阅读说明：本技术 一种用于检测microRNA分子表达的检测试剂及检测方法和试剂盒 (Detection reagent, detection method and kit for detecting microRNA molecular expression ) 是由 陈鹏 张永刚 吴义江 李玉林 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于检测microRNA分子的检测试剂,包括：用于检测miR-4448,miR-338-3p,miR-190-5p,miR-485-5p和/或miR-9-5p的正向检测引物和反向检测引物；其中,所述正向检测引物包括如序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列、SEQ ID NO.2所示的碱基序列、SEQ ID NO.3所示的碱基序列、SEQ ID NO.4所示的碱基序列和/或SEQ ID NO.5所示的碱基序列；所述反向检测引物为如序列表中的SEQ ID NO.6所示的碱基序列。本发明公开了一种用于检测microRNA分子的检测方法、试剂盒和应用。(The invention discloses a detection reagent for detecting microRNA molecules, which comprises: a forward detection primer and a reverse detection primer for detecting miR-4448, miR-338-3p, miR-190-5p, miR-485-5p and/or miR-9-5 p; wherein the forward detection primer comprises a base sequence shown as SEQ ID NO.1, a base sequence shown as SEQ ID NO.2, a base sequence shown as SEQ ID NO.3, a base sequence shown as SEQ ID NO.4 and/or a base sequence shown as SEQ ID NO.5 in a sequence table; the reverse detection primer is a base sequence shown as SEQ ID NO.6 in the sequence table. The invention discloses a detection method, a kit and application for detecting microRNA molecules.)

一种用于检测microRNA分子表达的检测试剂及检测方法和试 剂盒

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于检测microRNA分子表达的检测试剂及检测方法和试剂盒。

背景技术

小RNA(microRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，在转录后水平调控编码蛋白的基因的表达。许多研究已经表明，microRNA在糖网病的发生发展中参与了细胞增殖、血管增生和炎症应答等过程，扮演着重要的角色，而且循环外周血中的游离microRNA被认为是一种非常有前景的非侵入性生物标志物，尤其是在癌症及其靶向用药。目前关于microRNA的检测并不可见。

发明内容

本发明设计开发了一种用于检测microRNA分子表达的检测试剂，能够针对5种microRNA分子的检测。

本发明设计开发了一种用于检测microRNA分子表达的检测试剂盒，能够应用于对microRNA分子进行检测。

本发明设计开发了一种用于检测microRNA分子表达的检测方法，能够针对microRNA分子进行检测。

本发明提供的技术方案为：

一种用于检测microRNA分子表达的检测试剂，包括：用于检测miR-4448，miR-338-3p，miR-190-5p，miR-485-5p和/或miR-9-5p的正向检测引物和反向检测引物；

其中，所述正向检测引物包括如序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列、SEQ IDNO.2所示的碱基序列、SEQ ID NO.3所示的碱基序列、SEQ ID NO.4所示的碱基序列和/或SEQ ID NO.5所示的碱基序列；和

所述反向检测引物为如序列表中的SEQ ID NO.5所示的碱基序列。

一种用于检测microRNA分子表达的检测试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述的用于检测microRNA分子表达的检测试剂。

一种用于检测microRNA分子表达的检测方法，使用所述的用于检测microRNA分子表达的检测试剂盒通过逆转录荧光定量PCR检测方法反应检测。

优选的是，包括如下步骤：

步骤一、采集待检测全血后提取总RNA后进行质量控制检测；

步骤二、对通过所述质量控制检测的总RNA进行逆转录得到cDNA后，使用正向检测引物和反向检测引物进行逆转录荧光定量PCR反应扩增待检测microRNA分子；

步骤三、计算所述待检测microRNA的相对表达量后，再计算所述检测microRNA的加权值和加权和；

步骤四、当所述加权和小于50分时，所述待检测microRNA分子为低风险；当所述加权和不小于50分时，所述待检测microRNA分子为高风险；

其中，所述正向检测引物包括如序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列、SEQ IDNO.2所示的碱基序列、SEQ ID NO.3所示的碱基序列、SEQ ID NO.4所示的碱基序列和/或SEQ ID NO.5所示的碱基序列；和

