用于确定氯吡格雷用药疗效相关的基因snp检测试剂盒
阅读说明：本技术 用于确定氯吡格雷用药疗效相关的基因snp检测试剂盒 (Gene SNP detection kit for determining related therapeutic effect of clopidogrel medication ) 是由 秦胜营 张素丽 朱金行 张娜 贺林 于 2019-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于确定氯吡格雷用药疗效相关的基因SNP检测试剂盒,所述试剂盒包括MassARRAY芯片、检测基因P2Y12基因的rs16863356,rs7634096和rs12497330 3个SNP位点各三条引物分别称为正向引物,反向引物以及延伸引物,其序列依次分别如SEQ ID No.1～9,其中引物是用于鉴别氯吡格雷药效和不良反应相关基因的多态性位点。本发明的试剂盒可对上述三个位点进行高通量检测,具有灵敏度高、特异性高、检测结果稳定、可靠性高等优点；同时,适用于临床疾病突变检测,药物基因组学分析、法医学鉴定等基因分析领域。(The invention discloses a gene SNP detection kit for determining clopidogrel medication curative effect correlation, which comprises a MassARRAY chip, three primers of rs16863356, rs7634096 and rs 124973303 SNP loci for detecting gene P2Y12, wherein the three primers are respectively called as a forward primer, a reverse primer and an extension primer, the sequences of the primers are respectively shown as SEQ ID No. 1-9, and the primers are polymorphic loci for identifying clopidogrel drug effect and adverse reaction correlation genes. The kit can carry out high-throughput detection on the three sites, and has the advantages of high sensitivity, high specificity, stable detection result, high reliability and the like; meanwhile, the method is suitable for the gene analysis fields of clinical disease mutation detection, pharmacogenomics analysis, forensic medicine identification and the like.)
技术领域
本发明属于基因技术领域，涉及一种用于确定氯吡格雷用药疗效相关的基因多态性(SNP)的检测试剂盒。
背景技术
氯吡格雷(Clopidogrel)化学名为(S)-α-(2-氯苯基)-6,7-二氢噻吩并[3,2-C]吡啶-5(4H)-乙酸甲酯，分子式C16H16ClNO2S。氯吡格雷是国内一种新型且广泛使用的治疗心脑血管疾病特别是急性冠状动脉综合征及经皮冠状动脉介入治疗的首选药物。同时，氯吡格雷作为一种噻吩并吡啶类抗血小板药物在结构特点和功能上有一定特性，且临床不良事件较其他抗凝药有一定优势，因此被认为是心脑血管疾病治疗过程重要考虑的抗血小板药物。近年来，随着深入研究结合临床观察表明，心脑血管疾病患者在接受正规氯吡格雷用药的抗血小板治疗仍然存在不良临床事件的发生，其中最常见的有心肌梗死，脑卒中，支架内血栓甚至死亡等临床事故。
心脑血管疾病是一种相对复杂的慢性疾病，它是由环境因素等非遗传因素(年龄、身高、体重，药物的相互作用，饮食习惯等)与遗传因素等多个因素相互作用的结果，其中遗传因素在该过程发挥核心主导作用从而导致的个体差异，是与氯吡格雷的药动学和药效学有关的蛋白或酶的基因突变，有效蛋白表达和酶的活性，从而增强或降低氯吡格雷的疗效。因此，为达到药物的最佳治疗效果即提高药物有效性或者减少药物不良反应的发生，同时深入挖掘氯吡格雷药效及不良反应相关生物标记已经显得越来越重要，也成为亟需解决的社会健康问题。
