阅读说明：本技术 一种细胞色素p450环氧酶及其应用 (Cytochrome P450 epoxidase and application thereof ) 是由 刘立明 燕宇 宋伟 陈修来 刘佳 高聪 于 2020-11-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种细胞色素P450环氧酶及其应用,属于生物工程技术领域。本发明提供了一种细胞色素P450环氧酶CytP,通过在大肠杆菌中表达所述环氧酶CytP,利用全细胞转化法,将降冰片烯转化为环氧降冰片烷。并从反应的pH、温度、相比和诱导时间等因素对CytP酶的两相催化体系进行优化,克服了之前P450单加氧酶环氧化活性低且催化特异性差的局限,可使得环氧降冰片烷产量达到36.81g/L,催化特性达到99％,环氧化反应摩尔产率达31.46％。从而大大降低了之前的底物成本和环境污染等问题,为环氧降冰片烷的工业化生产和绿色生产奠定了基础。(The invention discloses cytochrome P450 epoxidase and application thereof, and belongs to the technical field of bioengineering. The invention provides cytochrome P450 epoxidase CytP, which is expressed in escherichia coli, and norbornene is converted into epoxy norbornane by a whole-cell conversion method. The two-phase catalytic system of the CytP enzyme is optimized according to factors such as pH, temperature, phase ratio and induction time of the reaction, the limitation that the prior P450 monooxygenase has low epoxidation activity and poor catalytic specificity is overcome, the yield of epoxy norbornane can reach 36.81g/L, the catalytic property reaches 99%, and the molar yield of the epoxidation reaction reaches 31.46%. Thereby greatly reducing the problems of substrate cost, environmental pollution and the like, and laying a foundation for the industrial production and the green production of the epoxy norbornane.)

一种细胞色素P450环氧酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种细胞色素P450环氧酶及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

环氧降冰片烷，又名3-环氧丙基[3,2,1,0^2,4]辛烷，属于降茨烷的衍生物之一。作为一个饱和的桥环化合物，其化学式为C₇H₁₀O，熔点为126℃。它是由环己烷的碳骨架在1，4位桥连一个亚甲基，同时2，3位与一个氧原子构成环氧结构形成的。

目前，环氧降冰片烷的主要生产方法为化学合成法，主要为过氧化氢法，但是这种方法虽然得率高，能耗却较大，同时会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。通过生物法制备环氧降冰片烷具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种有效的生物法高效制备环氧降冰片烷。

目前，微生物法生产环氧降冰片烷涉及到一个关键的酶细胞色素P450环氧酶(CytP，Cytochrome P450 epoxidase)，它具有广泛的底物杂泛性，可以催化降冰片烯，使其C＝C双键环氧化，形成环氧降冰片烷。而微生物法制备环氧降冰片烷主要为酶转化法。目前，由于酶转化法具备环境有利、反应温和及操作简便等优点而更具备工业应用价值。但是，酶转化法大规模制备环氧降冰片烷受到以下限制：(1)底物降冰片烯不溶于水，反应体系中有机溶剂的加入对CytP存在抑制作用；(2)过氧化氢作为反应物之一为产物提供氧原子，进一步对酶活造成不可逆的损失；(3)伴随着催化反应的进行，CytP强大的催化能力和底物杂泛性使得副产物生成，导致催化特异性降低，这极大程度限制了环氧降冰片烷的产率及后期分离纯化，是目前研究的重点问题。此外，如ShengxiJin，Thomas M,Makris等人所研究的P450酶的烯烃环氧化反应机理报道，P450酶作为加氧酶，当底物存在C＝C双键时，更偏向于催化羟基化反应，而环氧化反应一直是不被期望的转化率低的副反应(公开于《Epoxidation of Olefins by Hydroperoxo-Ferric Cytochrome P450》，2003年)。为实现环氧化反应，P450酶往往需要对特定的关键残基进行突变改造，而专一性催化环氧化反应更是一项挑战。