所述反向检测引物为如序列表中的SEQ ID NO.6所示的碱基序列。

优选的是，在所述步骤一中，进行质量控制检测过程包括：检测所述总RNA的浓度OD260/280的比值，当浓度低于标准浓度或者OD260/280比值不属于标准区间时，所述质量控制为失败，重新进行提取检测，直到所述质量控制为成功后，得到通过所述质量控制检测的总RNA；

其中，所述标准浓度为50ng/ul；以及

所述OD260/280的标准区间为2.6～2.8。

优选的是，在所述步骤三中，所述待检测microRNA的相对表达量采用2^-ΔCt方法计算得出。

优选的是，在所述步骤三中，所述待检测microRNA的相对表达量的计算过程为：

其中，ΔC_t＝C_tmiRNA-C_tU6；

式中，C_t为实时荧光定量PCR反应荧光强度达到阈值的循环数，C_tmiRNA为对应待检测microRNA的循环数，C_tU6为对应作为内参的microRNA U6的循环数。

优选的是，在所述步骤三中，所述加权和的计算过程为：

式中，β_i为第i个microRNA的加权系数。

本发明与现有技术相比较所具有的有益效果：

1、经过检索文献，发明人并未发现已有的检测这5种microRNA的技术和试剂，本发明首次开发了针对这5种microRNA的检测试剂，具有原创性；

2、目前已知的microRNA表达量检测技术包括，高通量测序、基因芯片和实时荧光定量PCR技术，本发明所采用的实时荧光定量PCR技术相较于其他可用于检测microRNA的技术，具有更低的检测成本和更快的检出时间。

附图说明

图1为本发明所述的用于检测microRNA分子表达的检测方法的流程图。

图2为本发明所述的5个microRNA组合检测100个样本的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明提供了一种用于检测microRNA分子表达的检测试剂，其特征在于，包括：用于检测miR-4448，miR-338-3p，miR-190-5p，miR-485-5p和/或miR-9-5p的正向检测引物和反向检测引物；

其中，所述正向检测引物包括如序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列、SEQ IDNO.2所示的碱基序列、SEQ ID NO.3所示的碱基序列、SEQ ID NO.4所示的碱基序列和/或SEQ ID NO.5所示的碱基序列；

所述反向检测引物为如序列表中的SEQ ID NO.6所示的碱基序列。

一种用于检测microRNA分子表达的检测试剂盒，包括用于检测microRNA分子表达的检测试剂。

一种用于检测microRNA分子表达的检测方法，使用用于检测汉坦病毒的检测试剂盒通过逆转录荧光定量PCR检测方法反应检测，包括如下步骤：

步骤一、采集待检测全血后提取总RNA后进行质量控制检测；

步骤二、对通过所述质量控制检测的总RNA进行逆转录得到cDNA后，使用正向检测引物和反向检测引物进行逆转录荧光定量PCR反应制备待检测microRNA分子；

步骤三、计算所述待检测microRNA的相对表达量后，再计算所述检测microRNA的加权值和加权和；

步骤四、当所述加权和小于50分时，所述待检测microRNA分子为低表达；当所述加权和不小于50分时，所述待检测microRNA分子为高表达；

其中，所述正向检测引物包括如序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列、SEQ IDNO.2所示的碱基序列、SEQ ID NO.3所示的碱基序列、SEQ ID NO.4所示的碱基序列和/或SEQ ID NO.5所示的碱基序列；和

