阅读说明：本技术 一种紫杉醇的制备方法 (Preparation method of paclitaxel ) 是由 林金新 颜武华 邓良斌 张珊珊 王一珏 杜小倩 于 2020-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物制备技术领域,具体涉及一种紫杉醇的制备方法；本发明中在制备紫杉醇的过程中,通过向培养基中的培养基中选用葡萄糖及乳糖作为碳源,也有效地提高了红豆杉形成层干细胞培养体系中紫杉醇的含量；再者,通过加入适量的绿原酸及水杨酸,两者之间的配合使用,能有效提高愈伤组织中紫杉醇的含量；其次,通过液体悬浮液培养基中加入的牛二醇和丙酮酸钠之间相互协同能有效地提高细胞中紫杉醇的含量；而甲基茉莉酮酸配合紫外光照的使用能显著促进刺激代谢产物的合成,有效地诱导紫杉醇含量的提高；而后依次对所得的紫杉醇浸膏进行第一洗脱、第二洗脱及多重结晶处理,最终使得所制备的紫杉醇的纯度得到极大地提高。(The invention relates to the technical field of medicine preparation, in particular to a preparation method of paclitaxel; in the process of preparing the taxol, the content of the taxol in a taxus cambium stem cell culture system is effectively improved by selecting glucose and lactose as carbon sources in a culture medium in the culture medium; furthermore, by adding a proper amount of chlorogenic acid and salicylic acid, the content of paclitaxel in the callus can be effectively increased by matching the chlorogenic acid and the salicylic acid; secondly, the content of the taxol in the cells can be effectively improved through mutual synergy between the bovine diol and the sodium pyruvate added into the liquid suspension culture medium; the methyl jasmonic acid can obviously promote the synthesis of the stimulated metabolite by matching with the use of ultraviolet light, and effectively induces the increase of the content of the taxol; and then sequentially carrying out first elution, second elution and multiple crystallization treatment on the obtained paclitaxel extract, so that the purity of the prepared paclitaxel is greatly improved.)

一种紫杉醇的制备方法

技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及一种紫杉醇的制备方法。

背景技术

紫杉醇是一种从裸子植物红豆杉的树皮分离提纯的天然次生代谢产物，经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇作为一个具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物，其新颖复杂的化学结构、广泛而显著的生物活性、全新独特的作用机制、奇缺的自然资源使其受到了植物学家、化学家、药理学家、分子生物学家的极大青睐，使其成为20世纪下半叶举世瞩目的抗癌明星和研究重点。

然而，现有技术中紫杉醇来源与从红豆杉的树皮中获取，含量非常低，提取困难，提取纯度也相对较低，根本无法满足人们对对高纯度紫杉醇日益增长的需求。因此，提高紫杉醇的纯度具有重要意义。

发明内容

针对背景技术中所提出的技术问题，本发明提供了一种紫杉醇的制备方法，本发明制备的紫杉醇不仅回收率较高，而且纯度较大；表明本发明所提供的紫杉醇制备工艺具有更广阔的市场前景，更适宜推广。

技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种紫杉醇的制备方法，包括以下步骤：

S1、选取长势良好的一年生云南红豆杉，采其成熟嫩叶作为培养基材，培养基材清洗干净后进行消毒处理，将变色的外植体切除，然后对其进行诱导培养，选取连续继代4～7次且长势良好的新鲜胚性愈伤组织接种至培养基中，并向培养基中加入0.1～0.13mg/L的绿原酸及0.1～0.15mg/L的水杨酸进行震荡培养，每隔8～10天继代一次，经2～3月继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；

S2、向上述培养基中加入红豆杉内生真菌提取液，混合均匀后将之置于生物反应器中，选取生长速率达8.0～10.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按12～15％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为22～25℃，人工光照条件下进行通气培养12d后，分别向液体悬浮培养基中加入0.25～0.32mg/L的牛二醇、0.2～0.3mg/L丙酮酸钠、8～12mg/L甲基茉莉酮酸和0.15～0.20mg/L赤霉素，并辅以紫外光照射继续培养；

