红豆杉内生真菌突变体发酵产紫杉醇的工业化制备工艺
阅读说明：本技术 红豆杉内生真菌突变体发酵产紫杉醇的工业化制备工艺 (Industrial preparation process for producing taxol by fermenting taxus chinensis endophytic fungi mutant ) 是由 陈开云 柏凤静 于 2021-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种红豆杉内生真菌发酵产紫杉醇的工业化制备方法,该方法从红豆杉果实中分离一株木霉HQ-24菌株,以该菌株为出发菌株,经诱变、试管斜面培养、种子培养、发酵培养、膜过滤、膜浓缩、萃取分离、大孔树脂纯化、重结晶等技术及超临界CO-(2)流体干燥技术和全自动控制技术相结合,在多者的协同作用下进行红豆杉内生真菌发酵产紫杉醇化合物,实现了紫杉醇化合物非化学合成、非红豆杉提取的生物合成；利用本发明技术生产紫杉醇化合物,反应条件温和、操作相对简单、产品成本低、收率高、纯度高、残溶低、能耗低、产能大、环境污染小,适宜工业化规模生产,具有良好的经济效益和应用前景。(The inventionAn industrial process for preparing taxol from the endophytic fungus of yew includes such steps as separating the HQ-24 strain from the fruit of yew, mutagenesis, slant culture in test tube, seed culture, fermentation culture, membrane filtering, membrane concentration, extraction separation, macroporous resin purification, and recrystallizing 2 Combining a fluid drying technology and a full-automatic control technology, and carrying out fermentation of the taxus chinensis endophytic fungi under the synergistic effect of the fluid drying technology and the full-automatic control technology to produce the taxol compound, thereby realizing non-chemical synthesis of the taxol compound and non-biological synthesis of taxus chinensis extraction; the paclitaxel compound produced by the technology has the advantages of mild reaction conditions, relatively simple operation, low product cost, high yield, high purity, low residual solvent, low energy consumption, high productivity and small environmental pollution, is suitable for industrial mass production, and has good economic benefit and application prospect.)
技术领域
本发明属于生物代谢合成和纯化技术领域，具体涉及一种红豆杉内生真菌突变体发酵产紫杉醇的工业化制备工艺。
背景技术
紫杉醇(Paclitaxel，注册名Taxol)是一种二萜类衍生物，是具有独特抗白血症和抗癌机制的具有紫杉烷环状结构的天然产物，最早从红豆杉属植物中分离出来。紫杉醇为白色结晶粉末，不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，由113个原子组成的三环二萜类化合物，分子式 C47H51NO14，相对分子量853.92，熔点213-216℃。
紫杉醇是临床应用的重要抗癌药物，紫杉烷是紫杉醇的代谢前体或支路代谢产物，有些紫杉烷具有特殊的生理活性。紫杉醇及紫杉烷的产量低一直是制约其应用的主要瓶颈，如何扩大药源是一直以来面临的难题。已经开发出一些生产紫杉醇及紫杉烷的技术，其中植物细胞工程方法因为不占用耕地，环境友好，可调控，符合可持续发展战略而受到普遍的重视。
1963年，Wall[1]发现短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮提取物具有抗肿瘤活性。1967年，Wall和Wani分离出紫杉醇(paclitaxel)，1971年，通过X射线衍射和核磁技术解析了紫杉醇的结构。1979年，Horwitz揭示了紫杉醇抗肿瘤的机制：它可以稳定微管的聚集并防止微管正常的生理解聚，对于增殖速度极快的肿瘤细胞，它可“冻结”有丝分裂的纺锤体，从而使肿瘤细胞分裂停止在G2和M，直到死亡。紫杉醇是发现的第一个促进微管聚合的药物。1984年和1985年分别进行了紫杉醇的一期和二期临床试验。在1989年和1991年，分别发现了紫杉醇抑制卵巢癌和乳腺癌的显著活性。美国食品药品管理局(FDI)在1992年和1994年批准紫杉醇为治疗卵巢癌和乳腺癌的临床药物。1993年，百时美施贵宝公司(Bristol-Myers SquibbCompany)以为商标将紫杉醇投入市场。2000年，销售额已达16 亿美元。现在，紫杉醇和其半合成衍生物多烯紫杉醇docetaxe(l紫杉替尔，Taxotere)已经成为临床治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌的一线药物。此外，紫杉醇及多烯紫杉醇还用于治疗肺癌、卡波西肉瘤、结肠癌、黑素瘤以及淋巴瘤。紫杉醇作为红豆杉科红豆杉属植物的主要次生代谢产物，主要存在于树皮及针叶中。化学结构分为2个部分：基本骨架为一个紫杉烷(taxane)类的三环二萜，侧链包括3个芳香环(1个苯环，2个苯甲酰环)和1个环氧丙烷环(D环)，合起来有7个环，其核心为四环二萜。
紫杉醇最初从短叶红豆杉树皮中提取，含量仅有万分之几，1kg紫杉醇需要2000～3000棵短叶红豆杉的树皮或10余吨枝叶。紫杉醇供给问题引起了广泛关注，资源不足成为制约紫杉醇临床应用的主要因素。尽管Holton和 Nicolaou研究小组在1994年分别独立全合成了紫杉醇，之后又有许多不同途径成功合成了紫杉醇，但都因步骤繁琐，产率低而无法工业化。美国国立癌症研究所(NCI)授权百时美施贵宝公司解决药源问题，开发的药源有：由红豆杉可再生的枝叶中提取；由提取的紫杉烯半合成紫杉醇；由植物组织培养获得。一个重大突破是Potier发现浆果红豆杉(Taxus baccata)针叶中含有10-去乙酰基巴卡亭III10-deacetylbaccatin III，10-DAB)和巴卡亭III(baccatin III)。 Holton的研究团队由10-去乙酰基巴卡亭II(I在各种红豆杉植物中均含有，由可再生的枝叶中提取)开始，经过4步反应，合成紫杉醇，由此向临床供给了大量紫杉醇。紫杉醇的销售额由1994年的4亿美元增长为2000年的16亿美元。目前市售的紫杉醇按原料来源不同分为2类：一类是直接从红豆杉植物中提取；另一类为半合成紫杉醇，即从红豆杉嫩枝条或树叶等可再生资源中提取10-去乙酰巴卡亭III，或用提取紫杉醇过程中的副产物如7-木糖、10-去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱等为原料经化学半合成生产紫杉醇或多烯紫杉醇。但半合成方法有环境污染问题，由原植物中提取加工通常以理化方法为主，该方法破坏资源、不利于环境的可持续发展。虽然1993年Stierle等报道在真菌 Taxomyces andreanae中发现紫杉醇，为紫杉醇的供给开辟了新的途径，但紫杉醇在真菌中产量太低(25～50ng/L)，需要改良菌种大幅度提高产量才有商业化的可能。相比之下，利用植物细胞和组织培养技术进行紫杉醇及紫杉烷的生产具有无可比拟的优势。
植物内生真菌是指生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织或器官内部,但对植物没有引起明显病害症状的微生物。内生菌侵入宿主植物体内, 长期生活在植物细胞内或细胞间隙的特殊环境中,与宿主植物协同进化,形成一种互利共生的稳定的生态关系。1993年Strobel小组首次从短叶红豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)中分离到一株合成紫杉醇的内生真菌,证明内生菌具有合成与宿主植物相同或相似活性成分的功能。这一发现搅起了从药用植物中分离内生菌的研究热潮,之后研究者们先后从红豆杉植物中分离了多种内生菌,人工培养后在培养物中发现与宿主植物相同或相似的活性成分紫杉醇的红豆杉内生真菌。
