一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法
阅读说明：本技术 一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法 (ctDNA library construction and sequencing data analysis method for simultaneously detecting multiple liver cancer common mutations ) 是由 焦宇辰 曲春枫 王沛 陈坤 王宇婷 宋欠欠 王思振 阎海 于 2018-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法。本发明建立的文库构建方法及测序数据分析方法具有以下优点：1、在不需要捕获的情况下同时检测肝癌多种突变形式；2、适合超小靶区的高效捕获；3、文库可以支持10-20次检测；4、在文库构建过程中将DNA条码barcode连接到起始ctDNA分子上,配合生物信息分析流程,实现ctDNA低频突变的高特异性检测；5、文库可以同时用于PCR的热点检测和捕获法测序,加入的DNA barcode可以有效滤除假阳性突变,实现基于duplex高特异性测序。本发明对于肝癌的早期筛查、病情追踪、疗效评估、预后预测等具有重要临床意义。(The invention discloses a ctDNA library construction and sequencing data analysis method for simultaneously detecting various liver cancer common mutations. The library construction method and the sequencing data analysis method established by the invention have the following advantages: 1. simultaneously detecting multiple mutation forms of the liver cancer without capturing; 2. the method is suitable for efficient capture of the ultra-small target area; 3. the library can support 10-20 times of detection; 4. in the library construction process, a DNA bar code barcode is connected to an initial ctDNA molecule, and high specificity detection of low-frequency mutation of ctDNA is realized by matching with a biological information analysis process; 5. the library can be simultaneously used for sequencing by a hot spot detection and capture method of PCR, and the added DNA barcode can effectively filter out false positive mutation, so that high specificity sequencing based on duplex is realized. The invention has important clinical significance for early screening, disease tracking, curative effect evaluation, prognosis prediction and the like of liver cancer.)
技术领域
本发明涉及一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法。
背景技术
ctDNA(circulating tumor DNA)，即循环肿瘤DNA，指存在于血液、脑脊液等体液中，游离于细胞外的肿瘤DNA。ctDNA通常和血液中来源于正常细胞的游离DNA混杂在一起，被称为cfDNA(cellfree DNA增加空格)。通过检测ctDNA的突变，可指导靶向用药，治疗的监测以及癌症的早期筛查等等。基于ctDNA的检测方法包括1)基于PCR的热点突变检测法，通常检测一个或几个热点突变或已知突变，无法检测基因融合等复杂突变，无法检测未知突变。2)捕获/二代测序法：可以检测较多基因的位置突变，包括复杂突变，但捕获试剂盒一般价格昂贵、操作复杂、耗时较长。在以上两种方法的背景下，目前ctDNA检测存在以下困难：1)一次抽血获得ctDNA标本量有限，通常仅够支持一次检测，这就造成ctDNA临床检测中通常是单平台、一次性的，使用低成本的热点突变法检测到一个突变就无法再检测其他突变。而临床检测中经常需要根据首次检测的结果判断后续检测的目标和方案，这就需要在后续检测中重新抽血。另外，ctDNA相关临床检测或研究中经常需要比较多种技术的优劣，这就需要数倍于正常抽血量的标本，患者通常无法接受。2)无论是PCR法还是捕获法，扩增过程中产生的噪音突变会严重干扰ctDNA低频突变的检测，造成假阳性结果，误导患者的诊断和治疗。3)ctDNA突变含量低，操作过程中易发生污染，造成假阳性结果。
肝癌是世界第五高发和第二致死的常见肿瘤，世界一半以上的肝癌发生在中国，且以乙肝相关性肝癌为主。乙肝相关性肝癌几乎没有KRAS、BRAF等热点突变，其突变主要为TP53、CTNNB1等几个基因的编码区突变，TERT高GC启动子区突变，还包括HBV整合、TERT拷贝数变异等复杂突变形式。使得目前没有简单、低成本、可靠的方案系统检测肝癌ctDNA突变。通过ctDNA检测对肝癌进行早期筛查、病情追踪、疗效评估、预后预测等具有重要临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法。
本发明提供一种测序文库构建方法，依次包括如下步骤：
(1)将DNA样本依次进行末端修复和3’端加A处理；
(2)将步骤(1)处理后的DNA样本与接头混合物连接，经过PCR扩增后得到文库；
所述接头混合物由n个接头组成；
