阅读说明：本技术 基因组定点编辑增强互叶白千层合成1,8-桉叶素 (Genome site-directed editing for enhancing synthesis of 1,8-cineole by melaleuca alternifolia ) 是由 杨俊� 于 2020-07-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基因组定点编辑强互叶白千层合成1,8-桉叶素,其特征是通过基因组定点编辑,改善互叶白千层单萜合成酶活性,提升了互叶白千层合成1,8-桉叶素的能力,其新鲜枝叶用水蒸馏提取,得到纯天然植物精油,即互叶白千层精油(茶树油)。该植株在广西成功繁育种植已超10年,其初蒸的互叶白千层精油中1,8-桉叶素含量超过75%,松油醇-4含量低于8%；该初蒸油再用分子蒸馏分离提纯,可获得1,8-桉叶素纯品,纯度超过95%,可开发出富含1,8-桉叶素的化妆品、日用品、药品等。本发明研究过程包括互叶白千层天然产物、1,8-桉叶素生物合成途径、酶组学,互叶白千层单萜合成酶基因组学和基因组定点编辑。(The invention discloses a method for synthesizing 1,8-cineole by editing a strong melaleuca alternifolia layer at a genome fixed point, which is characterized in that the activity of monoterpene synthetase of the melaleuca alternifolia layer is improved and the capability of synthesizing 1,8-cineole by the melaleuca alternifolia layer is improved by editing the genome fixed point, and fresh branches and leaves of the melaleuca alternifolia layer are distilled and extracted by water to obtain pure natural plant essential oil, namely melaleuca alternifolia essential oil (tea tree oil). The plant has been successfully bred and planted in Guangxi for more than 10 years, the content of 1,8-cineole in the primarily steamed melaleuca alternifolia essential oil exceeds 75 percent, and the content of terpineol-4 is lower than 8 percent; the primary distilled oil is separated and purified by molecular distillation to obtain 1,8-cineole pure product with purity over 95%, and can be used for developing cosmetics, daily necessities, medicines, etc. rich in 1, 8-cineole. The research process of the invention comprises the natural product of melaleuca alternifolia, 1,8-cineole biosynthesis pathway, enzymomics, melaleuca alternifolia monoterpene synthetase genomics and genome fixed-point editing.)

基因组定点编辑增强互叶白千层合成1,8-桉叶素

技术领域

本发明属生物医药领域，涉及基因组定点编辑增强互叶白千层（Melaleucaalternifolia）合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole），即通过基因组定点编辑，改善互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）活性，提升了互叶白千层（Melaleuca alternifolia）生成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的能力，其新鲜枝叶用水蒸馏提取，得到纯天然植物精油，即互叶白千层精油（又称茶树油，茶树精油，TeaTreeOil）。该技术改良的互叶白千层新植株的新鲜枝叶，初蒸的互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）中1,8-桉叶素（1,8-Cineole）含量超过75%，松油醇-4（Terpinen-4-o1）含量低于8%；初蒸的互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）再用分子蒸馏分离提纯，可获得1,8-桉叶素（1,8-Cineole）纯品，纯度超95%，可开发出富含1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的化妆品、日用品、药品等。

背景技术

1770年，英国的库克船长登陆澳大利亚时，发现当地毛利人用一种气味浓烈的植物叶子来煮茶喝，因此，将这种植物叫“茶树（Tea Tree）”；同时，还发现毛利人野外损伤时，会立刻摘下“茶树叶”，捣烂后敷于患处，伤口痊愈和充血肿胀消退很快。出于好奇，库克船长在澳大利亚采集了“茶树叶”，带回英国交给化学家分析研究，这是人类以科学方式研究“茶树油”的开始。上世纪二十年代，兴起了“茶树油（Tea TreeOil）”的科学研究热潮。其实，这种“茶树”的现代称谓为“互叶白千层（Melaleuca alternifolia）”。