氯吡格雷作用途径首先是口服进入肠道吸收，整个过程伴随P-糖蛋白(ABCB1基因编码)转运，利用细胞色素酶CYP450活化作用使最终被激活代谢产物一定程度上定向选择与血小板表面ADP受体P2Y12直接进行不可逆地结合，达到阻断血小板活性增强效应的目的，进而抑制后续ADP介导GPⅡb/Ⅲa复合物的活化，最终使得血小板激活以及聚集作用受到抑制。对现有文献的检索，P2Y12基因位于人类第3号染色体q25.1上的作为氯吡格雷代谢过程中最终结合受体即药物靶点P2Y12基因多态性，但在中国人群中之前并未发现P2Y12rs16863356,rs7634096和rs12497330为氯吡格雷药效分子标记的相关报道。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种用于确定氯吡格雷用药疗效相关的基因SNP检测试剂盒；具体而言是利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对氯吡格雷药物疗效和不良反应相关的P2Y12基因3个基因多态性位点进行检测的方法及相应的试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，
第一方面，本发明涉及一种检测与氯吡格雷用药疗效相关的基因多态性位点的引物组，包括：
检测外周血DNA中rs16863356的序列如SEQ ID No:2、SEQ ID No:5示的PCR引物，以及序列如SEQ ID No:8所示的延伸引物；
检测外周血DNA中rs7634096的序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:4示的PCR引物，以及序列如SEQ ID No:7所示的延伸引物；
检测外周血DNA中rs12497330的序列如SEQ ID No:3、SEQ ID No:6示的PCR引物，以及序列如SEQ ID No:9所示的延伸引物。
各位点对应的延伸引物及延伸引物分子量如下表1所示：
延伸引物
位点
延伸引物分子量
SEQ ID No:7
rs7634096
6106
SEQ ID No:8
rs16863356
7369.8
SEQ ID No:9
rs12497330
8526.6
本发明的引物是在基因分型MassARRAY平台设计,相对以往技术更高效精准，高通量。
第二方面，本发明涉及一种用于氯吡格雷个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒，包括前述的引物组。
作为试剂盒的一个实施方案，所述试剂盒还包括检测试剂、检测芯片以及检测载体。
所述检测试剂包括PCR混合反应液、SAP酶mix反应液和UEP延伸mix反应液。
作为试剂盒的一个实施方案，所述试剂盒还包括纯化用树脂、点样以及质谱检测用靶片和人基因组DNA提取试剂。
第三方面，本发明还涉及一种前述的用于氯吡格雷个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒的非诊断目的使用方法，所述方法包括如下步骤：
S1、利用所述引物组进行PCR引物稀释和UEP延伸引物稀释；
S2、PCR反应；
S3、SAP消化反应；
S4、UEP延伸反应；
S5、树脂纯化。
步骤S2中，所述PCR反应采用的PCR混合反应液中包含去离子水、PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、耐热Taq DNA聚合酶，扩增引物mix。
步骤S3中，所述SAP消化反应采用的SAP酶mix反应液中包含去离子水、SAP Buffer以及SAP酶。
步骤S4中，所述UEP延伸反应采用的UEP延伸mix反应液中包含去离子水、GoldBuffer、Termination mix、UEP引物mix以及耐高温的延伸酶。
步骤S5中，将纯化用树脂落入步骤S4制得的装有单碱基延伸产物中。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明综合了多重PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术，放大检测模板的同时又可检测微量样本，因此检测灵敏度很高；
2、单碱基延伸又称为微测序，使用特异性探针对DNA进行识别，特异性好，假阳性低等优点；
3、高通量测序技术使得速度快，效率高，可在3-4小时完成数百个样本检测；
4、操作比较简单，同时在自动化操作下，降低污染的发生；
5、本发明可对多个患者检测，可以同时得到不同基因位点信息；
6、本发明克服了以往技术一次检测少量SNP位点的高成本缺陷；
7、本发明为研究我国人群P2Y12基因多态性与临床用药安全的关系奠定了基础，为临床个体化用药提供理论基础，同时也为基于药物基因组学理念的新药研发提供指导依据。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：引物设计及合成
针对P2Y12基因rs16863356、rs7634096和rs12497330位点3个与氯吡格雷用药相关的基因多态性位点，设计对应特异性PCR引物序列(SEQ ID No:1至SEQ ID No:6)和特异性延伸引物序列(SEQ ID No:7至SEQ ID No:9)；具体如表2：
表2
编号
针对位点
序列(5'-3')
用途
SEQ ID No:1
rs7634096
ACGTTGGATGTAAAATAGGTCCTCAGACCC
PCR正向引物
SEQ ID No:2
rs16863356
ACGTTGGATGTGAGTCTTAGCAACTGAAGG