每个接头均由一条上游引物甲和一条下游引物甲形成部分双链结构得到；上游引物甲中具有测序接头甲、随机标签、锚定序列甲和位于3’末端的碱基T；下游引物甲中具有锚定序列乙和测序接头乙；所述部分双链结构由上游引物中的锚定序列甲和下游引物中的锚定序列乙反向互补形成；
所述测序接头甲和测序接头乙为根据不同测序平台选择对应的测序接头；
所述随机标签为8-14bp的随机碱基；
所述锚定序列甲长度为14-20bp，连续重复碱基≤3个；
n个接头采用n个不同的锚定序列甲，并且相同位置的碱基平衡，错配碱基数>3；
n为≥8的任意自然数。
所述锚定序列不与引物其它部分相互作用(如形成发卡结构、二聚体等)。
所述上游引物甲自5’端依次为测序接头甲、随机标签、锚定序列甲和碱基T。
所述下游引物甲自5’端依次为锚定序列乙和测序接头乙。
所述锚定序列可作为序列固定的内置标签，用于标记原始模板分子。
所述DNA样本可为基因组DNA、cDNA、ct DNA或cf DNA样本。
所述n具体可为12。
所述随机标签具体可为8bp的随机碱基。
所述锚定序列甲长度具体可为12bp。
当n＝12时，所述锚定序列甲具体可为序列表的序列1自5’端第30-41位、序列表的序列3自5’端第30-41位、序列表的序列5自5’端第30-41位、序列表的序列7自5’端第30-41位、序列表的序列9自5’端第30-41位、序列表的序列11自5’端第30-41位、序列表的序列13自5’端第30-41位、序列表的序列15自5’端第30-41位、序列表的序列17自5’端第30-41位、序列表的序列19自5’端第30-41位、序列表的序列21自5’端第30-41位、序列表的序列23自5’端第30-41位所示。
所述测序接头甲具体可为来自Illumina公司的Truseq测序试剂盒的测序接头。所述测序接头甲具体可如序列表的序列表的序列1自自5’端第1-29位所示。
所述测序接头乙具体可为来自Illumina公司的nextera测序试剂盒的测序接头。所述测序接头乙具体可如序列表的序列表的序列2自自5’端第13-41位所示。
当n＝12时，所述12个接头如下：
接头1由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头2由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头3由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头4由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头5由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头6由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头7由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头8由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头9由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列18所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头10由序列表的序列19所示的单链DNA分子和序列20所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头11由序列表的序列21所示的单链DNA分子和序列22所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头12由序列表的序列23所示的单链DNA分子和序列24所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到。
所述接头可以通过将上游引物甲和下游引物甲进行退火得到。
所述接头混合物中，每个接头等摩尔混合。
所述方法还包括对步骤(2)得到的文库进行扩增的步骤。所述扩增采用的引物对如序列表的序列25和序列26所示的两条单链DNA分子组成。
本发明还保护以上所述的方法构建得到的DNA文库。
本发明还保护一种用于构建测序文库的试剂盒，包括以上任一所述的接头混合物。
所述试剂盒还包括用于DNA提取的试剂、用于DNA建库的试剂、用于文库纯化的试剂、用于文库捕获的试剂等用于文库构建的材料。
本发明还保护一种用于检测DNA样本中肝癌突变的试剂盒，包括以上任一所述接头混合物和引物组合；所述引物组合由引物组I、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ；
所述引物组I由序列表的序列28至序列105所示的单链DNA组成；
所述引物组Ⅱ由序列表的序列106至序列187所示的单链DNA组成；
所述引物组Ⅲ由序列表的序列191至序列265所示的单链DNA组成；
所述引物组Ⅳ由序列表的序列266至序列344所示的单链DNA组成。
所述试剂盒还包括用于DNA提取的试剂、用于DNA建库的试剂、用于文库纯化的试剂、用于文库捕获的试剂等用于文库构建的材料。
本发明还保护一种引物组合，由引物组I、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ；
所述引物组I由序列表的序列28至序列105所示的单链DNA组成；
所述引物组Ⅱ由序列表的序列106至序列187所示的单链DNA组成；
所述引物组Ⅲ由序列表的序列191至序列265所示的单链DNA组成；
所述引物组Ⅳ由序列表的序列266至序列344所示的单链DNA组成。
所述引物组合的用途为制备用于检测DNA样本中肝癌突变的试剂盒。
本发明还保护一种所述引物组合在制备用于检测DNA样本中肝癌突变的试剂盒中的应用。
本发明还保护一种检测DNA样本中目标突变的方法，包括如下步骤：
(1)按照权利要求1所述的方法构建文库；
(2)对步骤(1)得到的文库进行两轮巢式PCR扩增，对产物进行测序，根据测序结果分析DNA样本中目标突变发生情况；
所述步骤(2)中，采用引物组合甲进行第一轮PCR扩增；
引物组合甲由上游引物甲和下游引物组合甲组成；
所述上游引物甲为文库扩增引物，用于步骤(1)的文库扩增；
所述下游引物组合甲为根据n个目标靶点设计的n条引物的组合；
以第一轮PCR的产物为模板，采用引物组合乙进行第二轮PCR扩增；
引物组合乙由上游引物乙、下游引物组合乙和index引物组成；
所述上游引物乙部分序列为文库扩增引物，用于第一轮PCR的产物的扩增；
