一种利普斯他汀发酵方法与发酵培养基
阅读说明：本技术 一种利普斯他汀发酵方法与发酵培养基 (Lipstatin fermentation method and fermentation medium ) 是由 郭霞凌 李辉 于 2021-03-19 设计创作，主要内容包括：为克服现有利普斯他汀发酵方法中发酵单位偏低、发酵原料成本高、工艺复杂难控、不适用于大规模工业化生产等问题,本发明提供了一种简便高效的利普斯他汀发酵方法与发酵培养基,包括以下步骤：平皿分离与斜面培养、菌种斜面摇瓶发酵筛选、摇瓶种子液制备、一级种子罐培养、二级种子罐培养和发酵罐培养。本发明通过摇瓶发酵筛选高产菌株、各级培养基优化以及发酵过程工艺改进等组合优化策略获得的利普斯他汀发酵方法与发酵培养基,具有发酵单位高、发酵原料成本低、发酵过程控制简单方便、无需添加外源毒性前体等优势,对于提高利普斯他汀发酵产量和产品质量、降低生产成本均具有十分重要的意义。(In order to overcome the problems of low fermentation unit, high cost of fermentation raw materials, complex and difficult control process, inapplicability to large-scale industrial production and the like in the existing lipstatin fermentation method, the invention provides a simple, convenient and efficient lipstatin fermentation method and a fermentation culture medium, which comprise the following steps: plate separation and slant culture, slant shake flask fermentation and screening of strains, shake flask seed liquid preparation, first-stage seeding tank culture, second-stage seeding tank culture and fermentation tank culture. The lipstatin fermentation method and the lipstatin fermentation medium obtained by the combined optimization strategies of screening high-yield strains through shake flask fermentation, optimizing culture mediums at all levels, improving fermentation process technology and the like have the advantages of high fermentation unit, low fermentation raw material cost, simple and convenient fermentation process control, no need of adding exogenous toxic precursors and the like, and have very important significance for improving the lipstatin fermentation yield and product quality and reducing the production cost.)
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利普斯他汀发酵方法与发酵培养基。
背景技术