PCR正向引物
SEQ ID No:3
rs12497330
ACGTTGGATGCACTTTATATACATACCCTG
PCR正向引物
SEQ ID No:4
rs7634096
ACGTTGGATGCATCCCTGTCTCTCACAAAG
PCR反向引物
SEQ ID No:5
rs16863356
ACGTTGGATGACAAGTGTGTCAGGAATACC
PCR反向引物
SEQ ID No:6
rs12497330
ACGTTGGATGCACAGTCAAAATGTAGACAC
PCR反向引物
SEQ ID No:7
rs7634096
ACAGGGTTGTTTTGCCTTCT
延伸引物
SEQ ID No:8
rs16863356
TGTATCAGGAATACCAATACTGAA
延伸引物
SEQ ID No:9
rs12497330
CCCTGAAGGTAATTTTATTTTTCTCTTG
延伸引物
实施例2、样本DNA提取
将抽取的5ml血液收集在含有3.2％柠檬酸三钠和肝素锂的真空采血管中，并静置至少6小时。将采血管倒置3-5次以确保血液与抗凝血剂充分混合。采用
实施例3、生物学实验
使用ABI 9700型PCR仪，按说明书对3个与氯吡格雷药效相关的基因多态性进行检测；涉及到的试剂如表3所示：
表3
1、PCR反应条件：95℃，2min；45个循环(95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s)；72℃，5min。
2、SAP消化反应条件：37℃，40min；85℃，5min。
3、UEP延伸反应条件：94℃，30s；40个外部循环(94℃，5s；5个内部循环(52℃，5s；80℃，5s))；72℃，3min。
4、纯化：每管延伸产物中加入16μL去离子水，放入MassARRAY试剂盒树脂至混合均匀，离心。
5、点样：使用微量移液器，1μL纯化产物至靶片点样。
6、上机检测：点样机械臂24个针用NaOH清洗；点样；质谱检测。
经分析发现，P2Y12(rs16863356,rs7634096,rs12497330)与NPR(正常血小板活性)有显著个体差异(表4)。
表4
Gene
SNP
Allele
OR(95％CI)
P
2
P2Y12
rs16863356
A
G
0.584(0.375-0.909)
0.016
5.769
HPR,n(％)
37(13.70)
233(96.30)
NPR,n(％)
65(21.38)
239(78.62)
P2Y12
rs7634096
T
C
0.592(0.383-0.915)
0.017
5.646
HPR,n(％)
39(14.55)
229(85.45)
NPR,n(％)
67(22.33)
233(77.67)
P2Y12
rs12497330
A
G
0.497(0.333-0.742)
0.00056
11.9
HPR,n(％)
105(0.625)
63(0.375)
可见，P2Y12中rs16863356,rs7634096,rs12497330三个SNP位点在氯吡格雷用药病人中的个体差异显著。
综上所述，本发明为我国心脑血管人群中P2Y12基因多态性与临床指导用药提供理论和预后基础，为个体化药物基因组学奠定遗传学基础。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 用于确定氯吡格雷用药疗效相关的基因 SNP检测试剂盒
<130> DAG41295
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg taaaataggt cctcagaccc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg tgagtcttag caactgaagg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg cactttatat acataccctg 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg catccctgtc tctcacaaag 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg acaagtgtgt caggaatacc 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgttggatg cacagtcaaa atgtagacac 30
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acagggttgt tttgccttct 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtatcagga ataccaatac tgaa 24
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccctgaaggt aattttattt ttctcttg 28