2580

gccctccatg gaaaaatcag tcaagatatc cacatgtgtt tttagtaaac aaattttggg 2640

acctaatgct tcaactaact ccagtaattc cttggtggta cgaacatcca atgaagcaca 2700

caagtttgtt tgcttttcgt gcatgatatt aaatagcttg gcagcaacag gactaggatg 2760

agtagcagca cgttccttat atgtagcttt cgacatgatt tatcttcgtt tcctgcaggt 2820

ttttgttctg tgcagttggg ttaagaatac tgggcaattt catgtttctt caacactaca 2880

tatgcgtata tataccaatc taagtctgtg ctccttcctt cgttcttcct tctgttcgga 2940

gattaccgaa tcaaaaaaat ttcaaagaaa ccgaaatcaa aaaaaagaat aaaaaaaaaa 3000

tgatgaattg aattgaaaag ctagcttatc gatgataagc tgtcaaagat gagaattaat 3060

tccacggact atagactata ctagatactc cgtctactgt acgatacact tccgctcagg 3120

tccttgtcct ttaacgaggc cttaccactc ttttgttact ctattgatcc agctcagcaa 3180

aggcagtgtg atctaagatt ctatcttcgc gatgtagtaa aactagctag accgagaaag 3240

agactagaaa tgcaaaaggc acttctacaa tggctgccat cattattatc cgatgtgacg 3300

ctgcagcttc tcaatgatat tcgaatacgc tttgaggaga tacagcctaa tatccgacaa 3360

actgttttac agatttacga tcgtacttgt tacccatcat tgaattttga acatccgaac 3420

ctgggagttt tccctgaaac agatagtata tttgaacctg tataataata tatagtctag 3480

cgctttacgg aagacaatgt atgtatttcg gttcctggag aaactattgc atctattgca 3540

taggtaatct tgcacgtcgc atccccggtt cattttctgc gtttccatct tgcacttcaa 3600

tagcatatct ttgttaacga agcatctgtg cttcattttg tagaacaaaa atgcaacgcg 3660

agagcgctaa tttttcaaac aaagaatctg agctgcattt ttacagaaca gaaatgcaac 3720

gcgaaagcgc tattttacca acgaagaatc tgtgcttcat ttttgtaaaa caaaaatgca 3780

acgcgacgag agcgctaatt tttcaaacaa agaatctgag ctgcattttt acagaacaga 3840

aatgcaacgc gagagcgcta ttttaccaac aaagaatcta tacttctttt ttgttctaca 3900

aaaatgcatc ccgagagcgc tatttttcta acaaagcatc ttagattact ttttttctcc 3960

tttgtgcgct ctataatgca gtctcttgat aactttttgc actgtaggtc cgttaaggtt 4020

agaagaaggc tactttggtg tctattttct cttccataaa aaaagcctga ctccacttcc 4080

cgcgtttact gattactagc gaagctgcgg gtgcattttt tcaagataaa ggcatccccg 4140

attatattct ataccgatgt ggattgcgca tactttgtga acagaaagtg atagcgttga 4200

tgattcttca ttggtcagaa aattatgaac ggtttcttct attttgtctc tatatactac 4260

gtataggaaa tgtttacatt ttcgtattgt tttcgattca ctctatgaat agttcttact 4320

acaatttttt tgtctaaaga gtaatactag agataaacat aaaaaatgta gaggtcgagt 4380

ttagatgcaa gttcaaggag cgaaaggtgg atgggtaggt tatataggga tatagcacag 4440

agatatatag caaagagata cttttgagca atgtttgtgg aagcggtatt cgcaatggga 4500

agctccaccc cggttgataa tcagaaaagc cccaaaaaca ggaagattgt ataagcaaat 4560

atttaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 4620

tcatttttta acgaatagcc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 4680

gagatagggt tgagtgttgt tccagtttcc aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 4740

tccaacgtca aagggcgaaa aagggtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca 4800

ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcag taaatcggaa gggtaaacgg 4860

atgcccccat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag 4920

aaagcgaaag gagcgggggc tagggcggtg ggaagtgtag gggtcacgct gggcgtaacc 4980

accacacccg ccgcgcttaa tggggcgcta cagggcagga atactctgaa taaaacaact 5040

tatataataa aaatgc 5056

<210> 41

<211> 1703

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有绿色荧光蛋白编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> LV3

<222> (1)..(40)

<220>

<221> Tdh3p

<222> (41)..(693)

<220>

<221> S65T-GFP

<222> (700)..(1413)

<220>

<221> CYC1终止子

<222> (1414)..(1663)

<220>

<221> LV5

<222> (1664)..(1703)

<400> 41

aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc tcgagtttat cattatcaat 60

actgccattt caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag 120

tcaaaaaatt agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt 180

tacacagaat atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta 240

aatataatgg agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa 300

aatattgttt tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga 360

gaacaggggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc 420

tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca 480

ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca 540

gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt 600

gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt 660

tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgaaaaacaa tgagtaaagg agaagaactt 720

ttcactggag ttgtcccaat tcttgttgaa ttagatggtg atgttaatgg gcacaaattt 780

tctgtcagtg gagagggtga aggtgatgca acatacggaa aacttaccct taaatttatt 840

tgcactactg gaaaactacc tgttccatgg ccaacacttg tcactacttt cacttatggt 900

gttcaatgca tttcaagata cccagatcat atgaaagagc atgacttttt caagagtgcc 960

atgcccgaag gttatgtaca ggaaagaact atatttttca aagatgacgg gaactacaag 1020

acacgtgctg aagtcaagtt tgaaggtgat acccttgtta atagaatcga gttaaaaggt 1080

attgatttta aagaagatgg aaacattctt ggacacaaat tggaatacaa ctataactca 1140

cacaatgtat acatcatggc agacaaacaa aagaatggaa tcaaagttaa cttcaaaatt 1200

agacacaaca ttgaagatgg aagcgttcaa ctagcagacc attatcaaca aaatactcca 1260

attggcgatg gccctgtcct tttaccagac aaccattacc tgtccacaca atctgccctt 1320

tcgaaagatc ccaacgaaaa gagagaccac atggtccttc ttgagtttgt aacagctgct 1380

gggattacac atggcatgga tgaactatac aaatcatgta attagttatg tcacgcttac 1440

attcacgccc tcctcccaca tccgctctaa ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag 1500

tctaggtccc tatttatttt ttttaatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt 1560

tcaaattttt cttttttttc tgtacaaacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac 1620

cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt tgccctcttt atattacatc 1680

aaaataagaa aataattata aca 1703

<210> 42

<211> 2942

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有***异戊二烯基转移酶-绿色荧光蛋白融合蛋白编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> LV3