所述下游引物组合乙中的引物与下游引物组合甲中检测相同目标靶点的引物形成巢式关系，各条引物中具有与index引物结合的区段；
所述index引物中包含与下游引物组合乙中各条引物结合的区段和index序列。
所述上游引物甲具体如序列表的序列27所示。
所述上有引物乙具体如序列表的序列188所示。
所述index引物自5’端包括区段A、index序列和区段B；所述区段A如序列表的序列189所示，所述区段B如序列表的序列190所示。
当所述目标突变为肝癌突变时，所述引物组合甲由以上任一所述引物组I和引物组Ⅱ组成；所述引物组合乙由以上任一所述引物组Ⅲ和引物组Ⅳ组成；使用引物组I和引物组Ⅱ分别对模板进行第一轮PCR扩增，使用引物组I进行扩增的产物作为第二轮扩增的模板采用引物组Ⅲ进行扩增，使用引物组Ⅱ进行扩增的产物作为第二轮扩增的模板采用引物组Ⅳ进行扩增，然后将扩增产物等体积混合。
所述测序结果的分析方法为：将随机标签序列相同、DNA***片段长度相同、DNA***片段两端断点均相同的DNA分子测序数据回溯到一个分子簇，如果簇内分子数>5个并且簇内分子突变一致率>80％并且簇个数≥5，则该突变为来自原始DNA样本的真实突变。
本发明还保护一种检测DNA样本中多种目标突变的方法，包括如下步骤：
(1)按照权利要求1所述的方法构建文库；
(2)对步骤(1)的文库进行靶区域富集并进行测序，根据测序结果分析DNA样本中目标突变发生情况。
所述靶区域富集可采用现有商购的靶向捕获试剂盒(例如Agilent sureselectXT靶向捕获试剂盒，Agilent5190-8646)进行，将其中最后一步PCR扩增的引物对更换为由引物甲和引物乙组成的引物对；所述引物甲如序列表的序列345所示；所述引物乙包括区段甲、index序列和区段乙；所述区段甲如序列表的序列346所示；所述区段乙如序列表的序列347所示。
所述测序结果的分析方法为：将DNA***片段长度相同、DNA***片段两端断点、两端的锚定序列均相同的初始DNA单链测序数据回溯到一个分子簇；将***片段长度一致并且除突变点外的序列一致、分子簇两端的锚定序列相同但位置相反的同一个起始DNA双链的分子簇标记为一对duplex分子簇；对某一突变来说，若至少有一对duplex分子簇支持，即可判断为真，若无duplex分子簇支持，那么至少有4个分子簇支持，可判断为真。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：
1.在不需要捕获的情况下同时检测肝癌ctDNA中的点突变、***缺失突变、HBV整合等多种突变形式。与捕获法相比，此技术只需数条DNA引物，不需昂贵的捕获探针和杂交试剂，成本极大降低；操作流程简单，可以从捕获法的36小时缩短到8小时。
2.适合超小靶区的高效捕获，靶区可以小至捕获法最小靶区的10％，极大的提高了测序效率。例如，肝癌常见突变TP53、CTNNB1、AXIN1、TERT、HBV整合的组合就是一个适合本技术的超小靶区，使用捕获法富集此靶区的上靶率<10％，而本技术可以达到80％以上，极大的提高了测序效率，降低测序成本。
3.在进行一次检测后，扩增后的文库可以支持10-20次的后续检测，每次检测的结果都可以代表全部原始ctDNA标本的突变状况，不会造成灵敏度和特异性的降低。
4.在文库构建过程中将DNA条码barcode连接到起始ctDNA分子上，配合生物信息分析流程，实现ctDNA低频突变的高特异性检测。
5.本技术所构建的文库可以同时用于PCR的热点检测和捕获法测序，且一份标本构建出来的文库可以同时支持多次检测，加入的DNA barcode可以有效滤除假阳性突变，实现基于duplex高特异性测序。
本发明对于肝癌的早期筛查、病情追踪、疗效评估、预后预测等具有重要临床意义。
附图说明
图1为adapter和引物架构示意图。
图2为RaceSeq靶区富集和文库构建示意图。
图3为MC文库进行捕获和进行duplex测序的示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、MC文库的构建
一、cfDNA分子的平末端修复和加A处理
取10-45ng cfDNA，按照表1所示配置反应体系，然后按照表2的程序在PCR仪进行末端修复及3’末端加A处理，得到反应产物(4℃保存)。
表1反应体系
成分
体积
cfDNA
50μl
End Repair&A-Tailing Buffer(KAPA KK8505)
7μl
End Repair&A-Tailing Enzyme Mix(KAPA KK8505)
3μl
总体积
60μl
表2反应程序
温度
时间
20℃
30min
65℃
30min
二、cfDNA与adapter连接
按照表3配置反应体系，20℃反应15min，得到连接产物(4℃保存)。
表3反应体系
成分
体积
步骤一得到的反应产物
60μl
Adapter Mix(50μM)
1.5μl
DNase/RNase-Free Water
8.5μl
Ligation Buffer(KAPA KK8505)
30μl
DNA Ligase(KAPA KK8505)
10μl
总体积
110μl
Adapter Mix序列信息见表4。
将表4中的单链DNA用TE溶解稀释至终浓度为100μM。将同一组中的两条单链DNA等体积混合(各50μl)，进行退火(退火程序：95℃，15min；25℃，2h)，得到12组DNA溶液，将12组DNA溶液等体积混合，得到Adapter Mix。
表4 adapterMix序列信息
表4中，8个N表示8bp的随机标签。实际应用中，随机标签长度可为8-14bp。
下划线表示12bp的锚定序列，每一组的上游序列和下游序列中，下划线部分反向互补，通过退火可使上游序列和下游序列结合在一起形成接头。同时，锚定序列可作为序列固定的内置标签，用于标记原始模板分子。实际应用中，锚定序列长度可为12-20bp，连续重复碱基不超过3个，且不能与引物其它部分相互作用(如形成发卡结构、二聚体等)，12组每一个位置碱基平衡，mismatch碱基数>3。
上游序列中末端加粗的T与原始分子末端加的“A”互补，进行TA连接。
上游序列中，自5’端第1至21位为(来自Illumina公司的Truseq测序试剂盒)为测序引物结合序列，其中，自5’端第1至19位为文库扩增引物部分。
下游序列中，非下划线部分(来自Illumina公司的nextera测序试剂盒)为测序引物结合序列，其中，自3’端第1至22位为设计文库扩增引物的部分。
表4中共包含12组接头，可以形成12×12＝144种标记组合，结合分子本身的序列信息，足以区分原始样品中的所有分子，实际应用中也可适当增加(合成成本增高)或减少(区分效果略弱)组数。