专利号：2014102694407《一种利用红豆杉种子内生菌产紫杉醇的方法》，该发明以红豆杉种子为外植体，经灭菌、接种、二次灭菌、接种，诱导产生红豆杉种子内生菌，再培养红豆杉种子内生菌产生紫杉醇，其平均含量为 0.55mg/L，紫杉醇收率远低于专利号：2017103468093，生产成本仍高于从植物红豆杉提取，因此，该专利号技术仍不具备工业化生产紫杉醇的条件。
专利号：2017103468093《一种产紫杉醇的青霉BP6T3及其应用》，该发明公开了一株从红豆杉科巴山榧树的组织中分离筛选出的产紫杉醇的内生菌，经过分类鉴定命名为青霉(Penicillium sp.)BP6T3，保藏编号为CCTCC NO:M2016320。该菌株具有抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性，发酵液中脂溶性提取物含量可达105mg/L，其中紫杉醇的相对百分含量为15.8％，产量为16.59 mg/L，高于现有技术已公开的产量；以L-苯丙氨酸为前体，紫杉醇的产量可增长425.17％。但是，其紫杉醇产量仅为16.59mg/L，生产成本远高于从植物红豆杉提取的紫杉醇，因此，该专利号技术仍不具备工业化生产紫杉醇的条件。
以上两个专利技术利用红豆杉内生真菌发酵产紫杉醇，虽然利用红豆杉植物内生真菌发酵产出了紫杉醇，反应条件温和、污染小,操作相对简单，但是，紫杉醇化合物的产率非常低,因此，仍不具有工业化应用前景。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种红豆杉内生真菌突变体发酵产紫杉醇的工业化制备工艺，该红豆杉内生真菌突变体发酵产紫杉醇的工业化制备工艺可以很好地解决上述问题。
为达到上述要求，本发明采取的技术方案是：提供一种红豆杉内生真菌突变体发酵产紫杉醇的工业化制备工艺，该红豆杉内生真菌突变体发酵产紫杉醇的工业化制备工艺包括以下步骤：
S1：采用常规组织分离法，将新鲜的云南地区红豆杉果实切成0.5～1cm2小块。把果实浸泡于75％酒精5min左右，用无菌水冲洗3～4次，再用2.5％次氯酸钠浸泡3min；使切割处接触培养基植于其上，采用组织印迹法作对照来检验表面消毒是否彻底；
S2：将培养基置于28℃恒温培养箱中培养。定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的固体培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；
S3：菌悬液的制备：取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液。采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为106个/ml；
S4：紫外线诱变：取上制备好的单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中。 15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波。将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上, 离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波。上在红光背景下操作,避免光修复。经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内, 浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复。根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；
S5：紫外线结合亚硝酸的复合诱变：按照上述方法制备约106/ml个的孢子悬液，按照上述的方法先进行紫外线诱变后,吸取1mL诱变后的孢子悬液置于大试管中,加入PH4.5的醋酸缓冲液2mL及0.1mol/L的亚硝酸钠溶液1mL(最后处理浓度为0.025mol/L)，于25～26℃保温10～25min,加入0.07mol/L、PH8.6 的磷酸氢二钠溶液20ml,使PH下降至6.8左右，以终止反应,适当稀释后涂平板, 挑取菌落进行摇床发酵,同紫外线诱变先用后用评价；
S6：取大小一致的试管,分别装入定量的培养基,制备基本一致的斜面备用。挑取己活化的菌株划线接种至培养基斜面上。将这些斜面置于28℃恒温箱中培养9天；
S7：液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH 7。起始PH值为5.0。共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；
S8：将培养的试管斜面菌种挑取转接入装有摇瓶培养基的250ml 三角瓶中,置于28℃、120转/分钟摇床培养24小时；
S9：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
S10：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1％，发酵温度26℃，罐压0.10Mpa，pH 为7.2条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量0.036m3/min， 9h以后，种子罐转速180r/min、通气量0.043m3/min，发酵培养后收集种子液；
S11：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L 二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥ 30min；
S12：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到28℃时，将发酵18h的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～2％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa， pH为7.4条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量1.2m3/min， 9h以后，种子罐转速150r/min、通气量1.5m3/min，发酵培养后收集种子液；
S13：分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；
S14：将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
S15：单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度26℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养240h，搅拌转速130r/min、通气量0.5～0.8vvm/min，16h以后，发酵罐转速150r/min、通气量1vvm/min；
S16：发酵期内应根据培养基量标准实时补足培养基；当培养基补足后且发酵时间达标后，发酵结束，制得内生真菌、菌丝体与紫杉醇混合液；
S17：将制得的内生真菌、菌丝体与紫杉醇混合液泵入1～2号40000L发酵液暂存罐内；
S18：将制得的发酵液泵入粗滤设备过滤后，再用膜微滤机组进行微滤，滤除内生真菌、菌丝体，制得紫杉醇混合粗液；
S19：将过滤后的内生真菌、菌丝体用自动刮刀离心机离心脱溶，制得内生真菌、菌丝体等废弃物；
S20：将制得的紫杉醇混合粗液泵入膜超滤浓缩机组进行浓缩，制得紫杉醇混合浓液和废水；
S21：将制得紫杉醇混合浓液泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得紫杉醇粗品滤饼A；
S22：将制得紫杉醇粗品滤饼B，送入送入1号萃取釜，用浸膏重量3倍的亲脂溶剂加浸膏重量0.1～0.3倍重量的脱色剂萃取脱色1～3次，萃取液经过滤，制得紫杉醇滤液；
S23:将紫杉醇滤液，泵入浓缩机组进行浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
S24:将紫杉醇浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼B；
S25：将制得紫杉醇粗品浸膏，送入2号萃取釜，用浸膏重量3倍的亲脂溶剂萃取3次，萃取液经过滤、合并萃取液，制得紫杉醇萃取液；