<222> (1)..(40)

<220>

<221> TDH3

<222> (41)..(692)

<220>

<221> CBGA合成酶

<222> (702)..(1892)

<220>

<221> GFP_接头

<222> (1893)..(1928)

<220>

<221> GFP

<222> (1929)..(2645)

<220>

<221> LV5

<222> (2903)..(2942)

<400> 42

aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc tcgagtttat cattatcaat 60

actgccattt caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag 120

tcaaaaaatt agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt 180

tacacagaat atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta 240

aatataatgg agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa 300

aatattgttt tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga 360

gaacaggggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc 420

tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca 480

ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca 540

gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt 600

gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt 660

tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgaaaacaat gatgggttta tcttctgttt 720

gtactttctc tttccaaacc aactatcaca ctttgttgaa tccacataac aacaacccaa 780

agacttcttt gttatgttac agacatccaa agaccccaat caagtactct tacaacaact 840

tcccatctaa gcactgttct accaagtctt tccacttgca aaataagtgt tctgaatctt 900

tgtctattgc taagaattcc attagagctg ctaccactaa ccaaaccgaa ccaccagaat 960

ctgacaacca ctccgtcgcc accaagatct tgaacttcgg taaggcttgt tggaagttgc 1020

aaagaccata caccatcatt gccttcacct cctgtgcctg tggtttgttt ggtaaggaat 1080

tgttgcataa caccaacttg atctcttggt ctttaatgtt caaggctttt tttttcttgg 1140

tcgccatctt gtgtattgcc tcctttacca ctactattaa tcaaatctac gacttacata 1200

ttgaccgtat caataagcca gatttgccat tggcctctgg tgaaatttcc gtcaacaccg 1260

cctggattat gtctattatc gttgccttgt tcggtttaat tattactatt aagatgaagg 1320

gtggtccatt atacatcttc ggttactgtt tcggtatctt cggtggtatc gtctactccg 1380

ttccaccttt cagatggaag caaaacccat ccaccgcttt cttgttgaac ttcttagccc 1440

acatcattac taactttacc ttctactatg cctctagagc cgctttaggt ttaccatttg 1500

aattgcgtcc atctttcact ttcttgttgg ctttcatgaa gtctatgggt tccgccttgg 1560

ctttaattaa ggatgcctct gatgttgagg gtgatactaa gttcggtatt tctaccttag 1620

cttccaaata cggttccaga aacttgactt tgttctgttc cggtattgtt ttattgtctt 1680

acgtcgctgc tatcttggct ggtatcattt ggcctcaagc tttcaactct aacgttatgt 1740

tgttatccca tgctatcttg gctttctggt tgatcttgca aaccagagac ttcgctttga 1800

ctaactacga tccagaagct ggtagaagat tctacgaatt tatgtggaaa ttatattacg 1860

ccgaatactt ggtttacgtt ttcatcggct gaggcgccgc tggctccgct gctggttctg 1920

gcgaattcat gagtaaagga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt cttgttgaat 1980

tagatggtga tgttaatggg cacaaatttt ctgtcagtgg agagggtgaa ggtgatgcaa 2040

catacggaaa acttaccctt aaatttattt gcactactgg aaaactacct gttccatggc 2100

caacacttgt cactactttc acttatggtg ttcaatgcat ttcaagatac ccagatcata 2160

tgaaacggca tgactttttc aagagtgcca tgcccgaagg ttatgtacag gaaagaacta 2220

tatttttcaa agatgacggg aactacaaga cacgtgctga agtcaagttt gaaggtgata 2280

cccttgttaa tagaatcgag ttaaaaggta ttgattttaa agaagatgga aacattcttg 2340

gacacaaatt ggaatacaac tataactcac acaatgtata catcatggca gacaaacaaa 2400

agaatggaat caaagttaac ttcaaaatta gacacaacat tgaagatgga agcgttcaac 2460

tagcagacca ttatcaacaa aatactccaa ttggcgatgg ccctgtcctt ttaccagaca 2520

accattacct gtccacacaa tctgcccttt cgaaagatcc caacgaaaag agagaccaca 2580

tggtccttct tgagtttgta acagctgctg ggattacaca tggcatggat gaactataca 2640

aataaggcgc ctaatcatgt aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctccccccac 2700

atccgctcta accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt 2760

ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 2820

gtacaaacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 2880

acgctcgaag gctttaattt gccctcttta tattacatca aaataagaaa ataattataa 2940

ca 2942

<210> 43

<211> 2678

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有AltPT-绿色荧光蛋白融合蛋白编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> LV3

<222> (1)..(40)

<220>

<221> TDH3

<222> (41)..(692)

<220>

<221> Alt PT

<222> (702)..(1628)

<220>

<221> GFP_接头

<222> (1629)..(1664)

<220>

<221> GFP

<222> (1665)..(2381)

<220>

<221> LV5

<222> (2639)..(2678)

<400> 43

aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc tcgagtttat cattatcaat 60

actgccattt caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag 120

tcaaaaaatt agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt 180

tacacagaat atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta 240

aatataatgg agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa 300

aatattgttt tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga 360

gaacaggggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc 420

tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca 480

ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca 540

gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt 600

gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt 660

tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgaaaacaat gatgtctgaa gccgctgatg 720

tcgaaagagt ttacgccgct atggaagagg ccgctggttt gttgggtgtt gcctgtgcta 780

gagacaagat ttacccattg ttatccacct tccaagatac tttggttgaa ggtggttctg 840

ttgtcgtttt ctctatggcc tccggtagac actccaccga attggacttc tctatttctg 900

ttccaacttc tcatggtgat ccatacgcca ctgtcgttga aaagggttta tttcctgcta 960

ctggtcaccc agttgacgat ttgttagctg acactcaaaa gcacttacct gtttctatgt 1020

tcgctattga cggtgaagtt accggtggtt tcaaaaagac ttacgccttc ttcccaactg 1080

acaatatgcc aggtgttgct gaattgtctg ctatcccatc catgccacca gccgttgccg 1140

agaatgctga attgttcgct cgttatggtt tggacaaggt ccaaatgacc tccatggact 1200

acaagaaaag acaagtcaac ttgtatttct ccgaattgtc tgctcaaact ttagaagccg 1260

aatctgtttt ggctttggtt agagaattag gtttgcacgt tccaaacgaa ttgggtttga 1320

agttttgtaa acgttctttc tctgtttatc caactttgaa ctgggaaacc ggtaaaatcg 1380

acagattgtg cttcgctgtc atctctaacg acccaacctt ggtcccatcc tccgatgaag 1440

gtgatatcga aaagttccac aactacgcca ctaaggctcc ttacgcttac gtcggtgaga 1500

aacgtacctt ggtctatggt ttgactttat ccccaaagga ggaatactac aagttgggtg 1560

cttactacca cattaccgac gtccaaagag gtttgttaaa ggccttcgac tctttagaag 1620

acggctgagg cgccgctggc tccgctgctg gttctggcga attcatgagt aaaggagaag 1680

aacttttcac tggagttgtc ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca 1740

