阅读说明：本技术 与小体重鸡只厌食行为高度关联的肠道微生物标记物 (Intestinal microbial markers highly correlated with anorexia behavior in small-weight chickens ) 是由 周浩 孟和 杨凌宇 何川 丁金梅 徐珂 郑煜明 韩铖潇 罗怀希 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及与小体重鸡只厌食行为高度关联的肠道微生物标记物。所述标记物分别为Rhodovulum属Rhodovulum bhavnagarense菌种和Terrisporobacter属Terrisporobacter glycolicus菌种。该标记物在小体重鸡只肠道中富集,鸡只表现为厌食瘦小,该标记物的发现为微生物减肥产品的研发提供了参考,另外,可在家禽生产中,用于产蛋鸡体重的控制。(The present invention relates to gut biomarker highly correlated with anorexia behavior in small-weight chickens. The markers are Rhodovulum species and Terrisporabacterium species, respectively. The marker is enriched in intestinal tracts of chickens with small weight, and the chickens show anorexia and emaciation, and the discovery of the marker provides reference for the research and development of microbial weight-reducing products, and in addition, the marker can be used for controlling the weight of laying hens in poultry production.)

与小体重鸡只厌食行为高度关联的肠道微生物标记物

技术领域

本发明涉及微生物标记物领域，尤其是涉及一种与小体重鸡只厌食行为高度关联的肠道微生物标记物。

背景技术

在家禽养殖业中，母鸡过肥、过胖，很大程度上能影响到母鸡的正常产蛋量，影响经济收益。目前，肥胖也是人类心脑血管疾病、癌症、糖尿病等慢性病的重要诱因，被世界卫生组织列为威胁人类健康的十大疾病之一。近20来年，随着生活水平的提高，国人以令人瞠目的速度“胖”了起来，肥胖已经成为较为严重的社会问题。因此，寻找健康可行的控制肥胖的方法日益严峻。

众所周知，肠道微生物群落的多样性、组成、功能方面与宿主体重和机体代谢有很强的相关性。肠道微生物帮助宿主消化食物，对宿主的体重等表型有直接的影响。根据这些特点，有研究将肠菌作为食物制剂，用以改善和促进动物机体的健康发育。而动物的神经性厌食行为也与肠道微生物有很强的关系，肠道微生物通过肠-脑轴可引起宿主的厌食行为。另外，体重瘦小个体肠道微生物物种多样性也明显低于肥胖个体，根据肠菌的偏好性就可以很好的将肥胖的、瘦的个体鉴别，其准确性可达到90％，进一步说明了发现与动物体重和厌食行为显著相关的肠道微生物有较高的可行性。

事实上，发现并提供与动物小体重厌食行为显著关联的微生物标记物在家禽养殖和人类减肥产业中都具有重要意义。在未来，该类肠菌也可为研发体重控制类微生物制品提供参考素材，并且也可能用于家禽体重控制的微生态制剂。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种与小体重鸡只厌食行为高度关联的肠道微生物标记物。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种与小体重鸡只厌食行为高度关联的肠道微生物标记物，所述肠道微生物标记物包括Rhodovulum bhavnagarense菌种(巴夫纳根塞菌种)。

Rhodovulum bhavnagarense菌种属于Rhodovulum属。

Rhodovulum bhavnagarense菌种的具体分类学特征为：Bacteria；Proteobacteria；Alphaproteobacteria；Rhodobacterales；Rhodobacteraceae；Rhodovulum；Rhodovulum bhavnagarense(细菌界；变形菌门；甲型变形菌纲；红杆菌目；红杆菌科；小红卵菌属；巴夫纳根塞菌种)。

Rhodovulum bhavnagarense菌种含有的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