S26：将紫杉醇萃取液，泵入浓缩机组进行浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
S27：将紫杉醇粗品浓缩液泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼C；
S28：将紫杉醇粗品滤饼C与结晶母液浸膏合并，装入上柱液配制罐内，用乙醇溶解制作上柱液；
S29：将制得的上柱液送入大孔树脂柱吸附；用去离子水、溶剂洗脱，收集洗脱液；将洗脱液再作为上柱液进行二次大孔树脂吸附、用乙醇洗脱、收集上柱吸附流出液和洗脱液；
S30：将上柱吸附流出液和梯度洗脱液，分别泵入浓缩机组浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓液；
S31：将制得的紫杉醇粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼；
S32：将制得的紫杉醇粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体、浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、离心脱溶、制得紫杉醇粗晶和母液浸膏；
S33：将制得的紫杉醇粗晶，送入8000L的1号或2号结晶釜内，用溶剂溶解后在低温下重结晶，过滤晶体、浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、离心脱溶、制得紫杉醇湿态晶和母液浸膏；
S34：将母液浸膏送入步骤S28与紫杉醇粗品滤饼合并制作上柱液；
S35：将制得的紫杉醇湿态晶体送入超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％紫杉醇晶体粉末；
S36：将制得的≥98％紫杉醇晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％紫杉醇晶体粉末产品。
综上所述，一种红豆杉内生真菌发酵产紫杉醇的工业化制备方法具有的优点如下：
1)本发明生产的紫杉醇，采用了非红豆杉提取工艺和非化学合成工艺，为紫杉醇工业化生产开辟了一条全新的工艺路线。
2)本发明生产紫杉醇的工艺，由于不从红豆杉树皮、枝叶中提取紫杉醇节约了大量资源，解决了紫杉醇提取原料不足的难题；也解决了红豆杉保护的难题。
3)本发明生产紫杉醇的工艺，生产成本不足从红豆杉树皮、枝叶中提取纯化紫杉醇单位成本的二分之一，所以产品成本低。
4)本发明设计了8套全自动控制的一级种子发酵罐、8套全自动控制的二级种子发酵罐、3套全自动控制的培养基配制罐、2套全自动控制的培养基补料罐和6套全自动控制的工艺发酵罐以满足循环生产需要，单台工业发酵罐对应相应的单台二级种子发酵罐，单台二级种子发酵罐对应相应的单台一级种子发酵罐，8套发酵系统连续循环发酵。所以，利用本方法生产紫杉醇具有产能大、连续化生产的优点。
5)在本发明制备紫杉醇的方法中，采用现代化的全自动控制技术对培养基配制、培养基充装量、温度控制、通风量控制、发酵时间控制、各罐自动清洗、自动控制灭菌等，保证了产品质量、提高了产品收率、优化节约了能耗、节约了大量的劳动力。
6)本发明在制备紫杉醇发酵液工艺中，木霉HQ-24菌株利用紫外线照射菌株诱变、在悬浮液培养基中添加诱导子和在培养基中添加L-苯丙氨酸、花生四烯酸等前体物质，获得更高产的红豆杉内生真菌产紫杉醇，发酵液中紫杉醇产率达到了134mg/L以上。是同类专利技术红豆杉内生真菌产紫杉醇的7～230倍。
7)本发明采用膜分离和膜浓缩装置，除产生部分固体废物外，其排放的污水可用于植物灌溉，避免了大量的污染水排放，减少了环境污染。
8)本发明采用MVR蒸发器或全电蒸发器真空浓缩或膜浓缩、自动刮刀离心机脱溶、回收溶剂，提高了溶剂回收率，溶剂回收率达到90％以上，且大大地降低了产品能耗及空气的污染。
9)本发明采用集中联动控制动力、蒸汽、冷却水、无菌空气供应，利用自动控制技术依据8条发酵生产系统循环发酵的时间差，自动控制分配动力、蒸汽、冷却水、无菌空气使用时间和供应量，提高了设备的利用率，既减少了设备购置费用，又降低了设备能耗。
10)本发明将紫杉醇结晶步骤产生的结晶母液浸膏，送入上柱液配制罐与紫杉醇粗品滤饼合并后制作上柱液，将结晶母液浸膏中较高的紫杉醇，重新用大孔树脂吸附、洗脱和重结晶，增加了98％以上紫杉醇产量。
11)本发明制备紫杉醇化合物，采用超临界CO2流体装置同时进行干燥、脱残溶和灭菌，产品溶剂残留低、色泽均匀，且卫生指标符合相关标准。
12)本发明从红豆杉果实中分离一株木霉HQ-24菌株，以该菌株为出发菌株，经诱变、试管斜面培养、种子培养、发酵培养、膜过滤、膜浓缩、萃取脱色、萃取分离、大孔树脂纯化、重结晶等技术及超临界CO2流体干燥技术和全自动控制技术相结合，在多者的协同作用下进行红豆杉内生真菌发酵产紫杉醇化合物，实现了紫杉醇化合物非化学合成、非红豆杉植物提取的生物合成；利用本发明技术生产紫杉醇化合物，反应条件温和、操作相对简单、收率高、纯度高、成本低、残溶低、能耗低、产能大、环境污染小，特别适宜工业化规模生产，具有良好的经济效益和应用前景。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例，对本申请作进一步地详细说明。
在以下描述中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”、“示例”等等的引用表明如此描述的实施例或示例可以包括特定特征、结构、特性、性质、元素或限度，但并非每个实施例或示例都必然包括特定特征、结构、特性、性质、元素或限度。另外，重复使用短语“根据本申请的一个实施例”虽然有可能是指代相同实施例，但并非必然指代相同的实施例。
为简单起见，以下描述中省略了本领域技术人员公知的某些技术特征。
根据本申请的一个实施例，提供一种红豆杉内生真菌突变体发酵产紫杉醇的工业化制备工艺，包括如下步骤：
S1：采用常规组织分离法，将新鲜的云南地区红豆杉果实切成0.5～1cm2小块，把果实浸泡于75％酒精5min，用无菌水冲洗3～4次，再用2.5％次氯酸钠浸泡3min；使切割处接触培养基植于其上，采用组织印迹法作对照来检验表面消毒是否彻底；
S2：将培养基置于28℃恒温培养箱中培养，定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的固体培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；
S3：菌悬液的制备，取培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液，采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为 106个/ml；
S4：紫外线诱变，取上制备好的单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中， 15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波，将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上, 离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波，在红光背景下操作,避免光修复，经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复，根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；
S5：紫外线结合亚硝酸的复合诱变，按照上述方法制备约106/ml个的孢子悬液，按照上述的方法先进行紫外线诱变后,吸取1mL诱变后的孢子悬液置于大试管中,加入PH4.5的醋酸缓冲液2mL及0.1mol/L的亚硝酸钠溶液1mL，其最后处理浓度为0.025mol/L，于25～26℃保温10～25min,加入0.07mol/L、PH8.6 的磷酸氢二钠溶液20ml,使PH下降至6.8，以终止反应,稀释后涂平板,挑取菌落进行摇床发酵,同紫外线诱变先用后用评价；
S6：取大小一致的试管,分别装入定量的培养基,制备一致的斜面备用，挑取己活化的菌株划线接种至培养基斜面上，将这些斜面置于28℃恒温箱中培养 9天；
S7：液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH 7，起始PH值为5.0，共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；
S8：将培养的试管斜面菌种挑取转接入装有摇瓶培养基的250ml 三角瓶中,置于28℃、120转/分钟摇床培养24小时；
S9：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