aattttctgt cagtggagag ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt acccttaaat 1800

ttatttgcac tactggaaaa ctacctgttc catggccaac acttgtcact actttcactt 1860

atggtgttca atgcatttca agatacccag atcatatgaa acggcatgac tttttcaaga 1920

gtgccatgcc cgaaggttat gtacaggaaa gaactatatt tttcaaagat gacgggaact 1980

acaagacacg tgctgaagtc aagtttgaag gtgataccct tgttaataga atcgagttaa 2040

aaggtattga ttttaaagaa gatggaaaca ttcttggaca caaattggaa tacaactata 2100

actcacacaa tgtatacatc atggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gttaacttca 2160

aaattagaca caacattgaa gatggaagcg ttcaactagc agaccattat caacaaaata 2220

ctccaattgg cgatggccct gtccttttac cagacaacca ttacctgtcc acacaatctg 2280

ccctttcgaa agatcccaac gaaaagagag accacatggt ccttcttgag tttgtaacag 2340

ctgctgggat tacacatggc atggatgaac tatacaaata aggcgcctaa tcatgtaatt 2400

agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg 2460

agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag 2520

aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac aaacgcgtgt acgcatgtaa 2580

cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgccc 2640

tctttatatt acatcaaaat aagaaaataa ttataaca 2678

<210> 44

<211> 2399

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有带有编码序列、调节序列和整合序列的来自链霉菌属CL190的AltPT的盒

<220>

<221> LV3

<222> (1)..(40)

<220>

<221> PMA1p

<222> (47)..(946)

<220>

<221> L1

<222> (947)..(986)

<220>

<221> AltPT

<222> (987)..(1913)

<220>

<221> Eno2t

<222> (1954)..(2353)

<220>

<221> LV5

<222> (2360)..(2399)

<400> 44

aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc gtatccacag gcattgctgg 60

gatcacccat acatcactct gttttgcctg accttttccg gtaatttgaa aacaaacccg 120

gtctcgaagc ggagatccgg cgataattac cgcagaaata aacccataca cgagacgtag 180

aaccagccgc acatggccgg agaaactcct gcgagaattt cgtaaactcg cgcgcattgc 240

atctgtattt cctaatgcgg cacttccagg cctcgagacc tctgacatgc ttttgacagg 300

aatagacatt ttcagaatgt tatccatatg cctttcgggt ttttttcctt ccttttccat 360

catgaaaaat ctctcgagac cgtttatcca ttgctttttt gttgtctttt tccctcgttc 420

acagaaagtc tgaagaagct atagtagaac tatgagcttt ttttgtttct gttttccttt 480

tttttttttt tacctctgtg gaaattgtta ctctcacact ctttagttcg tttgtttgtt 540

ttgtttattc caattatgac cggtgacgaa acgtggtcga tggtgggtac cgcttatgct 600

cccctccatt agtttcgatt atataaaaag gccaaatatt gtattatttt caaatgtcct 660

atcattatcg tctaacatct aatttctctt aaattttttc tctttctttc ctataacacc 720

aatagtgaaa atcttttttt cttctatatc tacaaaaact ttttttttct atcaacctcg 780

ttgataaatt ttttctttaa caatcgttaa taattaatta attggaaaat aaccattttt 840

tctctctttt atacacacat tcaaaagaaa gaaaaaaaat ataccccagc tagttaaaga 900

aaatcattga aaagaataag aagataagaa agatttaatt atcaaactag aaaatttatt 960

ataaaaggaa gagaaataat taaacaatgt ctgaagccgc tgatgtcgaa agagtttacg 1020

ccgctatgga agaggccgct ggtttgttgg gtgttgcctg tgctagagac aagatttacc 1080

cattgttatc caccttccaa gatactttgg ttgaaggtgg ttctgttgtc gttttctcta 1140

tggcctccgg tagacactcc accgaattgg acttctctat ttctgttcca acttctcatg 1200

gtgatccata cgccactgtc gttgaaaagg gtttatttcc tgctactggt cacccagttg 1260

acgatttgtt agctgacact caaaagcact tacctgtttc tatgttcgct attgacggtg 1320

aagttaccgg tggtttcaaa aagacttacg ccttcttccc aactgacaat atgccaggtg 1380

ttgctgaatt gtctgctatc ccatccatgc caccagccgt tgccgagaat gctgaattgt 1440

tcgctcgtta tggtttggac aaggtccaaa tgacctccat ggactacaag aaaagacaag 1500

tcaacttgta tttctccgaa ttgtctgctc aaactttaga agccgaatct gttttggctt 1560

tggttagaga attaggtttg cacgttccaa acgaattggg tttgaagttt tgtaaacgtt 1620

ctttctctgt ttatccaact ttgaactggg aaaccggtaa aatcgacaga ttgtgcttcg 1680

ctgtcatctc taacgaccca accttggtcc catcctccga tgaaggtgat atcgaaaagt 1740

tccacaacta cgccactaag gctccttacg cttacgtcgg tgagaaacgt accttggtct 1800

atggtttgac tttatcccca aaggaggaat actacaagtt gggtgcttac taccacatta 1860

ccgacgtcca aagaggtttg ttaaaggcct tcgactcttt agaagacggc tgaagacata 1920

aaactgaaac aacaccaatt aataatagac tttagtgctt ttaactaaga attattagtc 1980

ttttctgctt attttttcat catagtttag aacactttat attaacgaat agtttatgaa 2040

tctatttagg tttaaaaatt gatacagttt tataagttac tttttcaaag actcgtgctg 2100

tctattgcat aatgcactgg aaggggaaaa aaaaggtgca cacgcgtggc tttttcttga 2160

atttgcagtt tgaaaaataa ctacatggat gataagaaaa catggagtac agtcactttg 2220

agaaccttca atcagctggt aacgtcttcg ttaattggat actcaaaaaa gatggatagc 2280

atgaatcaca agatggaagg aaatgcgggc cacgaccaca gtgatatgca tatgggagat 2340

ggagatgata cctggatacc ctctttatat tacatcaaaa taagaaaata attataaca 2399

<210> 45

<211> 5616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有***OAS编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> LV3

