异吲哚酮类化合物在制备防治溶骨性疾病药物中的应用
阅读说明：本技术 异吲哚酮类化合物在制备防治溶骨性疾病药物中的应用 (Application of isoindolone compound in preparation of medicine for preventing and treating osteolytic diseases ) 是由 顾琼 佘志刚 华沛 崔辉 蔡润林 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了异吲哚酮类化合物在制备防治溶骨性疾病药物中的应用。该异吲哚酮类化合物具有式(I)所示结构：<Image he="548" wi="700" file="DDA0002207783820000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>该异吲哚酮类化合物可显著性抑制RANKL诱导的骨髓源巨噬细胞BMMs向破骨细胞分化的能力和破骨细胞的骨吸收能力,且呈浓度依赖性；后续机制研究发现,异吲哚酮类化合物通过阻碍RANKL诱导的MAPK和PI3K/AKT信号转导通路的激活来抑制转录因子NFATc1的表达,从而下调破骨细胞相关基因的表达,发挥抑制破骨细胞分化和骨吸收的能力。此外,异吲哚酮类化合物不影响成骨细胞的分化,揭示了异吲哚酮类化合物在防治溶骨性疾病中的应用,可以与常规药用载体制成的药物组合物,对溶骨性疾病进行防治。(The invention discloses application of isoindolinone compounds in preparation of a medicament for preventing and treating osteolytic diseases. The isoindolone compound has a structure shown in a formula (I): the isoindolone compound can remarkably inhibit the differentiation capability of bone marrow-derived macrophage BMMs induced by RANKL to osteoclasts and the bone absorption capability of the osteoclasts, and is concentration-dependent; subsequent mechanism researches find that the isoindolone compound inhibits the expression of transcription factor NFATc1 by blocking the activation of MAPK and PI3K/AKT signal transduction pathways induced by RANKL, so that osteoclast is down-regulatedThe expression of the cell-associated gene exerts the ability to inhibit osteoclast differentiation and bone resorption. In addition, the isoindolone compound does not influence the differentiation of osteoblasts, discloses the application of the isoindolone compound in preventing and treating osteolytic diseases, and can be used for preventing and treating osteolytic diseases together with a pharmaceutical composition prepared from a conventional medicinal carrier.)
技术领域
本发明涉及化合物及医药技术领域，特别涉及异吲哚酮类化合物在制备防治溶骨性疾病药物中的应用。
背景技术