利普斯他汀是由毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)产生的一种具有良好的抑制脂肪酶活性的天然产物，其氢化衍生物奥利司他是目前全球最畅销的减肥药物。奥利司他作为一种胃肠道脂肪酶抑制剂，通过与胃和小肠腔内的脂肪酶活性丝氨酸部位形成共价键结合，使脂肪酶失活从而不能将食物中的脂肪分解为可吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油，从而减少热量摄入，控制体重增加，达到控制体重、降糖、降压、调脂等目的。奥利司他是唯一通过美国FDA、欧洲EMA、中国NMPA同时批准治疗肥胖症的非处方药物，亦是目前唯一经NMPA批准在中国销售和使用的减肥药。
目前奥利司他的生产工艺技术路线有发酵半合成法和化学全合成法两种，化学全合成路线合成步骤长、反应操作较繁、反应条件苛刻、分离提纯收率低且对环境污染较大，不符合绿色化工低碳经济的发展趋势。目前工业上主要通过发酵半合成技术制备奥利司他，首先通过毒三素链霉菌发酵获得富含利普斯他汀的发酵液，然后经过分离纯化获得利普斯他汀，再经过一步加压氢化即可高效地得到目标成分奥利司他。虽然发酵半合成的奥利司他需要经过发酵、分离纯化、合成等几个环节，技术路线和过程参数控制比较复杂，但与化学全合成法相比，更加绿色环保、更加符合清洁生产要求。
自奥利司他作为一种减肥药物进入临床以来，以提高利普斯他汀发酵单位的生物合成机制解析、菌种遗传选育、发酵培养基筛选和发酵过程工艺优化工作一直属于生物发酵领域的研发热点，至今热度不退，发表了数量众多的论文。国内外有不少有关利普司他汀发酵生产的专利报道。美国专利US4598089,US2005089978A1采用了无补料分批发酵工艺，发酵单位最高只有1.7～1.8g/L。国际专利W02007134836A1和欧洲专利EP0803576采用了发酵过程中添加亚油酸、辛酸和亮氨酸等前体以促进利普斯他汀合成的补料分批发酵工艺，发酵单位最高3.0～3.2g/L。美国专利US20110014664A1采用了同时流加亚油酸和油酸的补料分批发酵工艺，并将二者在发酵液中的残留浓度控制在合适范围内，利普斯他汀发酵单位可提高至6g/L以上。中国专利CN103320481B采用了发酵过程添加亚油酸和亮氨酸前体，并结合溶氧控制调控菌株代谢，提高了利普斯他汀的产量，发酵单位可达7～8g/L。中国专利CN103555610A通过对发酵培养基配方配比进行组合优化，利普斯他汀发酵单位提高到约10g/L，但仅停留于摇瓶发酵阶段，未见进一步产业化应用报道。综上所述，目前发酵法生产利普斯他汀仍然面临以下问题：1)补料分批发酵过程涉及亚油酸、亮氨酸等前体，前体供应不足和前体不平衡问题是利普斯他汀高效生物合成的重要瓶颈，此外外源前体底物对菌体有毒害作用，发酵液中的前体残留浓度必须严格控制在适当范围，导致补料发酵工艺过程种的前体流加策略复杂难控；2)发酵过程中亚油酸、亮氨酸前体用量大、价格高，导致发酵原料成本居高不下；3)无补料分批发酵工艺单位产量低，无法进入大规模产业化应用；4)发酵单位有待继续突破和提高。
发明内容
本发明所解决的技术问题是针对现有利普斯他汀发酵方法中发酵单位低、发酵原料成本高、发酵工艺复杂难控、不适用于大规模工业化生产的问题，提供一种发酵单位高、发酵原料成本低、发酵过程控制简单方便、无需添加外源毒性前体的适用于工业化生产的利普斯他汀发酵方法和发酵培养基。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利普斯他汀发酵方法，包括以下步骤：
a.平皿分离与斜面培养：将利普斯他汀生产菌种孢子在平皿培养基中进行自然分离，培养10～14天；挑取分离较好、孢子丰满的单菌落接种至斜面培养基，培养7～9天，将生长良好的菌种斜面冷藏；
b.菌种斜面摇瓶发酵筛选：将上述菌种斜面接种至摇瓶种子培养基中培养25～35h；然后以5～10％的接种量接种至摇瓶发酵培养基中培养7～9天，发酵结束后利用HPLC测定效价，挑选出摇瓶效价≥8000μg/ml的菌种斜面继续冷藏，供发酵生产使用；
c.摇瓶种子液制备：将上述摇瓶效价≥8000μg/ml的菌种斜面接种至摇瓶种子培养基中，培养25～35h，得到摇瓶种子液；