<222> (1)..(40)

<220>

<221> THD3p

<222> (41)..(693)

<220>

<221> L1

<222> (694)..(733)

<220>

<221> Hex1

<222> (734)..(2899)

<220>

<221> T3

<222> (2900)..(3303)

<220>

<221> ADH1终止子

<222> (3071)..(3263)

<220>

<221> P5

<222> (3264)..(3837)

<220>

<221> LTP2

<222> (3264)..(3303)

<220>

<221> Tef1p

<222> (3304)..(3797)

<220>

<221> L3

<222> (3798)..(3837)

<220>

<221> OAS

<222> (3841)..(4995)

<220>

<221> PRM9t

<222> (5039)..(5576)

<220>

<221> LV5

<222> (5577)..(5616)

<400> 45

aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc tcgagtttat cattatcaat 60

actgccattt caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag 120

tcaaaaaatt agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt 180

tacacagaat atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta 240

aatataatgg agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa 300

aatattgttt tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga 360

gaacaggggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc 420

tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca 480

ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca 540

gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt 600

gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt 660

tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgactagaaa atttattata aaaggaagag 720

aaataattaa acaatgggta aaaactataa gtctttagac tccgttgtcg cctccgactt 780

tattgctttg ggtatcacct ccgaagttgc tgaaacttta cacggtagat tagctgagat 840

tgtttgtaac tacggtgccg ccactccaca aacttggatt aatatcgcta accatatttt 900

gtctccagac ttaccattct ccttgcatca aatgttgttt tacggttgtt ataaagattt 960

tggtccagct cctccagctt ggatcccaga tcctgaaaaa gttaagtcta ctaacttagg 1020

tgctttgtta gaaaaaagag gtaaagaatt cttgggtgtt aagtataaag atccaatctc 1080

ttccttctct cattttcaag aattctccgt tagaaaccca gaagtttatt ggagaaccgt 1140

tttgatggac gaaatgaaga tctccttctc taaggatcct gaatgtattt tgagacgtga 1200

cgatatcaac aatccaggtg gttctgaatg gttaccaggt ggttatttga actctgctaa 1260

aaattgtttg aacgtcaatt ccaacaaaaa attgaacgac accatgattg tttggagaga 1320

cgaaggtaac gatgacttac cattaaacaa gttgaccttg gaccaattga gaaagcgtgt 1380

ctggttggtc ggttacgcct tggaggaaat gggtttggaa aaaggttgtg ccatcgctat 1440

cgatatgcca atgcacgtcg acgccgtcgt tatctatttg gccatcgttt tagctggtta 1500

cgtcgtcgtc tccatcgctg actctttctc cgctccagaa atttccacta gattgagatt 1560

atccaaggcc aaggctattt tcactcaaga tcacattatt agaggtaaga agcgtattcc 1620

attgtactcc agagtcgtcg aagccaagtc tcctatggcc attgttatcc catgttctgg 1680

ttctaacatt ggtgctgaat tgagagatgg tgacatttcc tgggactatt tcttggaaag 1740

agctaaggaa tttaagaact gcgaatttac cgccagagaa caacctgttg atgcctacac 1800

taacattttg ttctcttctg gtacaactgg tgagccaaag gctatccctt ggactcaagc 1860

taccccatta aaggccgccg ctgatggttg gtcccacttg gacattcgta agggtgacgt 1920

catcgtctgg ccaactaact tgggttggat gatgggtcca tggttagttt acgcctcttt 1980

gttaaacggt gcttccattg ccttgtacaa cggttctcca ttggtttctg gtttcgctaa 2040

gtttgtccaa gacgccaagg ttaccatgtt aggtgttgtt ccatctatcg tcagatcttg 2100

gaagtctact aactgtgtct ctggttacga ttggtctact atcagatgct tctcttcctc 2160

tggtgaagcc tctaacgttg atgaatattt gtggttgatg ggtcgtgcca actacaagcc 2220

agttatcgaa atgtgtggtg gtacagagat cggtggtgct ttttccgctg gttccttttt 2280

gcaagctcaa tctttgtctt ctttctcttc tcaatgtatg ggttgtactt tgtatatttt 2340

ggataagaac ggttacccaa tgcctaagaa caaaccaggt atcggtgaat tagctttggg 2400

tccagttatg ttcggtgctt ccaagacctt gttgaacggt aatcaccatg atgtctattt 2460

caaaggtatg ccaactttaa acggtgaagt cttgagacgt cacggtgaca tctttgaatt 2520

gacttctaac ggttactacc atgctcacgg tagagctgat gatactatga acattggtgg 2580

tattaagatt tcttctatcg aaatcgaaag agtttgtaat gaagttgacg acagagtctt 2640

tgaaaccact gctattggtg tcccaccatt gggtggtggt ccagaacaat tagtcatttt 2700

cttcgttttg aaggattcta acgacactac catcgactta aaccaattga gattgtcttt 2760

caacttgggt ttgcaaaaga agttgaaccc attatttaaa gtcactagag ttgttccatt 2820

gtcttctttg ccaagaaccg ccaccaacaa gattatgaga agagttttga gacaacaatt 2880

ttctcatttc gaaggctgaa gacataaaac tgaaacaaca ccaattaata atagactttt 2940

ggacttcttc gccagaggtt tggtcaagtc tccaatcaag gttgtcggct tgtctacctt 3000

gccagaaatt tacgaaaaga tggaaaaggg tcaaatcgtt ggtagatacg ttgttgacac 3060

ttctaaataa gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa 3120

aataagtgta tacaaatttt aaagtgactc ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt 3180

gagtaactct ttcctgtagg tcaggttgct ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat 3240

tgaccacacc tctaccggca tgccttaaat aacatactca tcactaaaca ttcttaacaa 3300

tcaaagcaac aggcgcgttg gacttttaat tttcgaggac cgcgaatcct tacatcacac 3360

ccaatccccc acaagtgatc ccccacacac catagcttca aaatgtttct actccttttt 3420

tactcttcca gattttctcg gactccgcgc atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca 3480

cagcatacta aatttcccct ctttcttcct ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag 3540

gtttggaaaa gaaaaaagag accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa 3600

aatttttatc acgtttcttt ttcttgaaaa tttttttttt tgattttttt ctctttcgat 3660

gacctcccat tgatatttaa gttaataaac ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat 3720

