阅读说明：本技术 用于y染色体微缺失检测的引物组、试剂盒及基于数字pcr的检测方法 (Primer group and kit for detecting microdeletion of Y chromosome and detection method based on digital PCR ) 是由 殷建 尹焕才 袁通阔 刘荻 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于Y染色体微缺失检测的引物组、试剂盒及基于数字PCR的检测方法。本发明针对AZFa亚区sY84和sY86位点,AZFb亚区sY127和sY134位点,AZFc亚区sY254和sY255位点设计了引物组,且其具有高灵敏度、准确客观的优点。本发明提供的检测方法可快速、高灵敏且高准确度地检测无精子症病人的Y染色体微缺失情况,并可有效降低对样本量的要求,从而可将外周血采集进一步降低至指尖血,减小病人痛苦,且可避免病人DNA样本较少时造成的假阴性结果；本发明采用数字PCR方法进行检查,检测结果不依赖于Ct值即可获得,并可直观反映DNA样本的原始拷贝数,从而减少了检测者的工作量。(The invention discloses a primer group and a kit for detecting microdeletion of a Y chromosome and a detection method based on digital PCR. The invention designs a primer group aiming at the sites sY84 and sY86 of the AZFa subregion, the sites sY127 and sY134 of the AZFb subregion and the sites sY254 and sY255 of the AZFc subregion, and has the advantages of high sensitivity, accuracy and objectivity. The detection method provided by the invention can quickly, highly sensitively and accurately detect the Y chromosome microdeletion condition of the azoospermia patient, and can effectively reduce the requirement on the sample volume, thereby further reducing the peripheral blood collection to the fingertip blood, reducing the pain of the patient, and avoiding the false negative result caused by less DNA samples of the patient; the invention adopts a digital PCR method for inspection, the detection result can be obtained without depending on the Ct value, and the original copy number of the DNA sample can be visually reflected, thereby reducing the workload of a detector.)

用于Y染色体微缺失检测的引物组、试剂盒及基于数字PCR的 检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种用于Y染色体微缺失检测的引物组、试剂盒及基于数字PCR的检测方法。

背景技术

***不育是全球重要的生殖健康问题，大约15％的夫妇会遭遇生育困难或者无法生育的困境，而30％～50％的不育症是由于男性无精或少精等原因引起。当前，男性不育的一个重要原因就是染色体结构异常以及染色体基因的微缺失。临床结果表明，原发性无精和少精症患者中约10％～15％存在Y染色体微缺失，且这一症状可随着辅助生殖技术传递给下一代。因此Y染色体微缺失检测对男性生殖遗传学临床治疗、提高辅助生殖技术的疗效和安全性以及开展胚胎植入前遗传学诊断具有重要意义。

传统Y染色体微缺失的检测方法主要在PCR技术的基础上展开。国内临床实验室多依据欧洲男科协会(European Academy of Andrology，EAA)和欧洲分子遗传质量协作网(European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)提出的方案，采集外周血标本进行多重PCR凝胶电泳、荧光定量(q)PCR以及毛细管电泳等方法进行检测。但这些技术耗时长，结果判定主观性较大，灵敏度较低，不符合目前临床检验技术更快、更灵敏、样品需求更少的发展方向。

数字PCR是20世纪初发展起来的新型核酸定量技术，与传统PCR相比，其可对微量模板进行绝对定量分析，具有更高的准确性、特异性、灵敏性和检测速度。与此同时，数字PCR检测和分析过程自动化程度也比较高，减少了人工结果判定的误差，更减少了荧光定量PCR检测由于低拷贝数检测不到而导致对结果的误判。所以，将数字PCR用于Y染色体微缺失检测是一个研究方向，但现有技术中缺失相关方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于Y染色体微缺失检测的引物组、试剂盒及基于数字PCR的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：提供一种用于Y染色体微缺失检测的引物组，包括以下引物组：