所述反向检测引物为如序列表中的SEQ ID NO.5所示的碱基序列。

在另一种实施例中，在步骤一中，进行质量控制检测过程包括：检测所述总RNA的浓度OD260/280的比值，当浓度低于标准浓度或者OD260/280的比值不属于标准区间时，所述质量控制为失败，重新进行提取检测，知道所述质量控制为成功后，得到通过所述质量控制检测的总RNA；其中，所述标准浓度为50ng/ul，标准区间为2.6～2.8。

在另一种实施例中，在步骤三中，待检测microRNA的相对表达量采用2^-ΔCt方法计算得出。

在另一种实施例中，在步骤三中，待检测microRNA的相对表达量的计算过程为：

ΔC_t＝C_tmiRNA-C_tU6；

式中，C_t为实时荧光定量PCR反应荧光强度达到阈值的循环数，C_tmiRNA为对应待检测microRNA的循环数，C_tU6为对应作为内参的microRNA U6的循环数；

加权和的计算过程为：

式中，β_i为第i个microRNA的加权系数。

下面结合具体的对本发明做进一步的具体说明。

以下通过具体的实施例来说明本发明的实施方式，该实例是对本发明实施方式的一个举例，并不意味着本发明的实现仅限于这种实施方式。本发明可以在不脱离其主旨的范围内，使用多种方式实现，包括但不限于逆转录荧光定量PCR，测序，飞行质谱等。

实施例

1、样本采集

将待测样品收集在2ml离心管里，在室温下1000g离心10分钟，取上清液至另一个2ml离心管。

2、提取总RNA

RNA抽提所用试剂：TRIzol LS Reagent(Invitrogen life technologies)；氯仿(上海化学试剂有限公司)；异丙醇(上海化学试剂有限公司)；100％乙醇(上海化学试剂有限公司)；75％乙醇(以DEPC处理的水配制)；冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)；无RNA酶的水；无RNA酶的糖原(Invitrogen life technologies)；

RNA抽提所用仪器设备：低温离心机；无RNA酶的1.5ml离心管；无RNA酶的15ml离心管；移液器；无RNA酶的灭菌吸头；

RNA抽提步骤：

步骤1、匀浆：从-80℃冰箱中取出血浆样品，解冻后于4℃、12000×g离心10分钟，去除可能存在的杂质，取250ul血浆液体，转至1.5ml的离心管中，750μl的TRIzol LSReagent试剂和20μl冰醋酸，手动剧烈振荡管体至混匀；

步骤2、两相分离：匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离；每750μl的TRIzol LS Reagent试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖；手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟；4℃下12000×g离心15分钟；离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相；RNA全部被分配于水相中；水相的体积大约使匀浆时加入的TRIzol LS Reagent的60％。

步骤3、RNA沉淀：将水相转移到新离心管中，并加入500μl异丙醇,然后加入5ul的糖元溶液(Ambion公司货号AM9510)混匀以沉淀其中的RNA(糖元能使RNA沉淀更容易被识别)。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃，12000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块；

步骤4、RNA清洗：移去上清液，750μl的TRIzol LS Reagent试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀；振荡后，4℃，7500×g离心5分钟；

步骤5、重新溶解RNA沉淀：去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥；注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性，部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6；溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟，获得的RNA溶液保存于-80℃。

总RNA质控：使用带有微量上样板的多功能酶标仪测定抽提的总RNA的质量和浓度；RNA浓度为50ng/ul以上，OD260/280比值在1.6-2.2之间为质控标准；浓度低于标准或者260/280比值在区间之外为质控失败样品，将加大血浆的体积重复抽提的过程。

3、逆转录反应

使用Tiangen公司的mirCute miRNA First-strand cDNA合成试剂盒；

仪器设备：PCR仪；冰盒；无RNA酶的200ul PCR管；移液器一套；海尔低温保存箱；

逆转录步骤：

步骤1、解冻2×miRNA RT Reaction Buffer并混匀，miRNA RT Enzyme置于冰上备用；

步骤2、冰上预冷RNase Free反应管；

步骤3、将总RNA稀释一倍；

步骤4、如表1所示，按照试剂盒说明书配置反应体系；

表1配置反应体系

步骤5、逆转录反应条件：42℃，60min；95℃，3min终止反应；合成的cDNA放置于-20℃保存；如表2所示，逆转录PCR引物序列如序列表中的SEQ ID NO.7所示的碱基序列。