溶骨性疾病(osteolytic disease)是指由于破骨细胞数量增加及活性增强所导致的骨密度和骨质量下降、骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。目前大量文献表明，RANKL介导的破骨细胞功能充进与各种类型的病理性骨溶解有着密切关系，例如：肿瘤导致的骨质破坏、炎症性的骨溶解、人工关节置换术后无菌性假体松动、绝经后骨质疏松症、Page’s病、银屑病性关节炎及强直性脊柱炎等等。随着全球老龄化社会的到来，各种溶骨性疾病所致的骨质破坏己经成为医疗工作者所面临的严峻挑战。近年来，溶骨性疾病的药物治疗主要包括抑制骨吸收药物、促骨形成药物和基本补充剂，但是，抑制骨吸收的一线用药双磷酸盐类药物过度促进骨骼矿物化，长期应用亦导致骨脆性增加；而促骨形成药物也常常伴随心悸、癌变等不良反应。因此，寻找一种安全而有效的治疗溶骨性疾病的药物仍是广大医务工作者所面临的难题。天然产物是药物研发的重要来源，并已有不少成功的先例，已报道的具有抑制破骨细胞活性的天然化合物，包括木质素、二萜、倍半萜内酯等。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷或不足，提供异吲哚酮类化合物在制备防治溶骨性疾病药物中的应用。本发明的发明人研究发现，特定结构的异吲哚酮类化合物可显著性抑制RANKL诱导的骨髓源巨噬细胞BMMs向破骨细胞分化的能力和破骨细胞的骨吸收能力，且呈浓度依赖性；后续机制研究发现，异吲哚酮类化合物通过阻碍RANKL诱导的MAPK和PI3K/AKT信号转导通路的激活来抑制转录因子NFATc1的表达，从而下调破骨细胞相关基因的表达，发挥抑制破骨细胞分化和骨吸收的能力。此外，异吲哚酮类化合物不影响成骨细胞的分化，揭示了异吲哚酮类化合物在防治溶骨性疾病中的应用，可以与常规药用载体制成的药物组合物，对溶骨性疾病包括骨质疏松症、佩季氏症等进行防治。本发明为溶骨性疾病提供给了新的药物，具有较大的临床应用价值。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：
具有式(I)所示结构的异吲哚酮类化合物在制备防治溶骨性疾病药物中的应用：
本发明的发明人团队于海洋真菌Diaporthe sp.SYSU-HQ3的发酵液中分离获得的得到一系列的异吲哚酮类化合物。为了更好的开发利用该系列异吲哚酮类化合物，对其进行了更为广泛和深入的研究。
研究发现，在这一系列的异吲哚酮类化合物中，具有式(I)特定式结构的异吲哚酮类化合物可显著性抑制RANKL诱导的骨髓源巨噬细胞BMMs向破骨细胞分化的能力和破骨细胞的骨吸收能力，且呈浓度依赖性；后续机制研究发现，异吲哚酮类化合物通过阻碍RANKL诱导的MAPK和PI3K/AKT信号转导通路的激活来抑制转录因子NFATc1的表达，从而下调破骨细胞相关基因的表达，发挥抑制破骨细胞分化和骨吸收的能力。此外，异吲哚酮类化合物不影响成骨细胞的分化，揭示了异吲哚酮类化合物在防治溶骨性疾病中的应用，可以与常规药用载体制成的药物组合物，对溶骨性疾病包括骨质疏松症、佩季氏症等进行防治。
本发明为溶骨性疾病提供给了新的药物，具有较大的临床应用价值。
该异吲哚酮类化合物的制备可参考专利CN 107721990 A。
以异吲哚酮类化合物作为活性成分，与常规药用载体制成的药物组合物可防治溶骨性疾病。具体地，药物组合物可以是片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等形式。
优选地，所述溶骨性疾病为破骨细胞数量增强和/或活性增强所导致的骨骼疾病。
更为优选地，所述溶骨性疾病为骨质破坏、炎症性的骨溶解、人工关节置换术后无菌性假体松动、绝经后骨质疏松症、Page’s病、银屑病性关节炎或强直性脊柱炎中的一种或几种。
优选地，所述异吲哚酮类化合物在抑制转录因子NFATc1的表达方面的应用。
优选地，所述异吲哚酮类化合物在阻碍RANKL诱导的MAPK和PI3K/AKT信号转导通路的激活方面的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：
本发明对异吲哚酮类化合物抑制破骨细胞分化的活性进行测试，结果显示其显著性抑制RANKL诱导的骨髓源巨噬细胞BMMs向破骨细胞分化的能力和破骨细胞的骨吸收能力，且呈浓度依赖性。后续机制研究发现，异吲哚酮类化合物通过阻碍RANKL诱导的MAPK和PI3K/AKT信号转导通路的激活来抑制转录因子NFATc1的表达，从而下调破骨细胞相关基因的表达，发挥抑制破骨细胞分化和骨吸收的能力。此外，异吲哚酮类化合物不影响成骨细胞的分化，揭示了异吲哚酮类化合物在防治溶骨性疾病中的应用，可以与常规药用载体制成的药物组合物，对溶骨性疾病包括骨质疏松症、佩季氏症等进行防治。
本发明为溶骨性疾病提供给了新的药物，具有较大的临床应用价值。
附图说明
图1为异吲哚酮类化合物抑制RANKL诱导的BMMs分化为破骨细胞图；
图2为异吲哚酮类化合物抑制破骨细胞的骨吸收能力图；
图3为异吲哚酮类化合物对成骨细胞的分化影响图；
图4为异吲哚酮类化合物下调RANKL诱导的破骨细胞标记性基因的表达图；
图5为异吲哚酮类化合物下调RANKL诱导的PI3K/AKT和MAPK通路的激活图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
本发明各实施例所选用的异吲哚酮类化合物参考CN 107721990A中的方法制备得到。
实施例1
本实施例探索异吲哚酮类化合物对破骨细胞分化的抑制活性，进行了如下测试。