互叶白千层（Melaleuca alternifolia）是桃金娘科白千层属灌木，原产澳大利亚，主产于澳大利亚新南威尔士州的北部沿海。上世纪九十年代，我国广东、广西、海南、福建等地进行了广泛引种，其新鲜枝叶用水蒸馏提取，得到纯天然植物精油，即互叶白千层精油，又称茶树油或者茶树精油（Tea TreeOil）。互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）为无色至淡黄色液体，有特征香气，能有效地抑制致病菌和霉菌的功效，具有抑菌、抗炎、驱虫，杀螨的功能，且渗透性强，安全性高，无污染、无腐蚀性。

澳大利亚土著居民应用互叶白千层（Melaleuca alternifolia）治病已有近千年历史；二战期间，每个澳大利亚士兵和水手均配备了互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil），用于热带感染和外伤损害的治疗。所有研究均表明，互叶白千层精油（茶树油，Tea Tree Oil）具有清新消毒，抗菌消炎，促进伤口愈合的功效。互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）作为广谱抗菌剂，被广泛应用到农用杀真菌剂、卫生消毒剂、防腐剂、空气清新剂、空调杀菌剂、防痤疮（粉刺）清洁剂、汽车清洁剂、地毯除臭剂、餐具清洁剂、清新保湿剂、除臭剂、浴用清洁剂、人用清洁剂、宠物用卫生用品等日化、制药、食品等行业。互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）已列入美国食品药品监督管理局采购名单，2001年列入《欧洲药典》，中国***2003年第四号公告也把互叶白千层精油（茶树油）列入食品用香料名单。虽然互叶白千层（Melaleuca alternifolia）没有列入《中国药典》，但是，互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）应用说明，其具有抑菌抗炎，安全性高的特点。

互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）主要天然产物包括松油醇-4（Terpinen-4-o1）、1.8-桉叶素（1,8-Cineole）、γ-松油烯（γ-Terpinene）、α-松油烯（α-Terpinene）、α-松油醇（α-Terpineol）和对伞花烃（p-Cymene）。其中，松油醇-4（Terpinen-4-o1）和1.8-桉叶素（1,8-Cineole）最为重要，两者分子量均为154.25，分子式均为C₁₀H₁₈O（图1）。

国外标准如澳大利亚标准（2782-1985）、美国精油协会标准（EOA）和国际标准化组织标准（ISO4730-1996），均规定了互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）中松油醇-4（Terpinen-4-o1）含量较高（≥30%），1,8-桉叶素（1,8-Cineole）含量较低（≤15%）。2004年1月20日，广东省质量监督检验检疫局颁布了《互叶白千层精油松油醇-4 型（茶树油）》地方标准（DB44/T177-2003）；2010 年 4 月 22 日中国轻工业联合会提出，由中华人民共和国工业和信息化部发布了国家轻工行业标准《互叶白千层（精）油、4-松油烯醇型茶树油》标准（QB/T4002-2010）；2011年该标准上升为国家质量标准（GB/T26514-2011）。这些标准也规定了互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）中松油醇-4（Terpinen-4-o1）含量远高于1,8-桉叶素（1,8-Cineole）含量（表1）。

表1 国内外标准制定的茶树油主要成份标准

互叶白千层（Melaleuca alternifolia）分为松油醇-4型、1,8-桉叶素型和混合型三种，国内外主要是种植松油醇-4型互叶白千层（Melaleuca alternifolia）。从表1标准来看，互叶白千层（Melaleuca alternifolia）新鲜枝叶初蒸油，即初蒸的互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）中松油醇-4（Terpinen-4-o1）含量超过30%，1,8-桉叶素（1,8-Cineole）含量不超过15%（ISO4730-1996）。研究文献报道，国内引种的互叶白千层（Melaleucaalternifolia）也是如此（详见《西南林业大学学报》2019; 39(6):1-8）（图2）。

本发明人研究表明，互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）中松油醇-4（Terpinen-4-o1）和1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的功能是不同的，即互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）中1,8-桉叶素（1,8-Cineole）主要发挥杀菌抑菌，促进伤口愈合效果，而松油醇-4（Terpinen-4-o1）主要发挥透皮作用，发挥抗炎镇痛效果。因此，培育出高效合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的互叶白千层新植株，是低成本、绿色获得高品质的1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的关键。