S3、收集步骤S2中悬浮培养的培养物，并向其中添加缓冲溶液对其进行洗涤3～4次后冷冻干燥处理，得培养物冷冻干粉；然后向培养物冷冻干粉中添加适量的去离子水，在40～50℃的水浴环境中加热浸泡培养物冷冻干粉，经离心过滤处理后向所得滤渣中加水反复浸泡3～5次，然后合并滤液再用乙酸乙酯进行搅拌萃取并静置，待发生明显分层现象后收集无机相，所得无机相再用乙酸乙酯萃取3～4次；收集无机相并添加浓度为60～70%的乙醇溶液低温减压浓缩后得含紫杉醇的浸膏；

S4、称取步骤S3中所得的浸膏，并向浸膏中加入三氯甲烷使之完全溶解，然后向其中加入硅胶搅拌均匀，经凉干、过筛处理后填装到层析柱中，再用第一洗脱液进行洗脱，经TLC检测后分段合并浓缩，得紫杉醇粗产品，然后向紫杉醇粗产品中加入丙酮使之溶解完全，再加硅胶搅拌均匀；经凉干、过筛处理后填装到层析柱中，再用第二洗脱液梯度洗脱，再经TLC检测后分段合并浓缩；

S5、将上述所得浓缩物用混合溶剂结晶3～4次，抽滤后在45～55℃的条件下进行真空减压干燥，而后将干燥所得产物在14～18Mpa压力下层析分离，再TLC检测后分段合并浓缩，所得浓缩物再用混合溶剂进行再次结晶，最终再经抽滤、干燥处理后得紫杉醇成品。

更进一步地，所述步骤S1中消毒处理时选用浓度为65～75%的乙醇溶液消毒处理60～80s。

更进一步地，所述步骤S1中所用培养基的配制方法为:选择成熟且表面光滑的马铃薯,洗净去皮,然后称取180～220g切成薄片，放入锅中加水煮沸至一戳即破即可,再用4层纱布进行过滤，在滤液中加入13～18g琼脂粉、40～50g葡萄糖及35～50g的乳糖，煮沸使其充分溶解，然后加水定容到1000mL；而后于115～125℃的条件下进行高压灭菌30～35min，灭菌完成后即得培养基成品。

更进一步地，所述步骤S2中内生真菌提取液的制备方法为：向步骤S1中的培养基中接种红豆杉内生真菌，并在温度为25～30℃，转速为60～80r/min的摇床中震荡培养5～7d，然后对其超声波破碎5～8min后再向其中加入与培养基等体积的乙酸乙酯，待溶液产生明显分层现象后去掉水层，并对所得的萃取液进行减压干燥处理，然后向减压干燥后所得产物中添加0.25～0.32倍萃取液体积的去离子水，所得即为内生真菌提取液。

更进一步地，所述步骤S3中紫外光照射时光照时间为4～6h，光照强度为2000～2200lux。

更进一步地，所述步骤S3中缓冲溶液选用磷酸缓冲液，且所述磷酸缓冲液的浓度为100～120mM。

更进一步地，所述步骤S4中所用第一洗脱液为含10～20％三氯甲烷的甲醇。

更进一步地，所述步骤S4中所用第二洗脱液为含5～8％丙酮的石油醚。

更进一步地，所述步骤S5中所用混合溶剂由丙酮与石油醚按照体积比1：1.6～2.0混合而成。

有益效果

采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：

本发明中在制备紫杉醇的过程中，通过向培养基中的培养基中选用葡萄糖及乳糖作为碳源，所得发酵物几乎不分泌任何色素，保证了所得的愈伤组织的质量。同时也有效地提高了红豆杉形成层干细胞培养体系中紫杉醇的含量。再者，通过加入适量的绿原酸及水杨酸，两者之间的配合使用，能有效提高愈伤组织中紫杉醇的含量。其次，通过液体悬浮液培养基中加入的牛二醇和丙酮酸钠之间相互协同能有效地提高细胞中紫杉醇的含量。而甲基茉莉酮酸配合紫外光照的使用能显著促进刺激代谢产物的合成，有效地诱导紫杉醇含量的提高。而后依次对所得的紫杉醇浸膏进行第一洗脱、第二洗脱及多重结晶处理，最终使得所制备的紫杉醇的纯度得到极大地提高。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种紫杉醇的制备方法，包括以下步骤：