d.一级种子罐培养：将上述摇瓶种子液按一级种子罐培养基体积的1～2‰接种至一级种子罐进行培养，罐压0.04～0.05MPa，控制溶解氧(DO)，使DO维持70～80％，培养周期20～30h；
e.二级种子罐培养：将培养好的一级种子罐培养液按二级种子罐培养基体积8～12％接种至二级种子罐进行培养，罐压0.04～0.05MPa，控制溶解氧(DO)，使DO维持40～60％，培养周期10～20h；
f.发酵罐培养：将培养好的二级种子培养液以8～12％的接种量移种至发酵罐培养基中进行发酵培养，罐压0.04～0.05MPa，通过交替调节搅拌转速75～150r/min与通气量0.8～1.6VVM分阶段偶联控制溶解氧，发酵周期7～9天，发酵单位为10000～13000ug/ml；
其中上述培养温度均为27～28℃。
可选的，所述步骤d中“控制溶解氧(DO)”包括：
通过交替调节搅拌转速200～350rpm与通气量1～2VVM偶联控制溶解氧，使DO维持70～80％。
可选的，所述步骤e中“控制溶解氧(DO)”包括：
通过交替调节搅拌转速90～150rpm与通气量0.8～1.6VVM偶联控制溶解氧，使DO维持40～60％。
可选的，所述步骤f中“通过交替调节搅拌转速75～150r/min与通气量0.8～1.6VVM分阶段偶联控制溶解氧”包括：
(1)发酵开始后至DO反弹前：发酵0～24h溶氧下降时先调转速再调风量，交替进行，风量每次上调0.15～0.2VVM，风量最高1.6VVM，转速每次上调2～4Hz，转速最高150r/min，控制DO≥30％；发酵24～32h：控制DO≥20％，DO低于10％时搅拌转速和空气流量保持最高不变，降温至26.5～27℃；
(2)DO反弹后至发酵结束：发酵至28～36h左右DO迅速回升至70～90％，pH紧跟回升，迅速降低风量和罐压、下调转速，控制DO在40～60％，此过程持续10～20h，控制pH不超过7.30；pH持续上升且高于7.30时，继续通过下调风量、转速和罐压继进一步低溶氧水平来控制pH，保证pH下降；DO反弹后10～20h至发酵中后期，pH趋于稳定且呈缓慢下降趋势，通过逐步交替增加风量和转速控制DO在20～30％，最高风量和最高转速不得高于DO反弹前风量和转速的最高值，控制pH在6.8～7.2之间平稳运行；
(3)发酵中后期DO出现掉零后启动补水，DO掉零后开始第一次补水，每隔24h补水一次，补水体积为发酵液体积的4～6％，发酵周期7～9天。
本发明还提供了一种适用于上述利普斯他汀发酵方法的培养基，所述培养基依次包括平皿与斜面培养基、摇瓶种子培养基、摇瓶发酵培养基、一级种子罐培养基、二级种子罐培养基和发酵罐培养基。
可选的，所述平皿与斜面培养基包括以下组分：葡萄糖3～5g/L、酵母抽提物3～5g/L、麦芽提取物8～12g/L、碳酸钙1～3g/L、琼脂粉18～20g/L；
所述平皿与斜面培养基灭菌前的pH为6.5～7.0。
可选的，所述摇瓶发酵培养基包括以下组分：甘油15～25g/L、低温豆粕粉35～45g/L、大豆油85～95g/L、粉末大豆磷脂8～10g/L；
所述摇瓶发酵培养基灭菌前的pH为7.0～7.5。
可选的，所述摇瓶种子培养基包括以下组分：甘油15～25g/L、低温豆粕粉15～25g/L、酵母抽提物4.0～6.0g/L；
所述摇瓶种子培养基灭菌前的pH为6.5～7.0。
可选的，所述一级种子罐培养基包括以下组分：甘油15～25g/L、低温豆粕粉15～25g/L、酵母抽提物4.0～6.0g/L、PPG2000聚丙二醇0.2～0.4g/L；
所述一级种子罐培养基灭菌前的pH为6.5～7.0。
可选的，所述二级种子罐培养基包括以下组分：甘油25～35g/L、低温豆粕粉25～35g/L、酵母抽提物4.0～6.0g/L、大豆油或葵花油10～20g/L；
所述二级种子罐培养基灭菌前的pH为6.5～7.0。
可选的，所述发酵罐培养基包括以下组分：甘油20～30g/L、大豆油或葵花油80～100g/L、浓缩大豆磷脂15～20g/L、分散剂Remuls2177 1.0～3.0g/L、低温豆粕粉30～40g/L、玉米麸质粉5～15g/L、七水硫酸锌0.1～0.2g/L；
所述发酵罐培养基灭菌前的pH为7.0～7.5。