ttttcttgtt ctattacaac tttttttact tcttgctcat tagaaagaaa gcatagcaat 3780

ctaatctaag ttttaataca tctaccagtc aacagccaac aattaactaa ttaaacaatg 3840

aaccacttga gagctgaagg tccagcttcc gttttggcta tcggtacagc taaccctgaa 3900

aacatcttgt tgcaagatga attcccagac tattacttca gagttaccaa gtctgaacat 3960

atgactcaat tgaaggaaaa gtttagaaag atttgtgata agtctatgat cagaaagcgt 4020

aattgttttt tgaacgaaga acatttaaaa caaaatccaa gattggttga gcacgaaatg 4080

caaactttgg atgctagaca agatatgtta gtcgtcgaag tcccaaagtt gggtaaggat 4140

gcttgtgcta aggctattaa ggagtggggt caaccaaagt ccaaaatcac ccacttgatt 4200

ttcacttccg cttctactac cgacatgcca ggtgctgatt accactgtgc taagttgttg 4260

ggtttatccc cttctgttaa aagagttatg atgtaccaat tgggttgcta cggtggtggt 4320

actgttttga gaattgccaa ggacatcgct gagaataaca agggtgctag agttttggcc 4380

gtctgttgtg acatcatggc ttgtttattc agaggtccat ctgaatccga cttggaattg 4440

ttagtcggtc aagccatctt tggtgatggt gctgccgccg ttattgttgg tgctgaacca 4500

gatgaatccg tcggtgaaag accaatcttt gagttggtct ctactggtca aaccattttg 4560

ccaaactccg aaggtactat tggtggtcac atccgtgaag ctggtttgat ttttgattta 4620

cacaaggatg tcccaatgtt gatctctaac aacatcgaga agtgtttaat tgaagccttc 4680

accccaattg gtatttccga ctggaactct attttctgga ttactcatcc aggtggtaag 4740

gctattttag ataaggttga agaaaagttg cacttgaagt ctgataaatt cgttgactct 4800

agacacgttt tgtctgaaca tggtaatatg tcttcttcca ctgttttgtt cgttatggat 4860

gaattgagaa agagatcttt ggaagaaggt aagtccacta ctggtgacgg tttcgaatgg 4920

ggtgttttgt tcggtttcgg tccaggtttg actgttgaaa gagtcgttgt ccgttctgtt 4980

ccaatcaagt acggctaata ataattaaat actattttca aaattctact taaaaataac 5040

agaagacggg agacactagc acacaacttt accaggcaag gtatttgacg ctagcatgtg 5100

tccaattcag tgtcatttat gattttttgt agtaggatat aaatatatac agcgctccaa 5160

atagtgcggt tgccccaaaa acaccacgga acctcatctg ttctcgtact ttgttgtgac 5220

aaagtagctc actgccttat tatcacattt tcattatgca acgcttcgga aaatacgatg 5280

ttgaaaatgc ctctagagat gaaaaacaat cgtaaaaggg tcctgcgtaa ttgaaacatt 5340

tgatcagtat gcagtggcac agaaacaacc aggaatacta tagtcatagg caatacaagg 5400

tatatattgg ctatgcagac ccctccagaa agtaccgacg tcaagttaga tacacttaac 5460

gaacctagtg cacatttaat tgagaaaaat gtggctcttc ctaaggacat attccgttcg 5520

tacttgagtt attggatcta tgaaatcgct cgctatacac cagtcatgat tttgtccctc 5580

tttatattac atcaaaataa gaaaataatt ataaca 5616

<210> 46

<211> 10584

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有盘基网柄菌DiPKS编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> LV3

<222> (1)..(40)

<220>

<221> 酿酒酵母GAL1启动子

<222> (41)..(482)

<220>

<221> L1

<222> (483)..(522)

<220>

<221> DiPKS

<222> (523)..(9966)

<220>

<221> 基序1

<222> (5050)..(5076)

<220>

<221> C-甲基转移酶结构域

<222> (5050)..(5412)

<220>

<221> 基序2

<222> (5309)..(5331)

<220>

<221> 基序3

<222> (5389)..(5421)

<220>

<221> L2

<222> (9967)..(10006)

<220>

<221> PRM9t

<222> (10007)..(10544)

<220>

<221> LV5

<222> (10545)..(10584)