连接产物结构如图1所示。其中，a为接头部分，b和f分别为文库扩增引物，c为8bp随机标签(表4中的8个N表示)，d为12bp锚定序列(表4中的下划线表示)，e为***片段(cfDNA)。
三、连接产物纯化
步骤二得到的连接产物中加入110μl AMPure XP磁珠(贝克曼A63880)，涡旋混匀，室温放置10min，磁力架吸附5min；待溶液澄清后弃上清，然后加入200μl 80％(体积百分含量)乙醇水溶液清洗2次，弃上清；待乙醇晾干后，加入30μl DNase/RNase-Free Water，涡旋混匀，室温放置10min，磁力架吸附5min，吸取上清溶液至PCR管内，作为PCR模板。
四、文库扩增及纯化
1、取步骤三得到的PCR模板，按照表5配置反应体系，按照表6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(4℃保存)。
表5反应体系
成分
体积
HIFI(KAPA KK8505)
35μl
MC_F(33μM)
2.5μl
MC_R(33μM)
2.5μl
模板
30μl
总体积
70μl
表5中，引物信息如下：
MC_F(序列25)：GACACGACGCTCTTCCGAT(5’-3’)；
MC_R(序列26)：GTGGGCTCGGAGATGTGTATAA(5’-3’)。
表6反应程序
2、步骤1得到的PCR扩增产物中加入90μl AMPure XP磁珠，涡旋混匀，室温放置10min，磁力架吸附5min；待溶液澄清后弃上清，然后加入200μl 80％(体积百分含量)乙醇水溶液清洗2次，弃上清；待乙醇晾干后，加入100μl DNase/RNase-Free Water，涡旋混匀，室温放置10min，磁力架吸附5min，吸取上清溶液，得到产物(-20℃储存)。产物即为可长期保存、反复使用的MC文库。
经检测，MC文库可以支持10-20次的后续检测，每次检测的结果都可以代表全部原始样本的突变状况，不会造成灵敏度和特异性的降低。同时，文库的构建方法不仅适用于cfDNA样本，也适用于基因组DNA或cDNA样本。
实施例2、RaceSeq富集靶区并构建测序文库
如图2所示，使用针对我国肝癌高频突变基因(TP53、CTNNB1、AXIN1、TERT)的相关区域和针对HBV整合热点区域设计的引物，和固定引物配合，对MC文库进行两轮PCR扩增，扩增产物即为测序文库。
图2中，a为第一轮文库扩增上游引物，b为第二轮文库扩增上游引物，c为第一轮文库扩增下游引物库，用于特异目标序列富集，d为第二轮文库扩增下游引物库，用于特异目标序列富集，e为index primer，用于添加index序列。
1、取300ng实施例1制备的MC文库，分为两份，配置表7的反应体系(一份加入GSP1Amix，另一份加入GSP1B mix)，按照表9的反应程序进行第一轮PCR扩增，得到第一轮扩增产物(共得到两份第一轮扩增产物，一份为GSP1A mix的扩增产物，一份为GSP1B mix的扩增产物)。
表7反应体系
成分
体积
Hifi(KAPA KK8505)
15μl
上游引物1355
3μl
GSP1A mix/GSP1B mix
2μl
MC文库
10μl
总体积
30μl
表7中，引物信息如下：
上游引物1355(序列27)：TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT(5’-3’)。
GSP1A mix：将表8中属于引物池GSP1A中的各条引物用TE溶解，浓度为100μM，然后等体积混合，用TE稀释至0.3μM。引物池GSP1A中的引物用于扩增模板的正链。
GSP1B mix：将表8中属于引物池GSP1B中的各条引物用TE溶解，浓度为100μM，然后等体积混合，用TE稀释至0.3μM。引物池GSP1B中的引物用于扩增模板的负链。
引物池GSP1A和引物池GSP1B中，相同编号的引物从正负两个方向检测同一突变位点，同时使用可最大限度的富集原始分子信息。
表8引物信息
表9反应程序
2、步骤1得到的两份第一轮扩增产物分别利用AMPure XP磁珠按1：1.3的比例进行纯化，25μlDNase/RNase-Free Water洗脱，得到两份第一轮纯化产物。
3、分别以步骤2得到的两份第一轮纯化产物为模板，配置表10的反应体系(采用GSP1A mix扩增产物作为模板时，采用GSP2A mix扩增；采用GSP1Bmix扩增产物作为模板时，采用GSP2B mix扩增)，按照表12的反应程序进行第二轮PCR扩增，得到第二轮扩增产物(4℃保存)。
表10反应体系
成分
体积
KapaHifi
15μl
上游引物3355
2μl
GSP2Amix/GSP2Bmix
1μl
Index引物(10μM)
2μl
模板(GSP1A mix/GSP1Bmix)
10μl
总体积
30μl
表10中，引物信息如下：
上游引物3355(序列188)：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGC TCT(5’-3’)；下划线部分为第一轮的上游引物1355相同的部分，3355及1355均为Illumina测序平台测序的固定序列(也可更换为可在其他测序平台测序的序列)。
GSP2A mix：将表11中属于引物池GSP2A中的各条引物用TE溶解，浓度为100μM，然后等体积混合，用TE稀释至0.3μM。引物池GSP2A中的引物用于扩增模板的正链。
GSP2B mix：将表11中属于引物池GSP2B中的各条引物用TE溶解，浓度为100μM，然后等体积混合，用TE稀释至0.3μM。引物池GSP2B中的引物用于扩增模板的负链。
表11中，自5’端第1至20位为与Index引物结合的部分。
GSP2A mix与GSP1A mix中引物编号相同的引物为针对同一突变位点设计，两条引物形成巢式关系。
GSP2B mix与GSP2A mix中引物编号相同的引物为针对同一突变位点设计，两条引物形成巢式关系。
Index引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(序列189)********GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA(序列190)；下划线部分为与GSP2mix结合的部分。********为index序列位置，index的长度为6-8bp，作用是区分样本间的序列，方便多个样本混合测序。除index序列外，其余都是来自Illumina的small RNA测序试剂盒的固定序列。
表11引物信息
其中，NA表示没有引物。
表12反应程序