S10：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1％，发酵温度26℃，罐压0.10Mpa，pH 为7.2条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量0.036m3/min， 9h以后，种子罐转速180r/min、通气量0.043m3/min，发酵培养后收集种子液；
S11：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L 二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥ 30min；
S12：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到28℃时，将发酵18h的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～2％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa， pH为7.4条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量1.2m3/min， 9h以后，种子罐转速150r/min、通气量1.5m3/min，发酵培养后收集种子液；
S13：分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；
S14：将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
S15：单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～6号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度26℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养240h，搅拌转速130r/min、通气量0.5～0.8vvm/min，16h以后，发酵罐转速150r/min、通气量1vvm/min；
S16：发酵期内根据培养基量标准实时补足培养基；当培养基补足后且发酵时间达标后，发酵结束，制得内生真菌、菌丝体与紫杉醇混合液；
S17：将制得的内生真菌、菌丝体与紫杉醇混合液泵入1～2号40000L发酵液暂存罐内；
S18：将制得的发酵液泵入粗滤设备过滤后，再用膜微滤机组进行微滤，滤除内生真菌、菌丝体，制得紫杉醇混合粗液；
S19：将过滤后的内生真菌、菌丝体用自动刮刀离心机离心脱溶，制得内生真菌、菌丝体废弃物；
S20：将制得的紫杉醇混合粗液泵入膜超滤浓缩机组进行浓缩，制得紫杉醇混合浓液和废水；
S21：将制得紫杉醇混合浓液泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得紫杉醇粗品滤饼A；
S22：将制得紫杉醇粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用浸膏重量3倍的溶剂加浸膏重量0.1～0.3倍重量的脱色剂萃取脱色1～3次，萃取液经过滤，制得紫杉醇滤液；
S23:将紫杉醇滤液，泵入浓缩机组进行浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
S24:将紫杉醇浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼B；
S25：将制得紫杉醇粗品浸膏，送入2号萃取釜，用浸膏重量3倍的亲脂溶剂萃取3次，萃取液经过滤、合并萃取液，制得紫杉醇萃取液；
S26：将紫杉醇萃取液，泵入浓缩机组进行浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
S27：将紫杉醇粗品浓缩液泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼C；
S28：将紫杉醇粗品滤饼C与结晶母液浸膏合并，装入上柱液配制罐内，用乙醇溶解制作上柱液；
S29：将制得的上柱液送入大孔树脂柱吸附；用去离子水、溶剂洗脱，收集洗脱液；将洗脱液再作为上柱液进行二次大孔树脂吸附、用乙醇洗脱、收集上柱吸附流出液和洗脱液；
S30：将上柱吸附流出液和梯度洗脱液，分别泵入浓缩机组浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓液；
S31：将制得的紫杉醇粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼；
S32：将制得的紫杉醇粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体、浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、离心脱溶、制得紫杉醇粗晶和母液浸膏；
S33：将制得的紫杉醇粗晶，送入8000L的1号或2号结晶釜内，用溶剂溶解后在低温下重结晶，过滤晶体、浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、离心脱溶、制得紫杉醇湿态晶和母液浸膏；
S34：将母液浸膏送入步骤S28与紫杉醇粗品滤饼合并制作上柱液；
S35：将制得的紫杉醇湿态晶体送入超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％紫杉醇晶体粉末；
S36：将制得的≥98％紫杉醇晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％紫杉醇晶体粉末产品。
菌株名称为木霉HQ-24菌株；保藏地：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏号为 CGMCC No.9251。
菌种的制备与工业发酵方法如下：
i、液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH 7，起始PH值为5.0，共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；
ii、将培养的试管斜面菌种挑取转接入装有摇瓶培养基的250ml 三角瓶中,置于28℃、120转/分钟摇床培养24小时；
iii、按配方配制种子培养基，所述的种子培养基配方为蔗糖40g、蛋白胨 10g、酵母浸出粉10g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，PH 7；将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
iv、一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为 7.2条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量0.036m3/min， 9h以后，种子罐转速180r/min、通气量0.043m3/min，发酵培养后收集种子液；
v、按步骤iii标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L 二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥ 30min；
vi、二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到28℃时，将发酵18h的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～2％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa， pH为7.4条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量1.2m3/min， 9h以后，种子罐转速150r/min、通气量1.5m3/min，发酵培养后收集种子液；
vii、分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；所述培养基配方为蔗糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、L-苯丙氨酸0.3mg、乙酸钠0.05mg、苯甲酸钠0.02mg、蒸馏水1000mL，PH 7；
viii、将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