本发明人发明了基因组定点编辑增强互叶白千层（Melaleuca alternifolia）合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole），即通过基因组定点编辑，改善互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase，MS）活性，提升了互叶白千层（Melaleuca alternifolia）生成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的能力，其新鲜枝叶用水蒸馏提取，得到纯天然植物精油，即互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）。该技术改良互叶白千层（Melaleuca alternifolia），获得了互叶白千层新植株，并在广西壮族自治区玉林市成功种植已超10年，其新鲜枝叶初蒸的互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）中1,8-桉叶素（1,8-Cineole）含量超过75%，松油醇-4含量（Terpinen-4-o1）低于8%；初蒸的互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）再用分子蒸馏分离提纯，可获得1,8-桉叶素（1,8-Cineole）纯品，纯度超95%。

互叶白千层（Melaleuca alternifolia）主要天然产物功效

本发明人研究表明，1,8-桉叶素（1,8-Cineole）和松油醇-4（Terpinen-4-o1）功效不同。对常见病原菌（如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、芽孢厌氧菌、肉毒杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌）研究显示，1,8-桉叶素（1,8-Cineole）杀菌抑菌，促进伤口愈合效果远强于松油醇-4（Terpinen-4-o1）。说明，互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）中1,8-桉叶素（1,8-Cineole）主要发挥杀菌抑菌、促进伤口愈合作用，而松油醇-4（Terpinen-4-o1）主要发挥透皮、抗炎镇痛作用。

桉叶素（1,8-Cineole）生物合成途径

通过对互叶白千层（Melaleuca alternifolia）1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的天然产物化学、生理学等研究，本发明人确定1,8-桉叶素（1,8-Cineole）在互叶白千层（Melaleucaalternifolia）中合成途径（图3），明确了互叶白千层（Melaleuca alternifolia）合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的关键点（图4）。

互叶白千层（Melaleuca alternifolia）合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的酶组学

本发明人研究了互叶白千层（Melaleuca alternifolia）合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）中相关酶组成、结构及作用规律，发现互叶白千层单萜合成酶（Monoterpenesynthase）是互叶白千层（Melaleuca alternifolia）合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的限速酶。

Antheprot 5.0软件分析表明，互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）分子式C₂₉₄₇H₄₆₃₅N₈₁₄O₈₇₁S₂₀，分子量66042.3Da，理论等电点5.623，正电荷氨基酸残基数目67，负电荷氨基酸残基数目81，蛋白质不稳定系数51.68，属于不稳定型蛋白质；该酶氨基酸序列有12个信号肽剪切位点（16、21、141、182、269、272、310、316、340、443和449aa）。

Swiss Model Server和VMD1.8.5软件分析显示，该酶经过多次折叠后，形成以α-螺旋为主，2个β-片层结构区的三维结构；同时，Arg297、Trp305、Asp333、Arg474等几个底物结合位点经过折叠后，构成了一个“口袋型”底物结合区，能够将底物包含进行催化（图5）。

互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）的基因组学

本发明人研究了互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）的基因组组成、组内各基因结构和相互关系。选取互叶白千层（Melaleuca alternifolia）嫩叶，提取总RNA，反转录成cDNA、5’-RACE cDNA和3’-RACE cDNA。

比对NCBI数据库中单萜合成酶（Monoterpene synthase）序列，设计引物。以嫩叶cDNA为模板，PCR扩增，产物回收、克隆和测序。5’-RACE和3’-RACE片段测序结果去除载体序列部分，与保守区部分片段拼接后，得到互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）的全长cDNA（图6）。

Vector NTI 11.0软件将互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）基因的开放阅读框（Open reading frame）翻译成蛋白质序列，发现其与其他不同来源单萜合成酶（Monoterpene synthase）同源性较高，单萜合成酶（Monoterpene synthase）氨基酸序列的N端和C端部分同源性缺乏明显，但中部序列相对保守，其中，Arg297、Trp305、Asp333、Asp337、Arg474、Leu475、Asn477、Asp478、Glu480、Tyr548等位置经过蛋白的空间折叠后，形成“口袋型”底物结合区，形成酶的催化功能（图7）。

互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）基因组定点编辑

利用CRISPR/Cas9技术，对基因特定部位切割后，将外源基因（互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）基因和特异启动子导入）导入到相应的基因中，获得重组互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）基因。