4、步骤3得到的采用GSP2A mix进行第二轮扩增的产物和采用GSP1Bmix进行第二轮扩增的产物等体积混合，利用AMPure XP磁珠按1：1.3的比例进行纯化，50μl DNase/RNase-FreeWater洗脱，得到第二轮纯化产物，即为可以在Illumina Hiseq X平台测序的测序文库，每个文库测序数据量为2G，平均测序深度大于60000×。
MC文库上的DNA随机标签与cfDNA序列一起被添加到测序文库的Read1序列下游。在测序中，依次获得DNA随机标签序列、锚定序列、cfDNA序列(图1中的c、d、e序列)。在数据分析时，将随机标签序列相同、DNA***片段长度相同、DNA***片段两端断点均相同的DNA分子测序数据回溯到一个分子簇，如果簇内分子数>5个并且簇内分子突变一致率>80％并且簇个数≥5，则该突变为来自原始DNA样本的真实突变。
经30ng肝癌患者cfDNA的测序实验表明，此方法总计耗时仅需约6小时(手动操作约1.5h)，产生的RaceSeq文库的上靶率达到80％，在2Gb数据量的情况下，测序深度达到60000×，分子簇5000个，平均每个簇的测序分子数达到12个，具体可见表13。
表13测序数据展示
目标区域:20031bp
样品编号
RG773
RG774
RG776
RG777
样品起始量(ng)
30
30
30
30
MC文库产量(ng)
6800
7300
7200
6500
测序量(bp)
2002633889
1733018642
1725428157
1790632086
基因组比对率
0.9888
0.9896
0.9907
0.9896
上靶率
0.8015
0.8057
0.8295
0.7877
测序深度
80130.55
69705.42
71452.26
70411.13
实施例3、MC文库的捕获及测序
如图3所示，可使用Agilent sureselect XT靶向捕获试剂盒(Agilent5190-8646)对实施例1的MC文库进行捕获(参照试剂盒说明书进行，也兼容其它品牌捕获试剂)将最后一步PCR扩增的引物更换为如下引物：
上游引物(5’-3’)：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC GATCT(序列345)(图3中的“a”),下划线部分为与引物MC_F相同，作用为扩增文库，其余部分为Illumina测序平台测序所需的固定序列。
下游引物(5’-3’)：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(序列346)********GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAA(序列347)(图3中的“b”)，下划线部分为与引物MC_R相同，作用为扩增文库。********为index序列位置，index长度为6-8bp，作用是区分样本间的序列，方便多个样本混合测序。其余部分为Illumina测序平台测序所需的固定序列。
捕获后的文库与MC文库具有相同的DNA随机标签序列、锚定序列和cfDNA序列，依次位于Read1下游。将DNA***片段长度相同、DNA***片段两端断点、两端的锚定序列均相同的初始DNA单链测序数据回溯到一个分子簇。同时，将***片段长度一致并且除突变点外的序列一致、分子簇两端的锚定序列相同但位置相反的同一个起始DNA双链的分子簇标记为一对duplex分子簇。对某一突变来说，若至少有一对duplex分子簇支持，即可判断为真，若无duplex分子簇支持，那么至少有4个分子簇支持，可判断为真。在一对duplex分子簇共同支持的突变可靠性更高，可减少90％的假阳性突变。
实施例4、方法对比
收集了5例肝癌者cf DNA标本，先按照实施例1中的方法进行MC文库构建，然后同时按照实施例2中的方法进行RaceSeq靶区富集和实施例3中的常规的Agilent sureselectXT靶区富集、测序，变异检测结果展示如表13和表14所示。
表13两种方法snv检测对比
表14两种方法HBV融合检测对比
可以看出，Agilent sureselect XT靶区富集方法和RaceSeq法对于单碱基突变和HBV***的检测结果基本一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
北京泛生子基因科技有限公司
<120> 一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法
<160> 347
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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gacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnc cactagtagc ct 42
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ggctactagt ggctgtctct tatacacatc tccgagccca c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> n is a, c, g, or t
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gacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnng gactgtgtcg gt 42
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctctgacta ccctgtctct tatacacatc tccgagccca c 41
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ttacgtggag ttctgtctct tatacacatc tccgagccca c 41
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aattctcgag aactgtctct tatacacatc tccgagccca c 41
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ttggaagagt ttctgtctct tatacacatc tccgagccca c 41