发明内容

在目前的研究中，P450环氧酶中的大部分酶都不能够对底物实现单一性的催化环氧化，导致催化效率低、产量极低。

近年来，细胞色素P450酶催化路径的深入研究为催化单一环氧化反应提供了新思路

——CouplingⅡ分流途径。区别于P450酶经典的羟基化单加氧途径，CouplingⅡ分流途径既不需要额外的氧化还原蛋白伴侣也不需要NAD(P)H辅因子，过氧化氢作为该途径中唯一的氧来源，最终产生单一的环氧化产物。CouplingⅡ分流途径为P450酶转化法制备环氧降冰片烷打通了催化特异性低下的壁垒。

但是发明人在前期的研究中发现，在庞大的P450酶系中，并不是所有的酶都能催化降冰片烯生成环氧降冰片烷。

因此，本发明提供了一种细胞色素P450环氧酶CytP，并利用该环氧酶催化降冰片烯制备环氧降冰片烷。利用该环氧酶CytP构建重组菌，进行全细胞法转化生产环氧降冰片烷，具有低环境损害、高催化特异性、减少了转化中的副产物等优点，极大提高了工业化的生产效率。

本发明提供的细胞色素P450环氧酶CytP，其相应的亲本氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种合成环氧降冰片烷的方法，其特征在于，利用表达来源于Pseudomonas putida KT2440的环氧酶CytP的菌株以降冰片烯为底物，生产环氧降冰片烷。

在本发明的一种实施方式中，所述环氧酶CytP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述菌株以Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，以pET28a为表达载体在Escherichia coli BL21(DE3)中表达所述CytP酶。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中含有有机相和水相，所述有机相和水相的体积比为(2-6:1)。

在本发明的一种实施方式中，所述有机相为乙酸乙酯，所述水相为磷酸缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，反应pH为8.0-8.5。

在本发明的一种实施方式中，反应温度为30-37℃。

在本发明的一种实施方式中，将菌株经过IPTG诱导12-13h或16-17h后，收集细胞，将细胞加入反应体系中反应。

本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环氧酶CytP在制备环氧降冰片烷中的应用。

在本发明的一种实施方式中，以所述环氧酶CytP，或以表达所述环氧酶CytP的基因工程菌为催化剂，催化降冰片烯生成环氧降冰片烷。

在本发明的一种实施方式中，所述环氧酶CytP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株。

本发明的有益效果：本发明提供了一种细胞色素P450环氧酶CytP，用于催化生产环氧降冰片烷。所述环氧酶CytP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该环氧酶不仅大大提高了P450酶的环氧化活性，同时对底物具有很高的催化特异性，提高了单位催化剂的生产能力，有效降低了生产成本。本发明提供的环氧酶以降冰片烯为底物时环氧降冰片烷的产量可达36.81g/L，摩尔产率可达31.46％，羟基化副产物产量<0.01g/L，摩尔产率<0.0084％，加快了酶转化法生产环氧降冰片烷的工业化进程。

附图说明

图1为本发明细胞色素P450环氧酶诱导表达的SDS-PAGE图；泳道1～3分别是25℃下0.2mM IPTG浓度诱导表达后全细胞、上清液和沉淀中所目的蛋白条带大小。

图2为酶活性验证图，对转化体系内各组分进行缺失对照，对比环氧化产物和羟基化副产物的生成情况图。

图3为转化缓冲液pH和环氧降冰片烷生产量的关系图。

图4为转化温度和环氧降冰片烷生产量的关系图。

图5为两相比例和环氧降冰片烷生产量的关系图。

图6为重组菌诱导时间和环氧降冰片烷生产量的关系图。

具体实施方式

实施例1：CytP酶的表达与纯化

基因工程菌的构建及蛋白的表达：

以恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440中目的蛋白编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.2所示)为模板，利用F1和R1为引物(下划线分别是BamH I和EcoR I限制性酶切位点)PCR扩增，扩增条件为：

95℃5min，29个循环(98℃10s，55℃15s，72℃1.5min)，72℃5min。

F1：caaatgggtcgcggatccATGGAGATCC(SEQ ID NO.3)；

R1：tcgacggagctcgaattcTTACCAAATCAC(SEQ ID NO.4)。

获得CytP基因编码区cDNA序列，PCR产物回收后与经同样双酶切的pET-28a(+)质粒载体通过同源重组连接，获得重组表达质粒pET-28a(+)-p28p，将重组质粒pET-28a(+)-p28p转化入E.coli BL21(DE3)，经过PCR鉴定，获得阳性的工程菌命名为E.coli BL21/pET-28a(+)-p28p。