用于检测SY84位点的引物对，序列为：

上游引物AGAAGCGTCTGATAGCAGGT，下游引物GCCTACTACCTGGAGGCTTC；

用于检测SY86位点的引物对，序列为：

上游引物GTGACACACAGACTATGCTTC，下游引物ACACACAGAGTGACAACACT；

用于检测SY127位点的引物对，序列为：

上游引物GGCTCACAAACGACGAGAAA，下游引物CTGCAGGCAGTAATAAGTGA；

用于检测SY134位点的引物对，序列为：

上游引物GTCTGCCTCACCATATCACG，下游引物ACCACTGCCAAAACTGTCAA；

用于检测SY254位点的引物对，序列为：

上游引物TGGTGTTACCAGAAGGCAAA，下游引物GAACCGTATCTACCATAGCAGC；

用于检测SY255位点的引物对，序列为：

上游引物GTTACAGGATTCGGCGTGAT，下游引物CTCGTCATGTGCAGCGAC。

本发明的另一个目的是提供一种用于Y染色体微缺失检测的试剂盒，其包括如上所述的引物组。

优选的是，所述试剂盒还包括：PCR预混液、阳性对照、阴性对照和微滴生成油。

优选的是，所述PCR预混液包括染料、Taq酶、dNTP、MgCl₂。

优选的是，所述Taq酶反应浓度为6U，dNTP的反应浓度为0.8mM，MgCl₂终浓度为5.6mM。

优选的是，所述阳性对照为：健康成年男性的外周血中获得的血细胞DNA，浓度为：10-80ng/ul，所述阴性对照为无菌去离子水。

本发明还提供一种用于Y染色体微缺失检测的基于数字PCR的检测方法，该方法利用如上所述的试剂盒，通过数字PCR的方法，进行Y染色体微缺失检测。

优选的是，本发明的方法包括以下步骤：

1)采集待测病人的血液，进行DNA提取，获得待测DNA样本；

2)将获得的DNA样品与PCR预混液、引物组、无菌水均匀混合；

3)将步骤2)得到的混合液生成微滴；

4)将生成的微滴置于数字PCR扩增仪中进行扩增，获得PCR产品；

5)使用微滴读数仪对获得的PCR产品进行检测分析。

优选的是，所述步骤1)中，待测DNA样本的浓度≥0.0001ng/ul。

优选的是，所述步骤4)中，PCR扩增程序为：酶激活95℃，保持5分钟；然后95℃保持30秒、60℃保持1分钟，并进行40个循环；4℃保持5分钟；90℃保持5分钟。

本发明的有益效果是：

本发明的可快速、高灵敏且高准确度地检测无***症病人的Y染色体微缺失情况，并可有效降低对样本量的要求，从而可将外周血采集进一步降低至指尖血，减小病人痛苦，且可避免病人DNA样本较少时造成的假阴性结果；

本发明采用数字PCR方法进行检查，检测结果不依赖于Ct值即可获得，并可直观反映DNA样本的原始拷贝数，从而减少了检测者的工作量；

本发明获得的试剂盒可在-20℃下稳定保存半年以上，具有良好的产品开发潜质。

附图说明

图1为本发明的实施例2中AZFb缺失病人外周血样本的检测结果示意图；

图2为本发明的实施例2中AZFb缺失样本进行荧光定量PCR检测的结果示意图；

图3a、3b、3c分别为本发明的实施例3中采用荧光定量PCR方法检测浓度依次为10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul的样本的结果图；

图4a、4b、4c为本发明的实施例3中采用基于数字PCR的检测方法检测浓度依次为0.001ng/ul、0.0001ng/ul、0.00001ng/ul的样本的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

设计一种用于Y染色体微缺失检测的引物组，用以检测AZFa亚区sY84和sY86位点，AZFb亚区sY127和sY134位点，AZFc亚区sY254和sY255位点的基因缺失，其具体包括以下引物组合：

用于检测SY84位点的引物对，序列为：

上游引物AGAAGCGTCTGATAGCAGGT，下游引物GCCTACTACCTGGAGGCTTC；

用于检测SY86位点的引物对，序列为：

上游引物GTGACACACAGACTATGCTTC，下游引物ACACACAGAGTGACAACACT；

用于检测SY127位点的引物对，序列为：

上游引物GGCTCACAAACGACGAGAAA，下游引物CTGCAGGCAGTAATAAGTGA；

用于检测SY134位点的引物对，序列为：

上游引物GTCTGCCTCACCATATCACG，下游引物ACCACTGCCAAAACTGTCAA；

用于检测SY254位点的引物对，序列为：

上游引物TGGTGTTACCAGAAGGCAAA，下游引物GAACCGTATCTACCATAGCAGC；

用于检测SY255位点的引物对，序列为：

上游引物GTTACAGGATTCGGCGTGAT，下游引物CTCGTCATGTGCAGCGAC。

上述引物组合具有与Y染色体微缺失的6个位点有及其强的互补配对性质，确保目标位点的准确性。

实施例2

构建一种用于Y染色体微缺失检测的试剂盒，该试剂盒包括实施例1所述的引物组。进一步优选的实施例中，所述试剂盒还包括：PCR预混液、阳性对照、阴性对照和微滴生成油。

其中，所述PCR预混液包括染料、Taq酶、dNTP、MgCl₂。更具体的，染料为：EvaGreen染料2x(20x EvaGreen染料稀释10倍)0，所述Taq酶反应浓度为6U，dNTP的反应浓度为0.8mM，MgCl₂终浓度为5.6mM。