ix、单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～10号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度26℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养240h，搅拌转速130r/min、通气量0.5～0.8vvm/min，16h以后，发酵罐转速150r/min、通气量1vvm/min；
x、发酵期内应根据培养基量标准实时补足培养基；当培养基补足后且发酵时间达标后，发酵结束，制得内生真菌、菌丝体与紫杉醇混合液。
步骤i中，所述培养箱培养天数为3～7天；所述的种子培养基配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、花生四烯酸0.1mg、肉桂酸0.05mg、蒸馏水 1000mL，PH 7；
步骤ii中，所述摇床培养温度为28℃，转速为120转/分钟；
步骤iv中，所述接种量为1～2％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为 7.2条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通风量0.6～1.2vvm/min， 9h以后，种子罐转速180r/min、通风量0.6～1.2vvm/min；
步骤vi中，所述接种量为1～2％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为 7.4条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通风量0.6～1.2vvm/min， 9h以后，种子罐转速150r/min、通风量0.6～1.2vvm/min；
步骤vii中，所述优化培养基配方：蔗糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、 L-苯丙氨酸0.3mg、乙酸钠0.05mg、苯甲酸钠0.02mg、蒸馏水1000mL，PH 7；
步骤vi中，所述接种量为1～2％，发酵温度26℃，罐压0.03Mpa，pH为 7.4条件下发酵培养，搅拌转速130r/min、通风量0.6～1.2vvm/min，16h以后，发酵罐转速150r/min、通风量0.8～1.2vvm/min；
步骤ix中，所述发酵时间为240h；
步骤i、iii、v、viii中，所述灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min。
紫杉醇纯化方法如下：
1、将制得的内生真菌孢子、菌丝体与紫杉醇混合液泵入1～2号40000L发酵液暂存罐内；
2、将制得的发酵液泵入粗滤设备过滤后的滤液，再泵入全自动控制膜微滤机组进行微滤，滤除内生真菌孢子、菌丝体，制得银杏内酯混合粗液；
3、将过滤后的内生真菌孢子、菌丝体用自动刮刀离心机离心脱溶，制得红豆杉内生真菌孢子、菌丝体等废弃物料；
4、将制得的紫杉醇混合粗液，泵入全自动控制膜超滤浓缩机组进行浓缩，制得紫杉醇混合浓液和废水；
5、将制得紫杉醇混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得紫杉醇粗品滤饼A；
6、将紫杉醇粗品滤饼A，送入1号3000L的萃取釜，用浸膏重量3倍的亲脂溶剂加0.1～0.3倍重量的脱色剂萃取脱色，经过滤脱除脱色剂，合并滤液，制得紫杉醇滤液；
7、将紫杉醇滤液，泵入2000L/h的浓缩机组进行浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
8、将紫杉醇粗品浓缩液泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼B；
9、将制得紫杉醇粗品滤饼B，送入2号3000L的萃取釜，用滤饼B重量3 倍的亲脂溶剂萃取，经过滤、合并萃取液，制得萃取液；
10、将紫杉醇萃取液，泵入2000L/h的浓缩机组进行浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
11、将紫杉醇粗品浓缩液泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼C；
12、将紫杉醇粗品滤饼C与结晶母液浸膏合并后，装入全自动控制层析系统上柱液配制罐内，用乙醇溶解制作上柱液；
13、将制得的上柱液送入全自动控制HZ-818大孔树脂柱吸附；用去离子水、乙醇洗脱、收集上柱吸附流出液和洗脱液；将洗脱液作为上柱液进行下一种大孔树脂吸附，用去离子水、乙醇洗脱、收集上柱吸附流出液和洗脱液；
14、将第二种大孔树脂上柱吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩机组浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓液；
15、将制得的紫杉醇粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼D；
16、将制得的紫杉醇粗品滤饼D，送入全自动控制冷冻结晶釜内，用溶剂溶解后在-20℃低温下析晶、过滤晶体、浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、离心脱溶、制得紫杉醇粗晶和母液浸膏；
17、将制得的紫杉醇粗晶，送入1号或2号全自动控制结晶釜内，用溶剂在-5℃低温下重结晶，过滤晶体、浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、离心脱溶、制得紫杉醇湿态晶和母液浸膏；
18、将制得的紫杉醇湿态晶体送入全自动控制超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得≥98％紫杉醇晶体粉末；
19、将结晶母液送入步骤12与紫杉醇粗品滤饼C合并制作上柱液；
20、将三批发酵制得的≥98％紫杉醇晶体粉末送入批量V型混合机混合，制得≥98％紫杉醇晶体粉末产品。
步骤2中，所述的粗滤设备为自动刮刀离心机或袋式过滤机或板框式压滤机；步骤2中，所述全自动控制微滤机组产能为4000L/h；
步骤3中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；
步骤4中，所述全自动控制超滤浓缩机组产能为4000L/h；
步骤5中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；
步骤8中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；
步骤15中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；
步骤14中，所述浓缩机组为全自动控制的2000L～4000L/h的MVR蒸发器或全电蒸发器或膜浓缩器；
步骤20中，所述批量V型混合机为V-1000；批量混合时间为30～60min。
步骤6中，所述溶剂为体积分数90～95％的乙醇；所述溶剂萃取温度为40～ 50℃；
步骤7、10、14、16、17中，所述浓缩机组为MVR蒸发器或全电蒸发器或膜浓缩机组；所述MVR蒸发器或全电蒸发器浓缩温度为55～60℃；真空度为 0.07～0.085Mpa；
步骤9中，所述萃取亲脂溶剂为乙酸乙酯或二氯甲烷；所述萃取温度为40～ 50℃；所述萃取次数为3次；
步骤9中，所述溶剂为体积分数70～85％、PH4～6乙醇或甲醇；所述上柱液溶质浓度为5g～12g/L；
步骤12中，所述全自动控制层析柱系统大孔树脂为HZ-818与XAD-2或 HZ-818与XAD-4或HZ-818与XAD-7或HZ-818与XAD-8联用，即先用HZ-818大孔树脂吸附，用溶剂洗脱后，再将洗脱液用XAD-2或XAD-4或XAD-7或XAD-8 吸附后再进行洗脱。
步骤6中，所述脱色剂为活性白土或活性碳；
步骤19中，所述母液浸膏为紫杉醇含量≥30～60％以上的结晶母液浸膏。
步骤16中，所述析晶溶剂为无水乙醇或甲醇或异丙醇或丙酮；每次搅拌时间10～30min；所述结晶温度为40～50℃→-20℃；每次结晶时间为12～24h；所述冷冻结晶釜为全自动控制的8000L结晶釜；
步骤17中，所述的1、2号结晶釜为全自动控制的8000L结晶釜；所述结晶溶剂为体积分数75～95％乙醇或甲醇或丙酮重结晶；每次搅拌时间10～30min；所述结晶温度为40～50℃→5℃；每次结晶时间为12～24h。
步骤13中，所述吸附流速为3～4BV/h；洗脱液分别用去离子水、PH4～6、体积分数85～95％乙醇或甲醇；所述去离子水洗脱流速为2～3BV/h；所述乙醇或甲醇梯度洗脱流速为3～5BV/h；
步骤18中，所述超临界干燥装置为200L双萃双分电加热全自动控制的超临界干燥装置；超临界干燥并脱残溶压力为20～30Mpa、温度为40～60℃、CO2流量为1500～4500L/h、干燥时间为360～480min。