与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明通过高产菌种的单菌落摇瓶发酵筛选、前体自供给与自平衡发酵培养基优化和发酵工艺优化等组合优化策略获得的利普斯他汀发酵方法与发酵培养基，无需额外添加价格昂贵的亚油酸和亮氨酸外源前体等繁琐操作，原材料消耗成本较前体流加发酵工艺可降低20％以上；同时也使得发酵过程控制方便简捷，发酵水平得到明显提高，可有效实现规模化生产；采用该培养基和发酵工艺发酵生产利普斯他汀，适用于单罐发酵规模在10m3以上，发酵单位可高达10～13g/L。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施方式和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式和实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的一实施方式公开了一种利普斯他汀发酵方法，包括以下步骤：
a.平皿分离与斜面培养：培养皿平板与试斜面培养基配制好后消毒备用，将液氮超低温保存的利普斯他汀生产菌种孢子甘油管用生理盐水进行梯度稀释后在平皿培养基中进行平皿分离，培养好后挑取分离较好、孢子丰满、色泽均匀的单菌落接种至斜面培养基上继续培养，将生长良好的菌种斜面冷藏备用。所述的平皿分离与斜面培养条件为：培养温度27～28℃，湿度40～60％，平皿分离培养周期10～14天，斜面培养周期7～9天，斜面冷藏温度4～8℃。
b.菌种斜面摇瓶发酵筛选：摇瓶种子培养基和摇瓶发酵培养基配制好后消毒备用，将步骤a中冷藏的菌种斜面接种至摇瓶种子培养基，培养好后按5～10％的接种量接种至摇瓶发酵培养基进行摇瓶发酵，发酵结束放瓶检测利普斯他汀效价，挑选出摇瓶效价≥8000g/ml的菌种斜面继续冷藏、供大规模发酵生产使用。所述的摇瓶种子培养条件为：培养温度27～28℃，摇床转速250～275r/min，振幅5±1cm，培养周期25～35h。所述的摇瓶发酵培养条件为：培养温度27～28℃，摇床转速250～275r/min，振幅5±1cm，培养周期7～9天。
c.摇瓶种子液制备：摇瓶种子培养基配制好后消毒备用，将步骤b中经过摇瓶发酵筛选效价≥8000μg/ml的菌种斜面接种至摇瓶种子培养基中培养，制备摇瓶种子液。所述的摇瓶种子培养条件为：培养温度27～28℃，摇床转速250～275r/min，振幅5±1cm，培养周期25～35h。
d.一级种子罐培养：在一级种子罐中将培养基灭菌后冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将步骤c中已经培养好的菌体浓度为20～30％、pH 6.0～7.0、无其他杂菌污染的摇瓶种子液接入一级种子罐中培养，接种量为一级种子罐培养基体积的1～2‰。所述一级种子罐培养条件为：培养罐体积100L，培养罐温27～28℃，罐压0.04～0.05MPa，通过交替调节搅拌转速200～350rpm与通气量1～2VVM偶联控制溶解氧，使DO维持70～80％，培养周期20～30h。
e.二级种子罐培养：在二级种子罐中将培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，将步骤d已经培养好的菌体浓度为20～25％、pH 6.0～7.0、无其它杂菌污染的一级种子罐培养液移入二级种子罐进行培养，接种量为二级种子培养基体积的8～12％。所述二级种子罐培养条件为：培养罐体积1000L，培养罐温27～28℃，罐压0.04～0.05MPa，通过交替调节搅拌转速90～150rpm与通气量1～2VVM偶联控制溶解氧，使DO维持40～60％，培养周期10～20h。
f.发酵罐培养：在发酵罐中将发酵培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，将已经培养好的菌体浓度25～35％、pH 6.0～6.5、无其它杂菌污染的二级种子培养液移入发酵中罐进行培养，接种量为发酵培养基体积的8～12％。所述发酵罐培养条件为：发酵罐体积10m3，培养罐温27～28℃，罐压0.04～0.05MPa，通过交替调节搅拌转速75～150r/min与通气量0.8～1.6VVM分阶段偶联控制溶解氧，发酵周期7～9天，发酵培养偶联控制溶解氧如下：