其中，所述阳性对照为：健康成年男性的外周血中获得的血细胞DNA，浓度为：10-80ng/ul，所述阴性对照为无菌去离子水(不含有DNA和RNA)。

微滴生成油，QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen，购自美国伯乐公司。

实施例3

提供一种用于Y染色体微缺失检测的基于数字PCR的检测方法，该方法利用实施例2获得的试剂盒，通过数字PCR的方法，进行Y染色体微缺失检测。其具体包括以下步骤：

1)采集待测病人的外周血或指尖血，体积范围：50μl-500μl，可采用通用核酸柱式抽提试剂盒(上海生工，B518253-0050)进行DNA提取，所获得DNA经紫外(260nm)吸收检测获得浓度及纯度，获得待测DNA样本，其浓度≥0.0001ng/ul；

2)将获得的DNA样品与PCR预混液、引物组、无菌水均匀混合，体积分别为10ul PCR预混液、0.4ul引物组(10uM)、2ul DNA提取液为、7.2ul无菌水为，旋涡混匀后保持在4℃待用；

3)将步骤2)得到的混合液生成微滴，具体为：

将微滴生成卡放入座，向中间一排细孔中每孔加入20ul反应体系；将微滴生成油70ul每孔加入生成卡最下面一排；在卡座上装好密封垫后，放入微滴生成仪；微滴生成结束后，缓慢从最上面一排孔中吸出微滴转移到八连管中；如图，为微滴生成卡，微滴生成油加到最下面一排，混合均匀的待测液加到中间一排，在微滴生成仪生成之后，生成的微滴在最上面一排，温和地将生成好的微滴转移到八连管当中，进行后续操作；

4)将生成的微滴置于数字PCR扩增仪中进行扩增，PCR扩增程序为：酶激活95℃，保持5分钟；然后95℃保持30秒、60℃保持1分钟，并进行40个循环；信号稳定4℃保持5分钟；90℃保持5分钟；获得PCR产品；

5)使用微滴读数仪对获得的PCR产品进行检测分析：将八联管盖子去掉，放入微滴读数仪器内，扣上固定锁扣，关闭舱门；设置实验参数、样本名称和目标物名称，Supermix选择EvaGreen；运行程序进行检测。检测结果如图1和2所示。图1为AZFb缺失病人外周血样本的检测结果，其中的待测DNA样本的浓度为0.0001ng/ul。图2为AZFb缺失样本进行荧光定量PCR检测的结果，图中AZFb为两条直线。

本发明的检测方法相对于常规荧光定量PCR而言，可直观反映DNA样本的原始拷贝数，从而减少了检测者的工作量，并且检测限更低，具有更高的灵敏度。在本实施例中进行了采用常规荧光定量PCR与本发明的基于数字PCR的检测方法的比较。其中，两者方法均采用实施例2获得的试剂盒。其中的待测DNA样本均相同，为健康成年男性的外周血中获得的血细胞DNA，即Y染色体不存在缺失。

参照图3a、3b、3c，均采用荧光定量PCR方法，待测DNA样本的浓度依次为10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul，然后根据目前对qPCR(荧光定量PCR)的测试的水平，基本在Ct32之前没有成功起跳就算是没有目标基因的存在，从图中可以看出，浓度为10ng/ul、1ng/ul时，Ct32之前成功起跳，可实现检测，浓度0.1ng/ul时，没有成功，无法实现检测，所以此实施例中，qPCR的检测下限为0.1ng/ul。

参照图4a、4b、4c，均采用发明的基于数字PCR的检测方法，待测DNA样本的浓度依次为0.001ng/ul、0.0001ng/ul、0.00001ng/ul，从图中可以看出，0.0001ng/ul时仍能检测到结果，0.00001ng/ul时存在AZFb位点未检测到结果，所以该方法检测限能达到0.0001ng/ul，远远低于qPCR的0.1ng/ul，能突显本发明的检测方法的高灵敏度的优势。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

发明名称：用于y染色体微缺失检测的引物组、试剂盒及基于数字pcr的检测方法

用于检测SY84位点的引物对，序列为：

上游引物AGAAGCGTCTGATAGCAGGT，下游引物GCCTACTACCTGGAGGCTTC。

用于检测SY86位点的引物对，序列为：

上游引物GTGACACACAGACTATGCTTC，下游引物ACACACAGAGTGACAACACT。

用于检测SY127位点的引物对，序列为：

上游引物GGCTCACAAACGACGAGAAA，下游引物CTGCAGGCAGTAATAAGTGA。

用于检测SY134位点的引物对，序列为：

上游引物GTCTGCCTCACCATATCACG，下游引物ACCACTGCCAAAACTGTCAA。

用于检测SY254位点的引物对，序列为：

上游引物TGGTGTTACCAGAAGGCAAA，下游引物GAACCGTATCTACCATAGCAGC。

用于检测SY255位点的引物对，序列为：

上游引物GTTACAGGATTCGGCGTGAT，下游引物CTCGTCATGTGCAGCGAC。