实施例1
木霉HQ-24菌株的分离和诱变和保藏方法步骤如下：
a、采用常规组织分离法，将新鲜的云南地区红豆杉果实切成0.5～1cm2小块。把果实浸泡于75％酒精5min左右，用无菌水冲洗3～4次，再用2.5％次氯酸钠浸泡3min；使切割处接触培养基植于其上，采用组织印迹法作对照来检验表面消毒是否彻底；
b、将培养基置于28℃恒温培养箱中培养。定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的固体培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；
c、菌悬液的制备：取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液。采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为106个/ml；
d、紫外线诱变：取上制备好的单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中。 15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波。将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上, 离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波。上在红光背景下操作,避免光修复。经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内, 浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复。根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；
e、紫外线结合亚硝酸的复合诱变：按照上述方法制备约106/ml个的孢子悬液，按照上述的方法先进行紫外线诱变后,吸取1mL诱变后的孢子悬液置于大试管中,加入PH4.5的醋酸缓冲液2mL及0.1mol/L的亚硝酸钠溶液1mL(最后处理浓度为0.025mol/L)，于25～26℃保温10～25min,加入0.07mol/L、PH8.6的磷酸氢二钠溶液20ml,使PH下降至6.8左右，以终止反应,适当稀释后涂平板, 挑取菌落进行摇床发酵,同紫外线诱变先用后用评价；
菌种的制备与工业发酵方法：
i、液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH 7。起始PH值为5.0。共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；
ii、将培养的试管斜面菌种挑取转接入装有摇瓶培养基的250ml 三角瓶中,置于28℃、120转/分钟摇床培养24小时；
iii、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基泵入1号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
iv、一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统接种到1号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量0.036m3/min，9h以后，种子罐转速180r/min、通气量0.043m3/min，发酵培养后收集种子液；
v、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基装入1号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
vi、二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到28℃时，将发酵18h的一级种子发酵液通过无菌接种系统接种到1号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～2％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为7.4 条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量1.2m3/min，9h以后，种子罐转速150r/min、通气量1.5m3/min，发酵培养后收集种子液；
vii、分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；
viii、将发酵培养基泵入1号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
ix、单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1号发酵 18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统接种到1号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度26℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养240h，搅拌转速130r/min、通气量0.5～0.8vvm/min，16h以后，发酵罐转速150r/min、通气量1vvm/min；
x、发酵期内应根据培养基量标准实时补足培养基；当培养基补足后且发酵时间达标后，发酵结束，制得内生真菌、菌丝体与紫杉醇混合液；
紫杉醇纯化方法：
⑴、将制得的内生真菌孢子、菌丝体与紫杉醇混合液泵入1～2号40000L 发酵液暂存罐内；
⑵、将制得的发酵液泵入板框式压滤机过滤后的滤液，再泵入4000L/h全自动控制膜微滤机组进行微滤，滤除内生真菌孢子、菌丝体，制得银杏内酯混合粗液；
⑶、将过滤后的内生真菌孢子、菌丝体用PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶，制得红豆杉内生真菌孢子、菌丝体等废弃物料；
⑷、将制得的紫杉醇混合粗液，泵入4000L/h全自动控制膜超滤浓缩机组进行浓缩，制得紫杉醇混合浓液和废水；
⑸、将制得紫杉醇混合浓液，泵入PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶，制得紫杉醇粗品滤饼A；
⑹、将紫杉醇粗品滤饼A，送入1号3000L的萃取釜，用浸膏重量3倍的体积分数70～95％乙醇溶剂加0.1倍重量的活性炭萃取脱色，经过滤脱除脱色剂，合并滤液，制得紫杉醇滤液；
⑺、将紫杉醇滤液，泵入2000L/h的全电蒸发器浓缩机组进行浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
⑻、将紫杉醇粗品浓缩液泵入PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼B；
⑼、将制得紫杉醇粗品滤饼B，送入2号3000L的萃取釜，用滤饼B重量3 倍的乙酸乙酯溶剂萃取，经过滤、合并萃取液，制得萃取液；
⑽、将紫杉醇乙酸乙酯萃取液，泵入2000L/h的全电蒸发器浓缩机组进行浓缩、回收乙酸乙酯溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
⑾、将紫杉醇粗品浓缩液泵入PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙酸乙酯溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼C；
⑿、将紫杉醇粗品滤饼C与结晶母液浸膏合并后，装入全自动控制层析系统上柱液配制罐内，用体积分数70～95％的乙醇溶解制作上柱液；
⒀、将制得的上柱液送入全自动控制HZ-818大孔树脂柱吸附；用去离子水、用体积分数70～95％乙醇洗脱、收集上柱吸附流出液和洗脱液；将洗脱液作为上柱液用XAD-2大孔树脂吸附，用去离子水、用体积分数70～95％乙醇洗脱、收集上柱吸附流出液和洗脱液；
⒁、将第二种大孔树脂上柱吸附流出液和洗脱液，分别泵入2000～4000L/h 全电蒸发器浓缩机组浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓液；
⒂、将制得的紫杉醇粗品浓液，泵入PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼D；