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aagacgttcc aactgtctct tatacacatc tccgagccca c 41
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gacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnnc cggactcctc ct 42
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ggaggagtcc ggctgtctct tatacacatc tccgagccca c 41
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<400> 23
gacacgacgc tcttccgatc tnnnnnnnna aggaggagta at 42
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ttactcctcc ttctgtctct tatacacatc tccgagccca c 41
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gacacgacgc tcttccgat 19
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tctttcccta cacgacgctc ttccgat 27
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tgtattaggg tgcagcgctc 20
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cgctcggatc tggacctg 18
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tggagccctg tgactcgaa 19
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gtgaccagga catggatgag g 21
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tcctccagta gacggtacag c 21
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tgctgcttgt ccccacac 18
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ccgcttggca ccacttcc 18
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ggcacgggaa gcacgtac 18
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ccttgcagtg ggaaggtg 18
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gacagaaaag cggctgttag tca 23
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ccgacctcag ctacagcat 19
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acttgagcaa cccggagtct g 21
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ctcctagctc tgcagtccga 20
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gcgcctggct ccatttcc 18
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cgcctgagaa cctgcaaaga g 21
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gtccagggag caatgcgt 18
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cgggttaccc cacagccta 19
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ggctcccagt ggattcgc 18
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gtcctgcccc ttcacctt 18
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ccgactactg cctcacccat at 22
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gggtttttct tgttgacaag aatcct 26
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ccaacctcca atcactcacc aa 22
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ggcgttttat catattcctc ttcatcct 28
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ctacttccag gaacatcaac taccag 26
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ctgcacttgt attcccatcc cat 23
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tcagtttact agtgccattt gttcagt 27
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tacaacatct tgagtccctt tttacctc 28