(1)发酵开始后至DO反弹前：分别调节初始温度27～28℃、空气流量0.8～0.9VVM，搅拌转速70～80r/min，罐压0.04～0.05Mpa，溶解氧校正至100％；发酵开始至24h，溶解氧下降时先调转速再调风量，交替进行，风量每次上调0.15～0.2VVM，风量最高1.6VVM，转速每次上调2～4HZ，转速最高150r/min，控制溶解氧大于30％；发酵24～32h：控制溶解氧≥20％，溶解氧低于10％时搅拌转速和空气流量保持最高不变，降温至26.5～27.0℃培养。
(2)DO反弹后至发酵结束：发酵至28～36h DO迅速回升至70～90％，pH紧随回升，迅速降低风量和罐压、下调转速，控制DO在40～60％(溶解氧对pH影响非常敏感，通过降低溶解氧来控制pH，溶氧降低后pH不会很快上升)，控制pH不超过7.30，此过程持续10～20h。若pH持续上升高于7.30时，继续通过调节风量、转速进一步降低溶氧以控制pH，保证pH下降。DO反弹后10～20h至发酵中后期，pH趋于稳定且呈缓慢下降趋势，通过逐步交替增加风量和转速控制溶氧控制在20～30％，最高风量和最高转速不得高于DO反弹前风量和转速的最高值，控制pH在6.8～7.2之间平稳运行。溶氧掉零后开始第一次补水，每隔24h补水一次，补水体积为发酵液体积的4～6％，发酵周期7～9天。
作为进一步优选的，在本发明的一实施方式中，所述步骤b包括以下步骤：摇瓶种子培养基和摇瓶发酵培养基配制好后消毒备用，将步骤a中冷藏的菌种斜面接种至摇瓶种子培养基，培养好后按5％的接种量接种至摇瓶发酵培养基进行摇瓶发酵，发酵结束放瓶检测利普斯他汀效价，挑选出摇瓶效价≥8000g/ml的菌种斜面继续冷藏、供大规模发酵生产使用。所述的摇瓶种子培养条件为：培养温度27～28℃，摇床转速250～275r/min，振幅5±1cm，培养周期25～35h。所述的摇瓶发酵培养条件为：培养温度27～28℃，摇床转速250～275r/min，振幅5±1cm，培养周期7～9天。
本发明的一实施方式中，所述发酵单位或摇瓶价效指的是发酵液中利普斯他汀的含量，对发酵单位或摇瓶价效的测定可采用本领域中常规的测定方法。
本发明的一实施方式中，所述溶解氧是指发酵过程中发酵液中的氧浓度与发酵初始时发酵液中的氧浓度的百分比值(即DO值)。对发酵液中溶解氧的测定可以使用本领域中常规的测定方法。
本发明的一实施方式中，在制备摇瓶种子液之前先进行菌种摇瓶发酵筛选，通过特定的培养条件进行摇瓶发酵，淘汰性状低劣，摇瓶价效低的菌种，仅挑选价效≥8000g/ml的菌种保留斜面冷藏备用、供后续大规模发酵生产使用，菌种的斜面摇瓶发酵筛选为利普斯他汀发酵单位的提高奠定了基础。
本发明的一实施方式中，在所述一级种子罐培养、二级种子罐培养以及发酵罐培养阶段均通过交替调节搅拌转速与通气量的方式偶联控制溶解氧。在毒三素链霉菌的发酵过程中，溶解氧是一个重要的指标，溶解氧过高不利于菌体生长，过量的氧易形成过氧化物、超氧化物等物质，破坏细胞组分，从而破坏菌体生长；溶解氧过低会由于供氧不足，导致微生物代谢缓慢，利普斯他汀合成速度缓慢。在不同的发酵阶段菌体对溶解氧的需求不同，本发明通过交替调节搅拌转速与通气量的方式分阶段偶联控制溶解氧，一方面提高利普斯他汀的发酵单位，另一方面无需采用补料方式，节约成本，同时可实现自动化大规模工业化生产。
本发明的一实施方式中，所述摇瓶发酵培养基包括以下组分：甘油15～25g/L、低温豆粕粉35～45g/L、大豆油85～95g/L、粉末大豆磷脂8～10g/L。
本发明的一实施方式中，所述摇瓶种子培养基包括以下组分：甘油15～25g/L、低温豆粕粉15～25g/L、酵母抽提物4.0～6.0g/L；
本发明的一实施方式中，所述一级种子罐培养基包括以下组分：甘油15～25g/L、低温豆粕粉15～25g/L、酵母抽提物4.0～6.0g/L、PPG2000聚丙二醇0.2～0.4g/L；
本发明的一实施方式中，所述二级种子罐培养基包括以下组分：甘油25～35g/L、低温豆粕粉25～35g/L、酵母抽提物4.0～6.0g/L、大豆油或葵花油10～20g/L；