将工程菌E.coli BL21/pET-28a(+)-p28p接入LB培养基，培养12h后得到活化液，将活化液接种至新鲜的TB培养基，培养2h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，25℃培养14h，诱导表达重组目的蛋白。取150mL诱导发酵液经6000r/min离心收集菌体

结果如图2：泳道1～3分别是全细胞、上清液和沉淀中所含蛋白的条带大小，可见，不论是全细胞还是上清液和沉淀中，目的蛋白都得到了表达，并且条带大小相同。

实施例2：CytP酶活性验证

将从甘油管中保存的菌株涂布于LB固体培养基上，在37℃下恒温培养至长出单克隆，挑取单克隆至新鲜的LB液体培养基中，以200rpm、37℃下恒温培养12h后得到活化液，将活化液以1mL/100mL的量接种至新鲜的TB培养基，培养2h后，加入终浓度为0.2mM的I PTG，于25℃下诱导培养14h，结束后收集细胞。

在100mL锥形瓶中分别加入0.2g诱导培养后表达CytP蛋白的全细胞、1g降冰片烯(C₇H₁₀O，NBE)、320μL 30％过氧化氢、2.18mL磷酸缓冲液(100mmol/L KCL，pH7.4)和7.5mL乙酸乙酯，25℃反应48h后5000r/min离心10min，吸取上层有机相，经无水硫酸镁干燥，过0.22μm有机膜，进行气相色谱分析。

具体的气相色谱分析方法为：样品分析采用气相色谱仪Agilent GC-7890B，手性气相色谱柱DB-5；进样口温度为250℃；初始柱温45℃2min，以10℃/min升温至250℃；载气为氦气，流速1.0mL/min，分流比10:1。在此检测条件下，乙酸乙酯、降冰片烯、环氧降冰片烷(EPO-NBE)的保留时间分别为2.255min、3.315min和6.195min。

EPO-NBE摩尔产率＝(P/S₀)×100％；

其中：P代表EPO-NBE的最终摩尔浓度，S₀代表NBE的初始摩尔浓度。

具体的结果如图2所示，由图2可知全细胞的酶解效果为8.21％摩尔产率。从结果可以看出CytP酶不仅具有明显的环氧化活性，且具有良好的催化特异性。相反空白对照和无目的基因重组载体的E.coli对照组均没有相应的酶解效果，在没有有机溶剂乙酸乙酯、以及没有过氧化氢的反应体系中，摩尔产率都显著降低。

实施例3：全细胞最适反应pH

具体实施方式参见实施例2，区别在于，将0.2g全细胞分别于pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5及pH9.0磷酸缓冲液组成的10mL两相转化体系(有机相：水相＝3：1)中进行48h转化，按照上述检测方法测定环氧降冰片烷的产量，计算环氧化摩尔产率。结果显示，CytP酶在pH6.0-pH8.5内环氧化活性随着pH的上升而增长，在pH8.0时可达到10.67g/L，在pH8.5左右达到峰值，环氧降冰片烷产量为11.17g/L，摩尔产率为9.54％，随后环氧化活性随pH的进一步升高而下降。这说明较高的pH(碱性环境)对CytP酶催化环氧化反应更有利，全细胞在pH8.0-8.5具有更好的环氧化活性。

实施例4：全细胞最适反应温度

具体实施方式参见实施例1，区别在于，在缓冲液pH为8.5的条件下测定CytP在不同温度条件下(16、20、25、30、37℃)转化48h的环氧降冰片烷产量，计算环氧化摩尔产率。结果显示，CytP酶在16-25℃范围内环氧化活性随着温度的上升而降低，而在25-30℃范围内环氧化活性却随着温度的上升而增长，在30℃可达到峰值，环氧降冰片烷产量为17.32g/L，摩尔产率为14.8％，在37℃时产量也能达到环氧降冰片烷产量为17.18g/L，摩尔产率为14.68％。因而，在30-37℃的转化温度对CytP酶催化环氧化反应更有利，CytP酶在该温度下具有更好的环氧化活性。