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agaattgtgg gtcttttggg ctt 23
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tgtaaacaat atctgaacct ttaccctgtt 30
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gcatgcgtgg aacctttgtg 20
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aactctgttg tcctctctcg gaa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctgaatcccg cggacgac 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccgtctgtgc cttctcatct g 21
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<213> 人工序列
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gaacgcccac caggtcttg 19
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<212> DNA
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ccttgaggcg tacttcaaag actg 24
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ggaggctgta ggcataaatt ggt 23
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gtcctactgt tcaagcctcc aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gggcttctgt ggagttactc tc 22
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<212> DNA
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ttgtatcggg aggccttaga gt 22
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ttctgtgttg gggtgagttg a 21
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ccagcatcca gggaattagt agtca 25
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ttcctgtctt acctttggaa gagaaac 27
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ccggaaacta ctgttgttag acgta 25
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cgtcgcagaa gatctcaatc tcg 23
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aaactccctc ctttcctaac attcattt 28
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tatgcctgct aggttctatc ctaacc 26
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ggcattattt acatactctg tggaagg 27
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gttggtcttc caaacctcga ca 22
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ttcaacccca acaaggatca ct 22
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ttccaccaat cggcagtcag 20
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attcgcagtc ccaaatctcc 20
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acccttataa agaatttgga gctactgtg 29
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ctcaggtact gtgtatatac ttacttctcc 30
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<213> 人工序列
<400> 106
gggagcatct tcggtgaaac 20
<210> 107
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
caggcttatc ccatcttggt ca 22
<210> 108
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
ttggtggctg gcttggtc 18
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
gctgtaccgt ctactggagg a 21
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
gcttgttctc cagctctcgg a 21
<210> 111
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
gggaagtggt gccaagcg 18
<210> 112
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