一种与小体重鸡只厌食行为高度关联的肠道微生物标记物，所述肠道微生物标记物包括Terrisporobacter glycolicus菌种(甘油利用泰瑞孢子菌种)。

Terrisporobacter glycolicus菌种属于Terrisporobacter属。

Terrisporobacter glycolicus菌种的具体分类学特征为：Bacteria；Terrabacteriagroup；Firmicutes；Clostridia；Clostridiales；Peptostreptococcaceae；Terrisporobacter；Terrisporobacter glycolicus(细菌界；地细菌亚界；厚壁菌门；梭状芽胞杆菌科；梭菌目；消化链球菌纲；土孢子杆菌属；甘油利用泰瑞孢子菌种)。

Terrisporobacter glycolicus菌种含有的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

所述与小体重鸡只厌食行为高度关联的肠道微生物标记物的筛选方法，包括以下步骤：

1)以白洛克鸡为共同祖先，以56日龄的体重高低为目标进行长期人工差异选择，保证体重这一饲养条件以及饲养环境都保持一致，以获得单一性状差异，在选择了56个世代后，获得的小体重家系鸡只具有明显的厌食瘦小的症状，并且体重平均只有大体重家系鸡只体重的十分之一(该模型为世界著名体重双向选择家系模型，Lillie M等人，Genomicsignatures of 60years of bidirectional selection for8-week body weight inchickens[J].Poultry science,2017,97(3):781-790)；

2)收集两种家系鸡肠道微生物样品，用试剂盒(TIANGEN DNA stool mini kit)提取肠道中微生物DNA，得到肠道微生物基因组DNA；

3)构建DNA文库后进行宏基因组测序；

4)分析鉴定小体重家系鸡只与大体重家系鸡只的肠道微生物物种及各物种丰度；

过滤原始序列中低质量序列，随后将序列与NCBI NR数据库中菌群序列进行比对，得到每个样品中各肠道微生物的物种的序列与丰度；

5)肠道微生物筛选

按照步骤2)-4)所述的方法测得大体重重家系鸡只及小体重家系鸡只体内肠道微生物种丰度，通过比较，得到最显著差异的肠道细菌Rhodovulum属Rhodovulumbhavnagarense菌和Terrisporobacter属中的Terrisporobacter glycolicus菌；

其中，过滤原始序列中低质量序列是指从reads的5'端开始，进行4个碱基的滑窗质量检测，切除碱基质量平均值低于2的滑窗；切除首末端碱基质量小于2的碱基；过滤碱基数小于25的碱基。

Rhodovulum属Rhodovulum bhavnagarense菌的P值＝0.000045，Terrisporobacter属中的Terrisporobacter glycolicus菌的P值＝0.0002。

步骤5)所述比较的方法是：不同分类水平的微生物在不同分组之间的丰度差异，用STAMP软件(v2.1.3)计算两组间丰度差异，该软件鉴定关键标记物的原理是：利用Welch’Test方法去筛选关键的微生物。检验结果中如一种微生物的矫正P值<0.01，则该微生物被判别为在两组中的分布有显著性差异，最后筛选出在小体重鸡只肠道中高丰度的且差异最为显著的两种细菌作为标记物。

另外需要指出的是，得到的菌群丰度表一般显示为微生物的绝对值丰度，因此，进行比较时，需要对数据进行标准化，采用的方法是将绝对丰度换算为相对丰度再进行差异分析。

与现有技术相比，本发明利用小体重且具有厌食行为的鸡只肠道微生物异于大体重鸡只肠道微生物的特性，筛选出能够用于与动物厌食行为有关的肠菌标记物。该标记物在小体重鸡只肠道中富集，鸡只表现为厌食瘦小，该标记物的发现为微生物减肥产品的研发提供了参考，另外，可在家禽生产中，用于产蛋鸡体重的控制。

附图说明

图1：Rhodovulum bhavnagarense菌种在大、小体重家系肠道中的丰度，H和L分别指大、小体重家系鸡只。

图2：Terrisporobacter glycolicus菌种在大小体重家系肠道中的丰度，H和L分别指大、小体重家系鸡只。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