<400> 46

aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc cggattagaa gccgccgagc 60

gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 120

tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 180

tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 240

tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 300

tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 360

aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 420

aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 480

agctagaaaa tttattataa aaggaagaga aataattaaa caatgaacaa gaactccaaa 540

atccagtccc caaactcttc tgatgttgct gttattggtg ttggttttag attcccaggt 600

aactctaatg acccagaatc tttgtggaac aacttgttgg atggtttcga tgctattacc 660

caagtcccaa aagaaagatg ggctacttct tttagagaga tgggtttgat caagaacaag 720

ttcggtggtt tcttgaagga ttctgaatgg aagaatttcg accctttgtt ctttggtatc 780

ggtccaaaag aagctccatt cattgatcca caacaaaggt tgttgttgtc catcgtttgg 840

gaatctttgg aagatgctta catcagacca gatgaattga gaggttctaa cactggtgtt 900

ttcatcggtg tttctaacaa cgattacacc aagttgggtt tccaagacaa ctactctatt 960

tctccataca ctatgaccgg ctctaactct tcattgaact ccaacagaat ttcctactgc 1020

ttcgatttta gaggtccatc cattactgtt gataccgctt gttcttcttc cttggtttct 1080

gttaatttgg gtgtccaatc catccaaatg ggtgaatgta agattgctat ttgcggtggt 1140

gttaacgctt tgtttgatcc atctacatct gttgcctttt ccaagttggg tgttttgtct 1200

gaaaatggca gatgcaactc ttttagtgat caagcctctg gttacgttag atctgaaggt 1260

gctggtgttg ttgttttgaa gtctttggaa caagctaagt tggatggtga tagaatctac 1320

ggtgttatca agggtgtttc ctctaatgaa gatggtgctt ctaatggtga caagaactct 1380

ttgactactc catcttgtga agcccaatcc attaacattt ctaaggctat ggaaaaggcc 1440

tccttgtctc catctgatat ctattacatt gaagcccatg gtactggtac tccagttggt 1500

gatccaattg aagttaaggc cttgtccaag atcttctcca actctaacaa caaccagttg 1560

aacaacttct ctaccgatgg taatgataac gatgatgatg atgacgataa cacctctcca 1620

gaaccattat tgattggctc attcaagtcc aacatcggtc atttggaatc tgctgctggt 1680

attgcttctt tgattaagtg ttgcttgatg ttgaagaaca ggatgttggt tccatccatt 1740

aactgctcta atttgaaccc atccattcca ttcgatcagt acaacatctc cgttatcaga 1800

gaaatcagac aattcccaac cgataagttg gttaacatcg gtatcaattc tttcggtttc 1860

ggtggttcta actgccattt gattattcaa gagtacaaca acaacttcaa gaacaactct 1920

accatctgca ataacaacaa caacaacaat aacaacatcg actacttgat cccaatctcc 1980

tctaagacta agaagtcctt ggataagtac ttgattttga tcaagaccaa ctccaactac 2040

cacaaggata tttctttcga tgacttcgtc aagttccaaa tcaagtctaa gcagtacaac 2100

ttgtccaaca gaatgactac cattgctaac gattggaact ccttcattaa gggttctaac 2160

gaattccaca acttgatcga atctaaggat ggtgaaggtg gttcttcatc ttctaacaga 2220

ggtattgatt ccgccaatca aatcaacact actactacct ctaccatcaa cgatatcgaa 2280

cctttgttgg ttttcgtttt ctgtggtcaa ggtccacaat ggaatggtat gattaagacc 2340

ttgtacaact ccgagaacgt tttcaagaac accgttgatc atgttgacag catcttgtac 2400

aagtacttcg gttactccat tttgaacgtc ttgtctaaga tcgatgataa cgacgattcc 2460

atcaaccatc caatagttgc tcaaccatct ttgttcttgt tgcaaattgg tttggtcgag 2520

ttgtttaagt actggggtat ctacccatct atctctgttg gtcattcttt cggtgaagtc 2580

tcttcttatt acttgtccgg tatcatctct ttggaaaccg cttgtaaaat cgtctacgtc 2640

agatcctcta atcagaacaa aactatgggt tccggtaaga tgttggttgt ttctatgggt 2700

tttaagcaat ggaacgatca attctctgct gaatggtccg atattgaaat tgcttgttac 2760

aacgctccag attccatagt tgttactggt aacgaagaaa gattgaaaga attgtccatc 2820

aagttgtccg acgaatccaa tcaaattttc aacaccttct tgaggtcccc atgttctttt 2880

cattcttccc atcaagaagt catcaagggt tctatgttcg aagagttgtc taacttgcaa 2940

tctactggtg aaaccgaaat ccctttgttc tctactgtta ctggtagaca agttttgtct 3000

ggtcatgtta ctgctcaaca catctacgat aatgttagag aaccagtctt gttccaaaag 3060

acgattgaat ccattacctc ctacatcaag tctcactacc catccaatca aaaggttatc 3120

tacgttgaaa ttgctccaca cccaaccttg ttttcattga tcaaaaagtc catcccatcc 3180

tccaacaaga attcctcttc tgttttgtgt ccattgaaca gaaaagaaaa ctccaacaac 3240

tcctacaaga agttcgtttc tcagttgtac ttcaacggtg ttaacgttga cttcaacttc 3300

cagttgaact ccatttgcga taacgttaac aacgatcacc atttgaacaa cgtcaagcaa 3360

aactccttca aagagactac caattccttg ccaagatacc aatgggaaca agatgaatat 3420

tggtccgaac cattgatctc cagaaagaat agattggaag gtccaactac ttccttgttg 3480

ggtcatagaa ttatctacag cttcccagtt ttccaatccg ttttggactt gcaatctgac 3540

aactacaaat acttgttgga ccacttggtt aacggtaagc cagtttttcc aggtgctggt 3600

tatttggata tcatcatcga attcttcgac taccaaaagc agcagttgaa ttcctctgat 3660

tcctctaact cctacatcat caacgttgac aagatccaat tcttgaaccc aattcacttg 3720

accgaaaaca agttgcaaac cttgcaatct tctttcgaac ctatcgttac taagaagtct 3780

gccttctctg ttaacttctt catcaaggat accgtcgagg atcaatctaa ggttaagtct 3840

atgtctgacg aaacttggac taacacttgt aaggctacca tttccttgga acaacaacag 3900

ccatctccat cttctacttt gactttgtct aagaagcaag acttgcagat cttgagaaac 3960

agatgcgata ttagcaagct agacaagttt gagttgtacg acaagatctc taagaatttg 4020

ggcttgcagt acaactcctt gtttcaagtt gttgatacca tcgaaactgg taaggattgc 4080

tcttttgcta ctttgtcttt gccagaagat actttgttca ccaccatttt gaacccatgc 4140

ttgttggata actgtttcca tggtttgttg accttgatca acgaaaaggg ttctttcgtt 4200

gtcgagtcca tttcttctgt ttctatctac ttggagaaca tcggttcctt caatcaaact 4260

tctgttggta acgtccagtt ctacttgtac accactattt ctaaagccac ctcctttagt 4320

tctgaaggta cttgtaagtt gttcaccaag gatggttcct tgattttgtc tatcggtaag 4380