S1、选取长势良好的一年生云南红豆杉，采其成熟嫩叶作为培养基材，培养基材清洗干净后进行消毒处理，将变色的外植体切除，然后对其进行诱导培养，选取连续继代4次且长势良好的新鲜胚性愈伤组织接种至培养基中，并向培养基中加入0.1mg/L的绿原酸及0.1mg/L的水杨酸进行震荡培养，每隔8天继代一次，经2月继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；

S2、向上述培养基中加入红豆杉内生真菌提取液，混合均匀后将之置于生物反应器中，选取生长速率达8.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按12％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为22℃，人工光照条件下进行通气培养12d后，分别向液体悬浮培养基中加入0.25mg/L的牛二醇、0.2mg/L丙酮酸钠、8mg/L甲基茉莉酮酸和0.15mg/L赤霉素，并辅以紫外光照射继续培养；

S3、收集步骤S2中悬浮培养的培养物，并向其中添加缓冲溶液对其进行洗涤3次后冷冻干燥处理，得培养物冷冻干粉；然后向培养物冷冻干粉中添加适量的去离子水，在40℃的水浴环境中加热浸泡培养物冷冻干粉，经离心过滤处理后向所得滤渣中加水反复浸泡3次，然后合并滤液再用乙酸乙酯进行搅拌萃取并静置，待发生明显分层现象后收集无机相，所得无机相再用乙酸乙酯萃取3次；收集无机相并添加浓度为60%的乙醇溶液低温减压浓缩后得含紫杉醇的浸膏；

S4、称取283.5mg步骤S3中所得的浸膏400g，并向浸膏中加入三氯甲烷使之完全溶解，然后向其中加入硅胶搅拌均匀，经凉干、过筛处理后填装到层析柱中，再用第一洗脱液进行洗脱；得含紫杉醇的柱层析产物362.4mg，经TLC检测后含紫杉醇268.9mg，回收率为94.85%；分段合并浓缩，得紫杉醇粗产品，然后向紫杉醇粗产品中加入丙酮使之溶解完全，再加硅胶搅拌均匀；经凉干、过筛处理后填装到层析柱中，再用第二洗脱液梯度洗脱，得含紫杉醇的柱层析产物267.5mg，再经TLC检测后含紫杉醇259.3mg，回收率为96.43%，紫杉醇的纯度为96.93%；分段合并浓缩；

S5、将上述所得浓缩物用混合溶剂结晶3次，抽滤后在45℃的条件下进行真空减压干燥，而后将干燥所得产物在14Mpa压力下层析分离，再TLC检测后分段合并浓缩，所得浓缩物再用混合溶剂进行再次结晶，最终再经抽滤、干燥处理后得紫杉醇成品，用TLC检测紫杉醇纯度为99.67%。

步骤S1中消毒处理时选用浓度为65%的乙醇溶液消毒处理60s。

步骤S1中所用培养基的配制方法为:选择成熟且表面光滑的马铃薯,洗净去皮,然后称取180g切成薄片，放入锅中加水煮沸至一戳即破即可,再用4层纱布进行过滤，在滤液中加入13g琼脂粉、40g葡萄糖及35g的乳糖，煮沸使其充分溶解，然后加水定容到1000mL；而后于115℃的条件下进行高压灭菌30min，灭菌完成后即得培养基成品。

步骤S2中内生真菌提取液的制备方法为：向步骤S1中的培养基中接种红豆杉内生真菌，并在温度为25℃，转速为60r/min的摇床中震荡培养5d，然后对其超声波破碎5min后再向其中加入与培养基等体积的乙酸乙酯，待溶液产生明显分层现象后去掉水层，并对所得的萃取液进行减压干燥处理，然后向减压干燥后所得产物中添加0.25倍萃取液体积的去离子水，所得即为内生真菌提取液。

步骤S3中紫外光照射时光照时间为4h，光照强度为2000lux。

步骤S3中缓冲溶液选用磷酸缓冲液，且磷酸缓冲液的浓度为100mM。

步骤S4中所用第一洗脱液为含10％三氯甲烷的甲醇。

步骤S4中所用第二洗脱液为含5％丙酮的石油醚。

步骤S5中所用混合溶剂由丙酮与石油醚按照体积比1：1.6混合而成。

实施例2

一种紫杉醇的制备方法，包括以下步骤：

S1、选取长势良好的一年生云南红豆杉，采其成熟嫩叶作为培养基材，培养基材清洗干净后进行消毒处理，将变色的外植体切除，然后对其进行诱导培养，选取连续继代5次且长势良好的新鲜胚性愈伤组织接种至培养基中，并向培养基中加入0.12mg/L的绿原酸及0.13mg/L的水杨酸进行震荡培养，每隔9天继代一次，经2月继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；