1)以白洛克鸡为共同祖先，以56日龄的体重高低为目标进行长期人工差异选择，保证体重这一饲养条件以及饲养环境等都保持一致，以获得单一性状差异，在选择了56个世代后，获得的小体重家系鸡只具有明显的厌食瘦小的症状，并且体重平均只有大体重家系体重的约十分之一，选取长期选育的大小体重家系鸡只各10只，各包含公母鸡各5只(大体重公鸡1976±193g；大体重母鸡1598±166g；小体重公鸡174±46g；小体重母鸡128±37g)，小体重鸡只具有明显的厌食行为，取得肠道样本后提取肠道菌群DNA，具体步骤如下：微生物DNA提取严格按照产品试剂盒(TIANGEN DNA stool mini kit)说明书进行。提取微生物DNA后，用Nanodrop对DNA进行质量检测。DNA的OD值(260/280)为1.8-2.0左右且DNA浓度大于40ng/μl的样本符合本实验的DNA质量要求。然后，用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，将合适条带的DNA样本放入-20℃冰箱中保存，以备后续实验。

2)DNA文库构建和测序

DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳进行简单纯化实验。首先利用1％琼脂糖凝胶电泳检测检测肠道微生物DNA，随后将检测合格的微生物基因组DNA样品使用超声波样品处理系统随机打断，随后进行建库。测序得到的原始数据以双端(Paired-end)FASTQ格式保存(Read1和Read 2序列一一对应)，随后应用传统的trimmomatic软件(v0.32)将低质量的序列过滤删除，为了避免宿主基因组的污染，删除宿主基因组的序列。

3)基于宏基因组测序数据的微生物功能注释

质控后，将序列进行拼接合并，生成非冗余基因组集。同时利用Diamond将拼接的序列比对到NR数据库以获得肠道微生物组的组成和丰度。参数设置为序列全注释，e-value大于1e-5的序列截断、序列识别度小于90％的序列、以及氨基酸的注释长度低于20个的序列删除。得到微生物丰度后，进行数据标准化。用STAMP软件(v2.1.3)对各功能通路的标准化后的丰度数据进行大小体重肠道微生物间差异分析，软件内置检验方法为两侧Welch’st检验和benjamin-hochberg FDR校正。

4)根据比较分析的结果，证实了Rhodovulum bhavnagarense菌种(P值＝0.000045)和Terrisporobacter glycolicus菌种(P值＝0.0002)在小体重厌食鸡只中丰度显著高于大体重鸡只，如图1、图2所示。

实施例2

1)数据集建立

选择小体重鸡家系和大体重鸡家系分析所获丰度差异的肠道微生物，去除冗余或与不相关的肠道微生物；将总样本数的2/3作为训练集，总样本数的1/3作为验证集，将数据导入R语言软件(v3.6.1)，利用randomforest包(v4.6)构建随机森林模型。

2)训练模型并验证

将验证集导入构建的随机森林模型，发现预测错误率为零，说明模型可靠。将参与模型构建的重要变量菌导出。发现Rhodovulum bhavnagarense菌种和Terrisporobacterglycolicus菌种的MeanDecreaseGini值(对模型分类效应准确度的影响值)较大，分别是0.045和0.065，该两种菌可作为有效标记物用于小体重和大体重鸡的分类。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 与小体重鸡只厌食行为高度关联的肠道微生物标记物