利用转基因技术（如农杆菌介导法），将重组互叶白千层单萜合成酶（Monoterpenesynthase）基因导入互叶白千层细胞，实现优良基因表达，增强互叶白千层（Melaleucaalternifolia）合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）能力。该细胞经组织培养，得到互叶白千层新植株。

互叶白千层新植株新鲜枝叶用水蒸馏提取，得到互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）；检测其1,8-桉叶素（1,8-Cineole）含量，筛选出高效合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的互叶白千层新植株。

互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）的检测

本发明人发明的技术培育的互叶白千层新植株，已在广西壮族自治区玉林市繁育种植了10年，其新鲜枝叶经水蒸馏，得到初蒸的互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil），用安捷伦气相色谱分析仪（型号：Intuvo 9000）检测，其1,8-桉叶素（1,8-Cineole）含量均高于75%，松油醇-4（Terpinen-4-o1）含量均低于8%（图8）。

该结果，本发明人通过华南理工大学钟振声教授课题组，也得到了证实（详见《中山大学学报 (自然科学版)》2012;51(5):7-13）。

开发1,8-桉叶素（1,8-Cineole）产品

本发明人发明了“基因组定点编辑强互叶白千层（Melaleuca alternifolia）合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）”技术，即通过基因组定点编辑，改善互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）活性，提升了互叶白千层（Melaleuca alternifolia）生成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的能力，获得了互叶白千层新植株。本发明人在广西玉林市繁育种植该新植株已超10年，其新鲜枝叶第一年可裁剪1次，以后每年裁剪2次，新鲜枝叶出油率为2~3%。

互叶白千层新植株新鲜枝叶用水蒸馏提取，得到初蒸的互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil），其1,8-桉叶素（1,8-Cineole）含量超过75%，松油醇-4（Terpinen-4-o1）含量低于8%；再用分子蒸馏分离提纯初蒸的互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil），可获得1,8-桉叶素（1,8-Cineole）纯品，纯度超95%。

1,8-桉叶素（1,8-Cineole）纯品具有广谱杀菌抑菌、促进伤口愈合的效果，且无毒性，安全性高，可开发成新药。另外，初蒸的互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）可开发出富含1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的化妆品，如100%茶树油、5%茶树油乳液、茶树油软膏、茶树油洗发剂等；1,8-桉叶素气味有较强的驱蚊性能，且滋润肌肤，安全无毒，可开发富含1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的日用品（图9）。

综上所述，本发明的创新之处在于全球首次成功改良了互叶白千层（Melaleucaalternifolia）合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的途径，即通过互叶千层（Melaleucaalternifolia）天然产物和生物合成途径分析，确定合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的限速酶，进行酶组学和基因组学研究，最后采用基因组定点编辑，培育出高效合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的互叶白千层新植株，其新鲜枝叶用水蒸馏提取，得到互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）。初蒸的互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）中1,8-桉叶素（1,8-Cineole）含量均超过75%，松油醇-4（Terpinen-4-o1）含量低于8%，可开发出系列富含1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的产品，包括互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）原料、化妆品、日用品、药品等（图10）。

附图说明

图1 松油醇-4（Terpinen-4-o1）和1,8-桉叶素（1,8-Cineole）化学结构。

图2国内引种的互叶白千层（Melaleuca alternifolia）单株三种主要天然产物分布。

图3互叶白千层（Melaleuca alternifolia）合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的途径。

图4 互叶白千层（Melaleuca alternifolia）合成1,8-桉叶素（1,8-Cineole）的关键点。

图5互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）α-螺旋、短螺旋、β-片层、转角、无规则卷曲的三维立体结构。

图6互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）基因序列、cDNA序列及编码蛋白质序列。

图7互叶白千层单萜合成酶（Monoterpene synthase）与不同植物单萜合成酶（Monoterpene synthase）的蛋白质序列比对。

图8初蒸的互叶白千层精油（茶树油，TeaTreeOil）气相色谱检测结果。

图9应用基因定点编辑改良互叶白千层（Melaleuca alternifolia）开发的产品。

图10 “基因组定点编辑增强互叶白千层合成1,8-桉叶素”发明的总结。