S2、向上述培养基中加入红豆杉内生真菌提取液，混合均匀后将之置于生物反应器中，选取生长速率达9.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按13％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为23℃，人工光照条件下进行通气培养12d后，分别向液体悬浮培养基中加入0.30mg/L的牛二醇、0.25mg/L丙酮酸钠、10mg/L甲基茉莉酮酸和0.18mg/L赤霉素，并辅以紫外光照射继续培养；

S3、收集步骤S2中悬浮培养的培养物，并向其中添加缓冲溶液对其进行洗涤3次后冷冻干燥处理，得培养物冷冻干粉；然后向培养物冷冻干粉中添加适量的去离子水，在45℃的水浴环境中加热浸泡培养物冷冻干粉，经离心过滤处理后向所得滤渣中加水反复浸泡4次，然后合并滤液再用乙酸乙酯进行搅拌萃取并静置，待发生明显分层现象后收集无机相，所得无机相再用乙酸乙酯萃取3次；收集无机相并添加浓度为65%的乙醇溶液低温减压浓缩后得含紫杉醇的浸膏；

S4、称取含281.7mg步骤S3中所得的浸膏400g，并向浸膏中加入三氯甲烷使之完全溶解，然后向其中加入硅胶搅拌均匀，经凉干、过筛处理后填装到层析柱中，再用第一洗脱液进行洗脱，得含紫杉醇的柱层析产物372.3mg，经TLC检测后含紫杉醇274.5mg，回收率为97.44%；分段合并浓缩，得紫杉醇粗产品，然后向紫杉醇粗产品中加入丙酮使之溶解完全，再加硅胶搅拌均匀；经凉干、过筛处理后填装到层析柱中，再用第二洗脱液梯度洗脱，得含紫杉醇的柱层析产物268.2mg，再经TLC检测后含紫杉醇262.5mg，回收率为95.63%，紫杉醇的纯度为97.87%；分段合并浓缩；

S5、将上述所得浓缩物用混合溶剂结晶3次，抽滤后在50℃的条件下进行真空减压干燥，而后将干燥所得产物在16Mpa压力下层析分离，再TLC检测后分段合并浓缩，所得浓缩物再用混合溶剂进行再次结晶，最终再经抽滤、干燥处理后得紫杉醇成品，用TLC检测紫杉醇纯度为99.78%。

步骤S1中消毒处理时选用浓度为70%的乙醇溶液消毒处理70s。

步骤S1中所用培养基的配制方法为:选择成熟且表面光滑的马铃薯,洗净去皮,然后称取200g切成薄片，放入锅中加水煮沸至一戳即破即可,再用4层纱布进行过滤，在滤液中加入15g琼脂粉、45g葡萄糖及40g的乳糖，煮沸使其充分溶解，然后加水定容到1000mL；而后于120℃的条件下进行高压灭菌30min，灭菌完成后即得培养基成品。

步骤S2中内生真菌提取液的制备方法为：向步骤S1中的培养基中接种红豆杉内生真菌，并在温度为28℃，转速为70r/min的摇床中震荡培养6d，然后对其超声波破碎6min后再向其中加入与培养基等体积的乙酸乙酯，待溶液产生明显分层现象后去掉水层，并对所得的萃取液进行减压干燥处理，然后向减压干燥后所得产物中添加0.3倍萃取液体积的去离子水，所得即为内生真菌提取液。

步骤S3中紫外光照射时光照时间为5h，光照强度为2100lux。

步骤S3中缓冲溶液选用磷酸缓冲液，且磷酸缓冲液的浓度为110mM。

步骤S4中所用第一洗脱液为含15％三氯甲烷的甲醇。

步骤S4中所用第二洗脱液为含6％丙酮的石油醚。

步骤S5中所用混合溶剂由丙酮与石油醚按照体积比1：1.8混合而成。

实施例3

一种紫杉醇的制备方法，包括以下步骤：

S1、选取长势良好的一年生云南红豆杉，采其成熟嫩叶作为培养基材，培养基材清洗干净后进行消毒处理，将变色的外植体切除，然后对其进行诱导培养，选取连续继代7次且长势良好的新鲜胚性愈伤组织接种至培养基中，并向培养基中加入0.13mg/L的绿原酸及0.15mg/L的水杨酸进行震荡培养，每隔10天继代一次，经3月继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；