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1067

<212> DNA

<213> Rhodovulum bhavnagarense

<400> 1

gccatcggct ggggcgaggg cgagatgttc gtgggctctg acgccatcgc gctggcaccg 60

ctgaccaacc gcatcactta tctcgaagaa ggcgaccgcg ccgtgatcac ccgcgcgggc 120

gcgcagatcc gcgatggcgc gggccgccct gtgatgcgcc cggtcaagac cgtcgagatc 180

gacctcgccc gcgccgagaa gggcgggcac aagcatttca tggccaagga aatcgccgaa 240

cagcccacgg tcatgggcga ggcgctgcgc cattacatca ccgatgacgg gcggcaactg 300

gtgctgcccg gtggcggcat cgatttttcg gggatcggcc ggatcaccat ggtggcctgc 360

ggcacggcct acctggcctg cctgacggcg aaatactgga tcgagcaact ggccggcctg 420

ccggtcgatg tcgatgtggc ctcggagttc cgctatcgcg aaccgccgat ccccgagggc 480

acgctggcgc tgttcgtcag ccagtcgggc gagaccgccg acacgctggc cgcgctacgc 540

tattgcaggg ggcgggcagc gcggatcgtg tcggtggtca acgtccccga aagcaccatg 600

gcgcgcgaaa gcgaccttgt gctgccgatc ctcgcaggcc cggaaatcgg cgttgcctca 660

accaaggcgt ttacctgcca attggcggtg ctcgcgcttt gcgcgcttga ggcggcatgc 720

cagcgcgggc ggcttgacgg cgatgggctg gcgcgtcggc tggaccagtt gacgattctg 780

ccggggcggc tgaacgcggc gctggccctt gagggggaca tcgcccgcgt tgccctcagc 840

ctggccgagg ccgacgacgt gctgttcctg gggcgtgggg cgatgttccc gctggcgctg 900

gagggggcgc tgaaactcaa ggaaatcagc tatatccacg ccgagggcta tgccagcggc 960

gagttgaaac acggccccat cgcgctggtg gacaagaccg tgccggtgat cgttctggcc 1020

ccccatgacc ggctgttcga caagacggtg tgcaacatgc aagaggt 1067

<210> 2

<211> 1273

<212> DNA

<213> Terrisporobacter glycolicus

<400> 2

ttgaggcaaa agatatttta gcatcttgca ttgcagtata tgttgccata aacattgatt 60

cacctgcaaa cattcttcct atacctttta gtaatccacc ttttgtattt gtttccattt 120

ttattccttc agtttggtaa aacatacctc cactttgtgt aaacatagac tcgcctcttg 180

atagacctac ttcaacactt ggtactactt ttcctacaat cacataattc attaaaattt 240

cccctaactt tcatttatat ttacaattta tttttctaat tatatattat tttctaggat 300

taagtcaatt gtctaacata ataagatatc attataattg tcccaattaa acaatccaat 360

gtatccatta tggcatcaac tagacctcct gtttgacagt tcattcctaa aaactcatct 420

acataaaatt ctataatttc ccaaagtcta gcactaccca tgttaaacat aaacataaat 480

atgactaaag ttataattaa catagtatca aaaagcttat caaatttttt atttagttga 540

cgatgtattt ttagattact ttataaagta taatgtgggg gcagtttttt ctgttgttca 600

aacatggtta gaaaatgatt taaatgaatc accataagaa atagtaacta taataaacaa 660

tattgttgct tttcatccat aacattatag ttcaattttt ccataataaa taattgggta 720

taccttacat acacccaatt attataaaat ttattatttt gttaatttga acttgttgga 780

atatatgatc ctatccttaa agcaaactca ttcatattca ttgtttgaag aactatctta 840

cctggacctg taagcttagt taaaagtaaa ccttcacctc caaagaatac ttgaccaaga 900

ccttttacaa attctacttc atatttaaca ctatcttcaa atcctactaa gttacctgta 960

tctattttta taacttctcc tggagctaag ttcatttcta ttgcatcacc gtctatctct 1020

aaaaatgcag ttcctctacc tcttagctct tgtagtataa atccttcacc tccaaagaat 1080

cctgttccca tctttttatt aaaaatagtt tttaactcta ctgaagactc tgccgcaagg 1140

aaagctcctt tttgtatagt aaagccacct tcactcacat ttataggtat tatacttcct 1200

ggtacagttg aggcaaaaga tattttagca tcttgcattg cagtatatgt tgccataaac 1260

attgattcac ctg 1273