ttcatcatca agtccaccaa tccaaagtct actaagacca acgaaactat cgaatctcca 4440

ttggacgaaa ccttctctat tgaatggcaa tctaaggatt ctccaattcc aaccccacaa 4500

caaatccaac aacaatctcc attgaactct aacccatcct tcattagatc taccatcttg 4560

aaggacatcc agttcgaaca atactgctcc tccattatcc acaaagaatt gatcaaccac 4620

gaaaagtaca agaaccagca atccttcgat atcaactcct tggaaaacca cttgaacgat 4680

gaccaattga tggaatcctt gtccatctcc aaagaatact tgagattctt caccaggatc 4740

atctccatca ttaagcaata cccaaagatc ttgaacgaaa aagagctaaa agaattgaaa 4800

gaaatcatcg aattgaagta cccatccgaa gttcagttgt tggaattcga agttatcgag 4860

aaggtgtcca tgattatccc aaagttgttg ttcgaaaacg acaagcaatc ttccatgacc 4920

ttgttccaag ataacttgtt gaccaggttc tactccaatt ctaactctac cagattctac 4980

ttggaaaggg tttccgaaat ggtcttggaa tctattagac caatcgtcag agaaaagagg 5040

gtgttcagaa ttttggaaat tggtgctggt acaggctctt tgtctaatgt tgttttgact 5100

aagttgaaca cctacttgtc caccttgaat tctaatggtg gttctggtta caacatcatc 5160

attgagtaca ccttcaccga tatttccgcc aacttcatta ttggtgaaat ccaagaaacc 5220

atgtgcaact tgtacccaaa cgttactttc aagttctccg tcttggactt ggagaaagag 5280

attattaact cctccgattt cttgatgggt gattacgata tagttttgat ggcctacgtt 5340

atccatgccg tttctaacat taagttctcc atcgaacagt tgtacaagtt gttgtctcca 5400

agaggttggt tgttgtgtat tgaacctaag tccaacgttg tgttctccga tttggttttc 5460

ggttgtttta atcagtggtg gaactactac gatgatatta gaactaccca ctgctccttg 5520

tctgaatctc aatggaatca gttgttgttg aaccagtcct tgaacaacga atcctcttct 5580

tcttctaact gttacggtgg tttctccaac gtttctttta ttggtggtga aaaggatgtc 5640

gactcccatt ctttcatatt gcactgccaa aaagaatcca tctcccaaat gaagttagcc 5700

accactatta acaacggttt gtcatctggt tccatcgtta tcgttttgaa ctctcaacaa 5760

ttgaccaaca tgaagtccta cccaaaggtt attgagtata ttcaagaggc tacctctttg 5820

tgcaagacca ttgaaattat cgattccaag gacgtcttga actctaccaa ttcagttttg 5880

gaaaagatcc aaaagtcctt gttggtgttc tgtttgttgg gttatgactt gttggagaac 5940

aactaccaag aacagtcttt cgaatacgtt aagttgttga acttgatctc tactaccgcc 6000

tcttcatcta atgataagaa accaccaaag gtcttgttga tcaccaagca atctgaaaga 6060

atctccaggt ctttctactc cagatccttg attggtattt ccagaacctc tatgaacgag 6120

tacccaaatt tgtccattac ctctatcgat ttggatacca acgactactc attgcagtct 6180

ttgttgaagc caatcttcag caactctaag ttttccgaca acgagttcat cttcaaaaag 6240

ggcttgatgt tcgtgtccag gatctttaag aacaagcagt tgctagaatc ctccaacgct 6300

tttgaaactg actcttctaa cttgtactgt aaggcctctt ctgacttgtc ttacaagtac 6360

gctattaagc agtctatgtt gaccgaaaat cagatcgaaa tcaaggttga atgcgtcggt 6420

attaacttca aggacaacct attctacaag ggcttgttgc cacaagaaat tttcagaatg 6480

ggtgacatct acaatccacc atatggtttg gaatgctctg gtgttattac cagaattggt 6540

tctaacgtca ccgaatactc agttggtcaa aatgtttttg gtttcgccag acattctttg 6600

ggttctcatg ttgttaccaa caaggatttg gttatcttga agccagatac catctcattt 6660

tctgaagctg cttctatccc agttgtttac tgtactgctt ggtactcctt gttcaacatt 6720

ggtcagttgt ctaacgaaga atccatccta attcattctg ctactggtgg tgtaggtttg 6780

gcttctttga atttgttgaa aatgaagaat cagcaacagc aaccattgac caatgtttat 6840

gctactgttg gctctaacga gaagaagaag ttcttgatcg ataacttcaa caacttgttc 6900

aaagaggacg gcgaaaacat tttctctacc agagacaaag aatactccaa ccagttggaa 6960

tccaagatcg atgttatttt gaacaccttg tccggtgaat tcgtcgaatc taatttcaag 7020

tccttgagat ccttcggtag attgattgat ttgtctgcta ctcacgttta cgccaatcaa 7080

caaattggtc taggtaactt caagttcgac cacttgtatt ctgctgttga cttggaaaga 7140

ttgatcgacg aaaaacctaa gttgttgcag tccatcttgc aaagaattac caactctatc 7200

gtcaacggtt ccttggaaaa aattccaatt accatcttcc catccaccga aactaaggat 7260

gctatcgaat tattgtccaa gagatcccat atcggtaaag ttgttgtaga ttgcaccgat 7320

atctctaagt gtaatcctgt tggtgatgtg atcaccaact tctctatgag attgccaaag 7380

ccaaactacc agttgaattt gaactccacc ttgttgatta ctggtcagtc tggtttgtct 7440

atccctttgt tgaattggtt gttgtctaag tctggtggta acgttaagaa cgttgtcatc 7500

atttctaagt ccaccatgaa gtggaagttg cagactatga tttcccattt cgtttccggt 7560

ttcggtatcc attttaacta cgttcaagtc gacatctcca actacgatgc tttgtctgaa 7620

gctattaagc aattgccatc tgatttgcca ccaatcacct ctgtttttca tttggctgct 7680

atctacaacg atgttccaat ggatcaagtt accatgtcta ccgttgaatc tgttcataac 7740

cctaaagttt tgggtgccgt taacttgcat agaatctctg tttcttttgg ttggaagttg 7800

aaccacttcg tcttgttctc ttctattact gctattaccg gttacccaga ccaatctatc 7860

tacaattctg ccaactctat tttggacgct ttgtccaact ttagaaggtt tatgggtttg 7920

ccatccttct ccattaactt gggtccaatg aaggatgaag gtaaggtttc taccaacaag 7980

agcatcaaga agctattcaa gtctagaggt ttgccaagcc tatccttgaa caagttattt 8040

ggtttgttgg aggtcgtcat caacaaccca tctaatcatg ttatcccatc ccaattgatt 8100

tgctccccaa tcgatttcaa gacctacatc gaatctttct caactatgag gccaaagttg 8160

ttacacttgc aacctaccat ttccaagcag caatcttcta tcattaacga ttctaccaag 8220

gcttcctcca acatttcatt gcaagataag atcacctcca aggtgtctga tttgttgtcc 8280

attccaatct ccaagatcaa cttcgatcat ccattgaaac actacggctt ggattctttg 8340

ttgaccgttc aattcaaatc ctggatcgac aaagaattcg aaaagaactt gttcacccat 8400

atccaattgg ccaccatctc tattaactca ttcttggaaa aggtgaacgg cttgtctaca 8460

aacaataaca acaacaacaa ttccaacgtc aagtcctctc catccattgt caaagaagaa 8520

atcgttacct tggacaagga tcaacaacca ttgctattga aagaacacca gcacattatc 8580

atctccccag atattagaat caacaagcca aagagggaat ccttgattag aaccccaatc 8640

ttgaacaaat tcaaccagat caccgaatcc attatcactc catctacacc atctttgtcc 8700