本发明的一实施方式中，所述发酵罐培养基包括以下组分：甘油20～30g/L、大豆油或葵花油80～100g/L、浓缩大豆磷脂15～20g/L、分散剂Remuls21771.0～3.0g/L、低温豆粕粉30～40g/L、玉米麸质粉5～15g/L、七水硫酸锌0.1～0.2g/L
作为进一步优选地，所述低温豆粕粉符合《GB/T21494-2008低温食用豆粕》中质量指标和分级标准中二级以上要求；
所述大豆油符合《GB/T1535-2017大豆油》中成品大豆油质量指标中一级要求；
所述葵花油符合《GB/T1535-2017葵花籽油》中成品葵花籽油质量指标中一级要求；
所述浓缩大豆磷脂理化指标应符合《GB 28401-2012食品添加剂磷脂》中2.2条款中的质量规定；
所述分散剂为市售的上海骆骐化学科技有限公司生产的Remuls2177超级分散剂，由天然植源性油脂经特殊工艺和相关载体深加工而成，具有极其优良的乳化分散性能。
本发明的一实施方式中，利用单一大豆油或葵花油作为主要碳源和亚油酸前体来源，利用低温豆粕粉和玉米麸质粉作为主要氮源与亮氨酸前体来源，利用天然产物作为碳源和氮源，一方面符合环保卫生的要求，可实现绿色化生产，降低生产成本，另一方面避免了添加亚油酸和亮氨酸，简化发酵过程的操作工艺，适用于大规模工业化生产。
本发明的另一实施方式中，所述碳源还可以选自花生油、菜籽油、玉米油、棉籽油、亚麻油、红花籽油、棕榈油中的一种或几种。
本发明的另一实施方式中，所述氮源还可以选自高温豆粕粉、低温豆饼粉、高温豆饼粉、全脂豆粉、酵母粉中的一种或几种。
以下通过实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1
a.平皿分离与斜面培养：按如下比例配置孢子培养基：葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L，碳酸钙2g/L，琼脂粉18g/L，加碱调pH至6.75，115℃灭菌30min，制成平皿培养基和斜面培养基备用。将液氮超低温保藏的普斯他汀生产菌种孢子甘油管用无菌生理盐水梯度稀释后涂布于上述平皿培养基，在温度28℃，湿度40～50％条件下培养12天，挑取分离较好、孢子丰满、色泽均匀的单菌落接种至斜面培养基，继续培养8天；从上述生长成熟的试管斜面中挑选出斜面表面全部长满均匀一致、白色致密的菌层的斜面放入4℃冰箱保存。
b.菌种斜面摇瓶发酵筛选：按如下比例配置摇瓶种子培养基和发酵培养基进行摇瓶筛选，摇瓶种子培养基：低温豆粕粉20g/L，酵母提取物5g/L，甘油20g/L，加碱调pH值至6.80，500mL三角瓶每瓶装量为50mL；摇瓶发酵培养基：甘油20g/L，低温豆粕粉40g/L，大豆油70g/L，粉末大豆磷脂7g/L，加碱调pH值至7.25，500mL三角瓶每瓶装量为80mL。在无菌条件下将4℃冷藏的上述菌种斜面接种至种子瓶，斜面编号与种子瓶编号保持一一对应；将种子瓶置于27～28℃恒温振荡培养，摇床转速250r/min，培养30h后置于无菌条件下，每个种子瓶按5～10％的接种量转接至2个发酵瓶，将接好的发酵瓶置于27～28℃恒温振荡培养，摇床转速为275r/min，发酵瓶培养8天后放瓶检测利普斯他汀效价，挑选出摇瓶效价≥8000μg/ml的斜面置于4℃冰箱继续贮存、待用。
c.摇瓶种子液制备：按如下比例配置摇瓶种子培养基，低温豆粕粉20g/L，酵母提取物5g/L，甘油20g/L，加碱调pH值至6.75，500mL三角瓶每瓶装量为50mL。用生理盐水将上述步骤中筛选出的摇瓶效价≥8000ug/ml的菌种斜面制备成孢子悬液，接种到摇瓶种子培养基中,培养温度27～28℃，摇床转速250r/min，培养30h后得摇瓶种子液。
d.一级种子罐培养：采用100L罐进行一级种子罐培养，按如下比例配置种子罐所用液体培养基：低温豆粕粉20g/L，酵母提取物5g/L，甘油20g/L，PPG2000聚丙二醇0.3g/L，加碱调pH值至6.80，实消后体积75L，当温度降至28℃时，将100ml种子液以约1‰的比例接种到种子罐中培养，在温度28℃，罐压0.04MPa的条件下，通过交替调节搅拌转速200～350rpm与通气量1～2VVM偶联控制溶解氧，DO维持70～80％，培养26h后得一级种子罐培养液。