4、microRNA分子的相对定量

仪器设备：荧光定量PCR仪；移液器；96孔PCR反应板及封板膜；

本发明采用microRNA U6作为相对定量的内部参照，其他microRNA的相对表达量为相对于U6表达量的倍数；

实验步骤：

步骤1、室温融化2×miRcute Plus miRNA PreMix、50×ROX Reference Dye和Reverse Primer；

步骤2、将2×miRcute Plus miRNA PreMix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，轻微离心；

步骤3、将cDNA稀释50倍；

步骤4、将试剂置于冰上，并按下表配制反应体系：冰上操作，用移液器轻轻混匀，贴上封板膜，1000rpm，4℃，2分钟；

步骤5、使用正向检测引物和反向检测引物进行逆转录荧光定量PCR反应制备待检测microRNA分子；RT-qPCR条件：95℃，15min；94℃，20sec，60℃，30sec，40个循环；

其中，如表2所示，正向检测引物包括如序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列、SEQ ID NO.2所示的碱基序列、SEQ ID NO.3所示的碱基序列、SEQ ID NO.4所示的碱基序列和/或SEQ ID NO.5所示的碱基序列；反向检测引物为如序列表中的SEQ ID NO.6所示的碱基序列；

表2引物序列表

步骤6、采用2^-ΔCt方法计算各microRNA的相对表达量。

5、计算检测microRNA分子表达和评分，确定风险

采用加权值求和的方式计算评分：

首先，计算每个microRNA的加权值，即取得以2为底的相对表达量的对数值，与加权系数相乘，乘积即为加权值；

然后，将各个microRNA的加权值相加，取得加权和；

其中，待检测microRNA的相对表达量的计算过程为：

ΔC_t＝C_tmiRNA-C_tU6；

式中，C_t为实时荧光定量PCR反应荧光强度达到阈值的循环数，C_tmiRNA为对应待检测microRNA的循环数，C_tU6为对应作为内参的microRNA U6的循环数；

加权和的计算过程为：

式中，β_i为第i个microRNA的加权系数；

最后，如果加权和小于零则取零，如果加权和大于100则取100；当加权和小于50分时，即为低风险；当所述加权和不小于50分时，即为高风险。

如图2所示，通过使用本发明的检测试剂的5个microRNA组合检测100个样本的ROC曲线。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 魔方基因科技有限公司

吉林大学

<120> 一种用于检测microRNA分子表达的检测试剂及检测方法和试剂盒

<130> 2010

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成，以用作得到miR-4448的编码序列的正向检测引物

<400> 1

gcggctcctt ggtctagggg ta 22

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成，以用作得到miR-338-3p的编码序列的正向检测引物

<400> 2

ggcctccagc atcagtgatt ttgttg 26

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成，以用作得到miR-190-5p的编码序列的正向检测引物

<400> 3

gggcgcggtg atatgtttga tatattaggt 30

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成，以用作得到miR-485-5p的编码序列的正向检测引物

<400> 4

ccagaggctg gccgtgatga attc 24

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成，以用作得到mir-9-5p的编码序列的正向检测引物

<400> 5

ggccgtcttt ggttatctag ctgtatga 28

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成，以用作得到通用的编码序列的反向检测引物

<400> 6

gatcgccctt ctacgtcgta t 21

<210> 7

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成，以用作得到逆转录PCR的编码序列

<400> 7

gatcgccctt ctacgtcgta tcgtcatctg accgttatcg ctgcacgttt tttttttttt 60

ttttttt 67