caatccgatg ttttgaaaac tccaccaatc aagtctttga acaacactaa gaactccagc 8760

ttgattaaca ccccaccaat tcaatctgtc caacaacatc aaaagcaaca acaaaaggtc 8820

caagtcatcc aacaacagca acaaccatta tccagattgt cctacaagag caacaacaac 8880

tctttcgttt tgggtatcgg tatttctgtt ccaggtgaac ctatttccca acaatccttg 8940

aaagactcca tctccaatga cttttctgat aaggctgaaa ctaacgagaa ggtcaagaga 9000

atctttgagc aatctcaaat caagaccaga cacttggtta gagattacac taagccagag 9060

aactccatca agttcagaca tttggaaacc attaccgatg tgaacaacca gttcaagaaa 9120

gttgttccag atttggctca acaagcctgt ttgagagctt tgaaagattg gggtggtgat 9180

aagggtgata ttacccatat agtttctgtt acctccaccg gtattatcat cccagatgtt 9240

aatttcaagt tgatcgactt gttgggcttg aacaaggatg ttgaaagagt gtctttgaac 9300

ctaatgggtt gtttggctgg tttgagttct ttgagaactg ctgcttcttt ggctaaggct 9360

tctccaagaa atagaatttt ggttgtctgt accgaagtct gctccttgca tttttctaat 9420

actgatggtg gtgatcaaat ggtcgcctct tctatttttg ctgatggttc tgctgcttac 9480

attattggtt gtaacccaag aattgaagaa accccattat acgaagtcat gtgctccatt 9540

aacagatctt tcccaaatac cgaaaacgcc atggtttggg atttggaaaa agaaggttgg 9600

aacttgggtt tggatgcttc tattccaatt gtcattggtt ctggtattga agccttcgtt 9660

gatactttgt tggataaggc taagttgcaa acttccactg ctatttctgc taaggattgc 9720

gaattcttga ttcatactgg tggcaagtcc atcttgatga acatcgaaaa ttccttgggt 9780

atcgacccaa agcaaactaa gaatacttgg gatgtttacc atgcctacgg caatatgtca 9840

tctgcctctg ttattttcgt tatggatcat gccagaaagt ccaagtcttt gccaacttac 9900

tcaatttctt tggcttttgg tccaggtttg gcttttgaag gttgtttctt gaagaacgtc 9960

gtctaaagac ataaaactga aacaacacca attaataata gactttacag aagacgggag 10020

acactagcac acaactttac caggcaaggt atttgacgct agcatgtgtc caattcagtg 10080

tcatttatga ttttttgtag taggatataa atatatacag cgctccaaat agtgcggttg 10140

ccccaaaaac accacggaac ctcatctgtt ctcgtacttt gttgtgacaa agtagctcac 10200

tgccttatta tcacattttc attatgcaac gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatgcct 10260

ctagagatga aaaacaatcg taaaagggtc ctgcgtaatt gaaacatttg atcagtatgc 10320

agtggcacag aaacaaccag gaatactata gtcataggca atacaaggta tatattggct 10380

atgcagaccc ctccagaaag taccgacgtc aagttagata cacttaacga acctagtgca 10440

catttaattg agaaaaatgt ggctcttcct aaggacatat tccgttcgta cttgagttat 10500

tggatctatg aaatcgctcg ctatacacca gtcatgattt tgtccctctt tatattacat 10560

caaaataaga aaataattat aaca 10584

<210> 47

<211> 4909

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有Cas9编码序列、调节序列和整合序列的盒

<220>

<221> LV3

<222> (1)..(40)

<220>

<221> TEF1p

<222> (41)..(446)

<220>

<221> Cas9

<222> (470)..(4609)

<220>

<221> LV5

<222> (4870)..(4909)

<400> 47

aggaatactc tgaataaaac aacttatata ataaaaatgc atagcttcaa aatgtttcta 60

ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca tcgccgtacc acttcaaaac 120

acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc tagggtgtcg ttaattaccc 180

gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt tctttttctt cgtcgaaaaa 240

ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat tttttttttg atttttttct 300

ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc 360

agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc ttgctcatta gaaagaaagc 420

atagcaatct aatctaagtt ttctagaact agtggatccc ccgggaaaaa tggacaagaa 480

gtactccatt gggctcgata tcggcacaaa cagcgtcggc tgggccgtca ttacggacga 540

gtacaaggtg ccgagcaaaa aattcaaagt tctgggcaat accgatcgcc acagcataaa 600

gaagaacctc attggcgccc tcctgttcga ctccggggag acggccgaag ccacgcggct 660

caaaagaaca gcacggcgca gatatacccg cagaaagaat cggatctgct acctgcagga 720

gatctttagt aatgagatgg ctaaggtgga tgactctttc ttccataggc tggaggagtc 780

ctttttggtg gaggaggata aaaagcacga gcgccaccca atctttggca atatcgtgga 840

cgaggtggcg taccatgaaa agtacccaac catatatcat ctgaggaaga agcttgtaga 900

cagtactgat aaggctgact tgcggttgat ctatctcgcg ctggcgcata tgatcaaatt 960

tcggggacac ttcctcatcg agggggacct gaacccagac aacagcgatg tcgacaaact 1020

ctttatccaa ctggttcaga cttacaatca gcttttcgaa gagaacccga tcaacgcatc 1080

cggagttgac gccaaagcaa tcctgagcgc taggctgtcc aaatcccggc ggctcgaaaa 1140

cctcatcgca cagctccctg gggagaagaa gaacggcctg tttggtaatc ttatcgccct 1200

gtcactcggg ctgaccccca actttaaatc taacttcgac ctggccgaag atgccaagct 1260

tcaactgagc aaagacacct acgatgatga tctcgacaat ctgctggccc agatcggcga 1320

ccagtacgca gacctttttt tggcggcaaa gaacctgtca gacgccattc tgctgagtga 1380

tattctgcga gtgaacacgg agatcaccaa agctccgctg agcgctagta tgatcaagcg 1440

ctatgatgag caccaccaag acttgacttt gctgaaggcc cttgtcagac agcaactgcc 1500

tgagaagtac aaggaaattt tcttcgatca gtctaaaaat ggctacgccg gatacattga 1560

cggcggagca agccaggagg aattttacaa atttattaag cccatcttgg aaaaaatgga 1620

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cgaaaaggtg cttcctaaac actctctgct gtacgagtac ttcacagttt ataacgagct 2040

caccaaggtc aaatacgtca cagaagggat gagaaagcca gcattcctgt ctggagagca 2100

gaagaaagct atcgtggacc tcctcttcaa gacgaaccgg aaagttaccg tgaaacagct 2160

caaagaagac tatttcaaaa agattgaatg tttcgactct gttgaaatca gcggagtgga 2220

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ccagcttcag aatgagaagc tctacctgta ctacctgcag aacggcaggg acatgtacgt 2940

ggatcaggaa ctggacatca atcggctctc cgactacgac gtggatcata tcgtgcccca 3000

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ttaatttgcc ctctttatat tacatcaaaa taagaaaata attataaca 4909