e.二级种子罐培养：采用1m3罐进行二级种子罐培养，按如下比例配置种子罐所用液体培养基：低温豆粕粉30g/L，酵母提取物5g/L，甘油30g/L，葵花油10g/L，加碱调pH值至6.80，实消后体积为0.75m3，当温度降至28℃时，将一级种子液全部移种至二级种子罐中培养，在温度为28℃，罐压0.04MPa的条件下，通过交替调节搅拌转速90～150rpm与通气量1～2VVM偶联控制溶解氧，DO维持40～60％，培养15h后得二级种子罐培养液。
f.发酵罐培养：采用10m3罐进行发酵培养，按如下比例配置发酵罐所用液体培养基：甘油25g/L，低温豆粕粉35g/L，玉米麸质粉10g/L，葵花油90g/L，浓缩大豆磷脂18g/L，分散剂Remuls2177 2g/L，七水硫酸锌0.15g/L，加碱调pH值至7.25，121℃灭菌40分钟。消后体积7.5m3，待培养基温度降至28℃时，将培养好的二级种子罐菌种接种到发酵罐中培养，接种量约10％，通过交替调节搅拌转速75～150r/min与通气量0.8～1.6VVM分阶段偶联控制溶解氧，包括如下步骤：
(1)发酵开始后至DO反弹前：分别调节初始温度28.0℃、空气流量0.8VVM，搅拌转速75r/min、罐压0.04Mpa，DO校正至100％；发酵0～24h，溶氧下降时先调转速再调风量，交替进行，风量每次上调0.15VVM，风量最高1.6VVM，转速每次上调3HZ，转速最高150r/min，控制DO≥30％；发酵24～32h：控制DO≥20％，搅拌转速和空气流量保持最高不变，DO低于10％时降温至27.0℃培养。
(2)DO反弹后至发酵结束：发酵至34h，DO反弹且在10min内迅速回升至85％，pH快速上升，快速降低风量和罐压、下调转速，控制DO在40～50％，此过程持续16h，最高pH值不超过7.25。DO反弹后16h，pH趋于稳定且缓慢下降，逐步交替增加风量和转速控制溶氧控制在20～30％，pH在7.0左右平稳运行。发酵至97h DO开始掉零，97h，121h和145h各补水一次，每次补水体积为发酵液体积的5％，发酵周期167h，放罐效价12968g/L。
实施例2
平皿分离与斜面培养、菌种斜面摇瓶发酵筛选、摇瓶种子培养、一级种子罐培养和二级种子罐培养的培养基和培养条件同实施例1，发酵罐培养基配方和溶氧反弹前培养条件同实施例1，溶氧DO反弹时间29h，反弹后按实施例1中的方法调节风量和转速控制溶氧，发酵至89h溶氧开始掉零，89h，113h和137h各补水一次，每次补水体积为发酵液体积的5％，发酵周期161h，放罐效价13570ug/ml。
实施例3
平皿分离与斜面培养、菌种斜面摇瓶发酵筛选、摇瓶种子培养、一级种子罐培养的培养基和培养条件同实施例1，二级种子罐和发酵罐培养过程中将培养基中的葵花油替换为等量的大豆油，二级种子罐培养条件同实施例1，发酵罐溶氧反弹前培养条件同实施例1，溶氧DO反弹时间32h，反弹后按实施例1中的方法调节风量和转速控制溶氧，发酵至116h溶氧开始掉零，116h，140h和164h各补水一次，每次补水体积为发酵液体积的5％，发酵周期187h放罐效价11890ug/ml。
实施例4
平皿分离与斜面培养、菌种斜面摇瓶发酵筛选、摇瓶种子培养、一级种子罐培养的培养基和培养条件同实施例1，二级种子罐和发酵罐培养过程中将培养基中的葵花油替换为等量的大豆油，二级种子罐培养条件同实施例1，发酵罐溶氧反弹前培养条件同实施例1，溶氧反弹时间28h，反弹后按实施例1中的方法调节风量和转速控制溶氧，发酵至120h溶氧开始掉零，120h，144h和168h各补水一次，补水体积为发酵液体积的5％，发酵周期190h，放罐效价12360ug/ml。
由上述实施例结果可以看出采用本发明的通过高产菌种单菌落摇瓶发酵筛选、各级培养基的优化和发酵工艺等组合优化策略，无需额外添加价格昂贵的亚油酸和亮氨酸外源前体等繁琐操作，同时也使得发酵过程控制方便简捷，发酵水平得到明显提高，可有效实现规模化生产，发酵单位可高达10～13g/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。