S2、向上述培养基中加入红豆杉内生真菌提取液，混合均匀后将之置于生物反应器中，选取生长速率达10.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按15％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为25℃，人工光照条件下进行通气培养12d后，分别向液体悬浮培养基中加入0.32mg/L的牛二醇、0.3mg/L丙酮酸钠、12mg/L甲基茉莉酮酸和0.20mg/L赤霉素，并辅以紫外光照射继续培养；

S3、收集步骤S2中悬浮培养的培养物，并向其中添加缓冲溶液对其进行洗涤4次后冷冻干燥处理，得培养物冷冻干粉；然后向培养物冷冻干粉中添加适量的去离子水，在50℃的水浴环境中加热浸泡培养物冷冻干粉，经离心过滤处理后向所得滤渣中加水反复浸泡5次，然后合并滤液再用乙酸乙酯进行搅拌萃取并静置，待发生明显分层现象后收集无机相，所得无机相再用乙酸乙酯萃取4次；收集无机相并添加浓度为70%的乙醇溶液低温减压浓缩后得含紫杉醇的浸膏；

S4、称取含285.6mg步骤S3中所得的浸膏400g，并向浸膏中加入三氯甲烷使之完全溶解，然后向其中加入硅胶搅拌均匀，经凉干、过筛处理后填装到层析柱中，再用第一洗脱液进行洗脱，得含紫杉醇的柱层析产物375.7mg，经TLC检测后含紫杉醇272.4mg，回收率为95.38%；分段合并浓缩，得紫杉醇粗产品，然后向紫杉醇粗产品中加入丙酮使之溶解完全，再加硅胶搅拌均匀；经凉干、过筛处理后填装到层析柱中，再用第二洗脱液梯度洗脱，得含紫杉醇的柱层析产物266.8mg，再经TLC检测后含紫杉醇262.3mg，回收率为96.29%，紫杉醇的纯度为98.31%；分段合并浓缩；

S5、将上述所得浓缩物用混合溶剂结晶4次，抽滤后在55℃的条件下进行真空减压干燥，而后将干燥所得产物在18Mpa压力下层析分离，再TLC检测后分段合并浓缩，所得浓缩物再用混合溶剂进行再次结晶，最终再经抽滤、干燥处理后得紫杉醇成品，用TLC检测紫杉醇纯度为99.82%。

步骤S1中消毒处理时选用浓度为75%的乙醇溶液消毒处理80s。

步骤S1中所用培养基的配制方法为:选择成熟且表面光滑的马铃薯,洗净去皮,然后称取220g切成薄片，放入锅中加水煮沸至一戳即破即可,再用4层纱布进行过滤，在滤液中加入18g琼脂粉、50g葡萄糖及50g的乳糖，煮沸使其充分溶解，然后加水定容到1000mL；而后于125℃的条件下进行高压灭菌35min，灭菌完成后即得培养基成品。

步骤S2中内生真菌提取液的制备方法为：向步骤S1中的培养基中接种红豆杉内生真菌，并在温度为30℃，转速为80r/min的摇床中震荡培养7d，然后对其超声波破碎8min后再向其中加入与培养基等体积的乙酸乙酯，待溶液产生明显分层现象后去掉水层，并对所得的萃取液进行减压干燥处理，然后向减压干燥后所得产物中添加0.32倍萃取液体积的去离子水，所得即为内生真菌提取液。

步骤S3中紫外光照射时光照时间为6h，光照强度为2200lux。

步骤S3中缓冲溶液选用磷酸缓冲液，且磷酸缓冲液的浓度为120mM。

步骤S4中所用第一洗脱液为含20％三氯甲烷的甲醇。

步骤S4中所用第二洗脱液为含8％丙酮的石油醚。

步骤S5中所用混合溶剂由丙酮与石油醚按照体积比1：2.0混合而成。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。