⒃、将制得的紫杉醇粗品滤饼D，送入8000L全自动控制冷冻结晶釜内，用体积分数70～95％的甲醇溶剂溶解后在-20℃低温下析晶、过滤晶体、全电蒸发器浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、离心脱溶、制得紫杉醇粗晶和母液浸膏；
⒄、将制得的紫杉醇粗晶，送入1号或2号8000L全自动控制结晶釜内，用体积分数70～95％的甲醇溶剂在-5℃低温下重结晶，过滤晶体、2000L/h全电蒸发器浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、制得紫杉醇湿态晶和母液浸膏；
⒅、将制得的紫杉醇湿态晶体送入200L全自动控制超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得≥98％紫杉醇晶体粉末9.62kg；
⒆、将结晶母液送入步骤⑿与紫杉醇粗品滤饼C合并制作上柱液；
⒇、将三批发酵制得的≥98％紫杉醇晶体粉末送入批量V-1000型混合机混合，制得≥98％紫杉醇晶体粉末产品；
实施例2
菌种的制备与工业发酵方法：
i、液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH 7。起始PH值为5.0。共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；
ii、将培养的试管斜面菌种挑取转接入装有摇瓶培养基的250ml 三角瓶中,置于28℃、120转/分钟摇床培养24小时；
iii、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基泵入2号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
iv、一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统接种到2号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量0.036m3/min，9h以后，种子罐转速180r/min、通气量0.043m3/min，发酵培养后收集种子液；
v、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基装入2号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
vi、二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到28℃时，将发酵18h的一级种子发酵液通过无菌接种系统接种到2号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～2％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为7.4 条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量1.2m3/min，9h以后，种子罐转速150r/min、通气量1.5m3/min，发酵培养后收集种子液；
vii、分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；
viii、将发酵培养基泵入2号100000L发酵单罐或1～2号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
ix、单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将2号发酵 18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统接种到2号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度26℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养240h，搅拌转速130r/min、通气量0.5～0.8vvm/min，16h以后，发酵罐转速150r/min、通气量1vvm/min；
x、发酵期内应根据培养基量标准实时补足培养基；当培养基补足后且发酵时间达标后，发酵结束，制得内生真菌、菌丝体与紫杉醇混合液；
紫杉醇纯化方法：
⑴、将制得的内生真菌孢子、菌丝体与紫杉醇混合液泵入1～2号30000L 发酵液暂存罐内；
⑵、将制得的发酵液泵入袋式过滤机过滤后的滤液，再泵入4000L/h全自动控制膜微滤机组进行微滤，滤除内生真菌孢子、菌丝体，制得银杏内酯混合粗液；
⑶、将过滤后的内生真菌孢子、菌丝体用PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶，制得红豆杉内生真菌孢子、菌丝体等废弃物料；
⑷、将制得的紫杉醇混合粗液，泵入4000L/h全自动控制膜超滤浓缩机组进行浓缩，制得紫杉醇混合浓液和废水；
⑸、将制得紫杉醇混合浓液，泵入PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶，制得紫杉醇粗品滤饼A；
⑹、将紫杉醇粗品滤饼A，送入1号3000L的萃取釜，用浸膏重量3倍的体积分数70～95％甲醇溶剂加0.2倍重量的活性白土萃取脱色1～3次，经过滤脱除脱色剂，合并滤液，制得紫杉醇滤液；
⑺、将紫杉醇滤液，泵入2000L/h的膜浓缩机组进行浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
⑻、将紫杉醇粗品浓缩液泵入PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼B；
⑼、将制得紫杉醇粗品滤饼B，送入2号3000L的萃取釜，用滤饼B重量3 倍的二氯甲烷溶剂萃取3次，经过滤、合并萃取液，制得萃取液；
⑽、将紫杉醇萃取液，泵入2000L/h的膜浓缩机组进行浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
⑾、将紫杉醇粗品浓缩液泵入PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙酸乙酯溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼C；
⑿、将紫杉醇粗品滤饼C与结晶母液浸膏合并后，装入全自动控制层析系统上柱液配制罐内，用体积分数70～95％的甲醇溶解制作上柱液；
⒀、将制得的上柱液送入全自动控制HZ-818大孔树脂柱吸附；用去离子水、用体积分数70～95％甲醇洗脱、收集上柱吸附流出液和洗脱液；将洗脱液作为上柱液用XAD-4大孔树脂吸附，用去离子水、用体积分数70～95％乙醇洗脱、收集上柱吸附流出液和洗脱液；
⒁、将XAD-4大孔树脂上柱吸附流出液和洗脱液，分别泵入2000～4000L/h 膜浓缩机组浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓液；
⒂、将制得的紫杉醇粗品浓液，泵入PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼D；
⒃、将制得的紫杉醇粗品滤饼D，送入8000L全自动控制冷冻结晶釜内，用体积分数70～95％的乙醇溶剂溶解后在-20℃低温下析晶、过滤晶体、2000L/h 膜浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、制得紫杉醇粗晶和母液浸膏；
⒄、将制得的紫杉醇粗晶，送入1号或2号8000L/h全自动控制结晶釜内，用体积分数70～95％的乙醇溶剂在-5℃低温下重结晶，过滤晶体、2000L/h膜浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、制得紫杉醇湿态晶和母液浸膏；
⒅、将制得的紫杉醇湿态晶体送入全自动控制200L超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得≥98％紫杉醇晶体粉末9.58kg；
⒆、将结晶母液送入步骤⑿与紫杉醇粗品滤饼C合并制作上柱液；
⒇、将三批发酵制得的≥98％紫杉醇晶体粉末送入批量V-1000型混合机混合，制得≥98％紫杉醇晶体粉末产品；
实施例3
菌种的制备与工业发酵方法：
i、液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH 7。起始PH值为5.0。共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；
ii、将培养的试管斜面菌种挑取转接入装有摇瓶培养基的250ml 三角瓶中,置于28℃、120转/分钟摇床培养24小时；
iii、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基按顺序分别泵入3、4、5、 6、7、8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