(1)细胞培养：从C57BL/6的股骨和胫骨中分离得到骨髓源巨噬细胞BMMs，培养于含10％胎牛血清、链霉素(100μg/mL)，青霉素(100单位/毫升)的α-MEM培养基中，在37℃，5％二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。
(2)TRAP染色实验：将BMMs细胞以3×103/孔的密度铺与96孔板中，等待24h使细胞贴壁后，加药测试不同浓度的异吲哚酮类化合物对RANKL(50ng/mL)和MCSF(30ng/mL)诱导的破骨细胞形成的抑制作用，用TRAP试剂盒对破骨细胞染色，计算破骨细胞(TRAP+的细胞，核≥3)的数量，反映化合物对破骨细胞形成的抑制活性。
(3)细胞活力测试：将BMMs细胞以5×103的密度种于96孔板中，次日，待细胞贴壁后，加入不同浓度的异吲哚酮类化合物溶液；72h后，按20μL/孔的浓度加入CCK-8试剂，2h后测定其在490mm处的吸光值，计算化合物对BMMs细胞活力的影响。
(4)骨吸收能力测试：将BMMs细胞按5×104/孔的密度培养于胶原板中，用RANKL(50ng/mL)和MCSF(30ng/mL)诱导BMMs分化为破骨细胞的前体细胞，随后，将细胞从板上消化并收集下，以6×103/孔的密度种于骨吸收板中，加药48h后，用PBS将24孔板洗涤2-3次，以IMAG J分析异吲哚酮类化合物对破骨细胞骨吸收能力的抑制作用。
(5)碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红(Alizarin S red)染色实验：将C3H10T1/2细胞按照3×103/孔的密度种于24孔板中，待24h贴壁后，用成骨分化培养基(完全培养基DMEM、***、β-磷酸钠、L-抗坏血酸)诱导分化为成骨细胞，并加药干预，14天后用4％多聚甲醛固定细胞20min，PBS洗涤2-3次后用ALP染色试剂盒染色，另外21天后按照上述操作固定并洗涤细胞，用Alizarin S red染色试剂盒染色。
(6)定量即时聚合酶链式反应实验：将BMMs细胞按5×104/孔的密度种于六孔板中，待24h贴壁后，用RANKL(50ng/mL)和MCSF(30ng/mL)诱导BMMs分化，并加药干预，共培养5天后，用TRIZOL法提取细胞RNA，经Toyobo逆转录试剂盒逆转录为cDNA后，利用定量即时聚合酶链式反应实验对特定引物进行定量。
(7)蛋白免疫印迹实验：将RAW264.7细胞以10×104/孔的密度种于六孔板中，待次日细胞贴壁后，提前2h给药，随后加RANKL(50ng/mL)诱导，弃去培养基用预冷的PBS洗涤2-3次，加RIPA裂解细胞，静置10min后，13000rpm、20min，取上清，经western blot实验分析不同蛋白的表达水平。
如图1，为异吲哚酮类化合物抑制RANKL诱导的BMMs分化为破骨细胞。其中，A为异吲哚酮类化合物的化学结构，B为异吲哚酮类化合物抑制RANKL诱导的BMMs分化为破骨细胞(Mag＝10×；scale bar:400μm)，C为每孔中破骨细胞的个数，D为每孔中破骨细胞的面积，E为异吲哚酮类化合物在BMMs上的细胞活力测试，F～G为不同时间点，异吲哚酮类化合物对破骨细胞的抑制作用。由图可知，化合物显著抑制RANKL诱导的破骨细胞分化，并呈现浓度依赖性；此外，时间梯度测试可知，化合物最早在BMMs分化的第一天就表现出抑制作用，细胞活力测试排除了化合物是由于毒性引起的抑制破骨细胞分化的活性。。
如图2，为异吲哚酮类化合物抑制破骨细胞的骨吸收能力图。其中，A～B为异吲哚酮类化合物抑制破骨细胞的骨吸收能力(Mag＝4×；scale bar:100μm)。由图可知，化合物显著抑制破骨细胞在人工骨片孔板中的骨吸收作用，并显示浓度依赖性，化合物在10μM浓度下完全抑制破骨细胞的骨吸收功能。
如图3，为异吲哚酮类化合物影响成骨细胞的分化图。由图可知，ALP和Alizarin Sred染色显示异吲哚酮类化合物不影响成骨细胞的分化。
如图4，为异吲哚酮类化合物下调RANKL诱导的破骨细胞标记性基因的表达图。由图可知，化合物显著抑制RANKL诱导的破骨细胞标记性基因的表达，包括TRAP、CTSK、NFATc1、V(2)、MMP-9、DC-stamp等。
如图5，为异吲哚酮类化合物下调RANKL诱导的PI3K/AKT和MAPK通路的激活图。由图可知，化合物显著抑制RANKL诱导的PI3K/AKT和MAPK通路中关键蛋白AKT、ERK、JNK、P38的磷酸化，从而抑制通路对下游转录因子NFATc1的激活。
由上述可知，异吲哚酮类化合物可显著性抑制RANKL诱导的骨髓源巨噬细胞BMMs向破骨细胞分化的能力和破骨细胞的骨吸收能力，且呈浓度依赖性；后续机制研究发现，异吲哚酮类化合物通过阻碍RANKL诱导的MAPK和PI3K/AKT信号转导通路的激活来抑制转录因子NFATc1的表达，从而下调破骨细胞相关基因的表达，发挥抑制破骨细胞分化和骨吸收的能力。此外，异吲哚酮类化合物不影响成骨细胞的分化，揭示了异吲哚酮类化合物在防治溶骨性疾病中的应用，可以与常规药用载体制成的药物组合物，对溶骨性疾病包括骨质疏松症、佩季氏症等进行防治。