实施例5：全细胞转化最优相比

具体实施方式参见实施例1，区别在于，在30℃、缓冲液pH为8.5的条件下测定CytP在两相不同的体积比条件下(有机相：水相＝1：6-6：1)转化48h的环氧降冰片烷产量，计算环氧化摩尔产率。

所述有机相为乙酸乙酯，水相为磷酸缓冲液(含有320μL浓度为30％的过氧化氢)。

结果显示，CytP酶在两相相比为1:6-2:1范围内环氧化活性随着相比的增加而增加，并在相比为2:1时达到峰值，环氧降冰片烷产量为25.17g/L，摩尔产率为21.51％，随后环氧化活性随相比的进一步增加而下降。这说明相比为2:1时底物溶解和有机溶剂对酶活的抑制能达到较好的抵消，对CytP酶催化环氧化反应更有利。

实施例6：全细胞转化诱导时间分析

具体实施方式参见实施例2，区别在于，将IPTG诱导菌株的时间变为12-17h。

在30℃、缓冲液pH为8.5、两相相比为2:1的条件下测定CytP在不同诱导时间条件下(12-17h)转化48h的环氧降冰片烷产量，计算环氧化摩尔产率。

结果如图6所示，CytP酶在诱导时间为12-15h范围内环氧化活性随着诱导时间的增加而降低，短时间的诱导反而能促进转化，在诱导12h时，环氧降冰片烷产量为35.42g/L，摩尔产率为30.27％，在诱导13h时，环氧降冰片烷产量为34.45g/L，摩尔产率为29.44％；而在15-16h范围内环氧化活性却随着诱导时间的增加而增长，并在16h左右达到峰值，环氧降冰片烷产量为36.81g/L，摩尔产率为31.46％，在诱导17h时，环氧降冰片烷产量为35.98g/L，摩尔产率为30.75％。因而，细胞在诱导12-13、16-17h时具有更好的环氧化活性，对于催化环氧化反应更有利。

对比例1

具体实施方式参见实施例2，区别在于，将表达P450酶系中的CytBU7酶(来源于Bacillus megaterium)的重组菌BL21-p28BU7的全细胞加入反应体系，反应结束后，测定环氧降冰片烷的含量，结果显示，环氧降冰片烷产量为0.044g/L，摩尔产率仅为0.037％，远低于CytP酶。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种细胞色素P450环氧酶及其应用

<130> BAA201263A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 411

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<400> 1

Met Glu Ile Leu Asp Arg Pro Gln Ala Pro Ser Asp Phe Asn Pro Met

1 5 10 15

Ser Glu Gln Ser Phe Arg Asp Pro Ala Ser Ile Cys Gln Arg Ala Arg

20 25 30

Glu Glu Thr Pro Val Phe Phe Tyr Ala Pro Leu Gly Val Trp Met Val

35 40 45

Thr Arg Arg Glu Asp Ala Glu Arg Val Leu Ser Glu Trp Glu Thr Phe

50 55 60

Ser Ser Leu Ala Asn Ser Pro Asn Val Pro Glu Glu Phe Arg Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ala Pro Ser Val Met Ala Asp Ser Ile Val Ala Ile Asp Pro Pro

85 90 95

Arg His Thr Gln Ala Arg Asn Val Ile Gln Arg Gly Phe Met Lys Pro

100 105 110

Lys Ile Asp Pro Leu Glu Pro Ile Ile Glu Gln Arg Ala His Glu Ile

115 120 125

Ile Asp Arg Phe Ala Gly Glu Ser Gly Thr Glu Ile Met Asn Asn Tyr

130 135 140

Cys Leu Glu Leu Thr Thr Arg Thr Leu Met Ala Leu Tyr Asp Leu Pro

145 150 155 160

Leu Glu Asp Arg Pro Met Phe Glu Arg Ile Arg Asp Val Ser Ile Lys

165 170 175

Val Leu Ala Ser Val Tyr Glu Pro Met Gln Glu Pro Glu Lys Ser Arg

180 185 190

Val Trp Asn Glu Tyr Val Ser Gly Tyr Glu Tyr Phe Tyr Gln Leu Val

195 200 205

Glu Gln Arg Arg Asn Ser Asp Ala Arg Asp Ile Ile Ser Thr Met Ala

210 215 220

Ser Gln Lys Asp Asn Gln Gly Asn Pro Ala Leu Ser Thr Glu Arg Ile

225 230 235 240

Ala Leu His Leu Val Glu Ile Ala Phe Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala

245 250 255

Gln Met Met Ala Asn Ala Ile Leu Phe Leu Asp Ser His Pro Glu Ala

260 265 270

Leu Ala Ala Ala Lys Ala Asp Lys Thr Leu Trp Ser Arg Val Phe Glu

275 280 285

Glu Thr Val Arg Arg Arg Pro Ser Ala Pro Phe Ala Gly Arg Ile Thr

290 295 300

Thr Thr Glu Val Glu Ile Gln Gly Val Lys Ile Pro Ala Gly Ser Pro

305 310 315 320

Val Trp Val Ser Leu Ala Ala Ala Asn Thr Asp Pro Arg His Val Gly

325 330 335

Cys Pro Met Asn Phe Asp Ile Asn Arg Glu Ala Pro Gln Asp His Leu

340 345 350

Ala Phe Thr Lys Gly Arg His Thr Cys Pro Gly Ala Pro Leu Ala Arg

355 360 365

Leu Gln Gly Ala Thr Gly Leu Arg Val Leu Phe Glu Arg Leu Pro Glu

370 375 380

Leu Lys Val Val Pro Asp Gln Pro Leu Asn Phe Ala Pro Met Ala Leu

385 390 395 400

Leu Pro Val Arg Leu Ser Leu Gln Val Ile Trp

405 410

<210> 2

<211> 1236

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida

<400> 2

atggagatcc ttgatcgccc acaggcccct agtgacttca atcccatgtc tgaacagtcg 60

tttcgtgatc cggccagcat ttgccagcgt gcgcgtgagg aaacgccggt ctttttctac 120

gcgcctttag gggtgtggat ggtcactcgt cgtgaagacg ctgaacgcgt cctttcagaa 180

tgggaaacat tctcgagtct tgccaactcc cctaacgtcc cggaagagtt tcgcagccgc 240

ttcgccccca gtgtgatggc cgacagcatc gtcgctatcg accccccgcg tcacactcaa 300

gcccgtaacg taattcagcg tggtttcatg aaaccgaaga ttgatcctct ggaacctatt 360

attgaacagc gcgcgcacga gattattgat cgctttgctg gagagtccgg caccgaaatc 420

atgaataact actgtttgga attaaccacg cgtactttaa tggccttata cgacttgccc 480

ttggaagatc gtcctatgtt tgagcgtatt cgcgatgtat caattaaagt gttagctagt 540

gtgtatgagc ccatgcaaga gcctgaaaaa agccgcgtct ggaacgagta cgtctcggga 600

tatgaatatt tctaccaatt ggtggagcag cgccgcaact ccgacgcgcg cgatattatc 660

agcacaatgg catcgcagaa agacaaccaa ggcaatccgg ccttatccac cgaacgtatt 720

gctcttcacc tggtggagat tgcattcgcc ggcactgata ctacggccca aatgatggca 780

aacgcgatcc tgtttttgga ttctcacccc gaggccttag cagctgccaa agcagacaaa 840

accctttggt ctcgtgtttt tgaggagaca gttcgccgtc gcccgtccgc tccttttgcc 900

gggcgcatta caacgacaga agtcgagatt cagggggtga aaatcccagc gggtagtcca 960

gtttgggtat ctttagcagc agcgaataca gacccacgtc atgtcggatg tccgatgaat 1020

tttgacatca atcgtgaagc cccacaagac cacttagctt tcacaaaagg tcgccataca 1080

tgccctgggg ctccattggc ccgtttacaa ggggcgaccg ggttacgtgt cctgtttgaa 1140

cgcctgccag agctgaaagt agtgcctgat cagccgttga acttcgcacc aatggcgctg 1200

cttccagttc gtttgagttt acaggtgatt tggtaa 1236

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caaatgggtc gcggatccat ggagatcc 28

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcgacggagc tcgaattctt accaaatcac 30