iv、一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统按顺序分别接种到3、4、5、6、7、8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量0.036m3/min，9h以后，种子罐转速180r/min、通气量0.043m3/min，发酵培养后收集种子液；
v、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基按顺序分别装入3、4、5、6、 7、8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
vi、二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到28℃时，将发酵18h的一级种子发酵液通过无菌接种系统按顺序分别接种到3、4、5、6、7、8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～2％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为7.4条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通气量1.2m3/min，9h以后，种子罐转速150r/min、通气量1.5m3/min，发酵培养后收集种子液；
vii、分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；
viii、将发酵培养基按顺序分批泵入3、4、5、6、7、8、9、10号100000L 发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；
ix、单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再按顺序分别将3、4、5、6、7、8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统按顺序分别接种到3、4、5、6、7、8号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度26℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养240h，搅拌转速130r/min、通气量0.5～0.8vvm/min，16h以后，发酵罐转速150r/min、通气量1vvm/min；
x、发酵期内按顺序分别根据培养基量标准实时补足培养基；当培养基补足后且发酵时间达标后，发酵结束，制得内生真菌、菌丝体与紫杉醇混合液；
紫杉醇纯化方法：
⑴、将制得的内生真菌孢子、菌丝体与紫杉醇混合液按顺序分别泵入1～2 号30000L发酵液暂存罐内；
⑵、将制得的发酵液泵入自动刮刀离心机离心后的滤液，再泵入4000L/h 全自动控制膜微滤机组进行微滤，滤除内生真菌孢子、菌丝体，制得银杏内酯混合粗液；
⑶、将过滤后的内生真菌孢子、菌丝体，按顺序分别用PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶，制得红豆杉内生真菌孢子、菌丝体等废弃物料；
⑷、将制得的紫杉醇混合粗液，按顺序分别泵入4000L/h全自动控制膜超滤浓缩机组进行浓缩，制得紫杉醇混合浓液和废水；
⑸、将制得紫杉醇混合浓液，按顺序分别泵入PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶，制得紫杉醇粗品滤饼A；
⑹、将紫杉醇粗品滤饼A，按顺序分别送入1号3000L的萃取釜，用浸膏重量3倍的体积分数乙酸乙酯溶剂加0.3倍重量的活性白土萃取脱色1～3次，经过滤脱除脱色剂，合并滤液，制得紫杉醇滤液；
⑺、将紫杉醇滤液，按顺序分别泵入2000L/h的MVR蒸发器浓缩机组进行浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
⑻、将紫杉醇粗品浓缩液，按顺序分别泵入PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼B；
⑼、将制得紫杉醇粗品滤饼B，按顺序分别送入2号3000L的萃取釜，用滤饼B重量3倍的乙酸乙酯溶剂萃取3次，经过滤、合并萃取液，制得萃取液；
⑽、将紫杉醇乙酸乙酯萃取液，按顺序分别泵入2000L/h的MVR蒸发器浓缩机组进行浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓缩液；
⑾、将紫杉醇粗品浓缩液，按顺序分别泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼C；
⑿、将紫杉醇粗品滤饼C与结晶母液浸膏合并后，按顺序分别装入全自动控制层析系统上柱液配制罐内，用体积分数70～95％的乙醇溶解制作上柱液；
⒀、将制得的上柱液按顺序分别送入全自动控制HZ-818大孔树脂柱吸附；用去离子水、用体积分数70～95％乙醇洗脱、收集上柱吸附流出液和洗脱液；将洗脱液作为上柱液用XAD-7大孔树脂吸附，用去离子水、用体积分数70～95％乙醇洗脱、收集上柱吸附流出液和洗脱液；
⒁、按顺序分别将XAD-7大孔树脂上柱吸附流出液和洗脱液，泵入2000L/h MVR蒸发器浓缩机组浓缩、回收溶剂，制得紫杉醇粗品浓液；
⒂、将制得的紫杉醇粗品浓液，按顺序分别泵入PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得紫杉醇粗品滤饼D；
⒃、将制得的紫杉醇粗品滤饼D，按顺序分别送入8000L全自动控制冷冻结晶釜内，用体积分数70～95％的丙酮溶剂溶解后在-20℃低温下析晶、过滤晶体、 MVR蒸发器浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、制得紫杉醇粗晶和母液浸膏；
⒄、将制得的紫杉醇粗晶，按顺序分别送入1号或2号8000L全自动控制结晶釜内，用体积分数70～95％的丙酮溶剂在-5℃低温下重结晶，过滤晶体、MVR 蒸发器浓缩机组浓缩母液、回收溶剂、PGZ-1000自动刮刀离心机离心脱溶、制得紫杉醇湿态晶和母液浸膏；
⒅、将制得的紫杉醇湿态晶体,按顺序分别送入200L全自动控制超临界CO2 干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得≥98％紫杉醇晶体粉末38.78kg；
⒆、将结晶母液送入步骤⑿与紫杉醇粗品滤饼C合并制作上柱液；
⒇、将三批发酵制得的≥98％紫杉醇晶体粉末送入批量V-1000型混合机混合，制得≥98％紫杉醇晶体粉末产品。
实施例4
紫杉醇产物的检测和鉴定
1、诱变结果的评价方法
⑴、TLC初步评价
用微量进样器分别定量吸取5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl的0.35mg/L 紫杉醇点样于活化后的硅胶G板上,展开后取出晾干,用乙酸酐蒸气熏0.5h，取出,160℃烘0.5h,365nm紫外检视,数码相机照相,于凝胶成像仪上经quantity one摄像,totallab扫描分析得紫杉醇显色斑光吸收值,考察进样量与显色斑光吸收值的关系,绘制紫杉醇标准曲线。将各诱变菌株的发酵样品、紫杉醇(高、低剂量)定量点于同一硅胶板上,同法展开后通过totallab测算样品中的含量来计算总的紫杉醇的类物质的含量。
⑵、HPLC-UV评价
利用HPLC建立紫杉醇标准曲线：称取紫杉醇标准品0.85mg，用乙醇溶解，定溶至10mL。高效液相色谱(HPLC)测定，色谱条件为：流动相，甲醇-水-乙腈 (23：41：36)，C18柱(4.6mm×150mm,5μm)，流速1mL/min，检测波长 227nm.，进样量20μL，柱温：室温，单点绘制标准曲线。将实施例一至实施例三所制备的紫杉醇样品和紫杉醇标准品，用高效液相仪进行检测，具有相同的出峰时间。
⑶、紫杉醇含量计算公式：
发酵液中紫杉醇的含量(μg/L)＝甲醇中紫杉醇的含量(mg/m L)溶解提取物所用甲醇的体积(m L)106/提取时所取发酵液的体积(m L)；
2、对实施例1至3所得紫杉醇进行紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振分析，并与紫杉醇标准样品对比，结果相同，由此可见本发明制备的紫杉醇图谱与购置的标准品图谱高度一致。
3、体外生物学实验证明，本发明制备的紫杉醇样品对乳腺癌细胞、卵巢癌细胞与紫杉醇标准品具有相同的杀伤百分率。以上所述实施例仅表示本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明保护范围。因此本发明的保护范围应该以所述权利要求为准。