gcacacgctg tacgtgct 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
gcctccacct gctccttg 18
<210> 114
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
ccctcaatga tccactgcat ga 22
<210> 115
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
ctcatacagg acttgggagg tatc 24
<210> 116
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
cacaaccgca ggacagct 18
<210> 117
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
ctccaagcct cggactgc 18
<210> 118
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
gcctcacacc agccacaac 19
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
tccccaccat gagcaaacca 20
<210> 120
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
gtgcctccct gcaacact 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
gcaccacgaa tgccggac 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
gtggggtaac ccgaggga 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
gaggaggcgg agctggaa 18
<210> 124
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
agcgctgcct gaaactcg 18
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
cgcacgaacg tggccag 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
gagccaccag caggaaagt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
ctaggaatcc tgatgttgtg ctct 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
cgcgagtcta gactctgtgg ta 22
<210> 129
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
atagccagga caaattggag gaca 24
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
gacaaacggg caacatacct t 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
ccgaaggttt tgtacagcaa caa 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
ctgagccagg agaaacggac tga 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
gggactcaag atgttgtaca gacttg 26
<210> 134
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
gttaagggag tagccccaac g 21
<210> 135
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
caggcagttt tcgaaaacat tgctt 25
<210> 136
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
ttaaagcagg atagccacat tgtgtaa 27
<210> 137
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
ggcaacaggg taaaggttca gatat 25
<210> 138
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
ccacaaaggt tccacgcat 19
<210> 139
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
tggaaaggaa gtgtacttcc gaga 24
<210> 140
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
gtcgtccgcg ggattcag 18
<210> 141
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
aaggcacaga cggggaga 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
tcacggtggt ctccatgc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
ggtcgttgac attgctgaga gt 22
<210> 144
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
aacctaatct cctcccccaa ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
gcagaggtga aaaagttgca tgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
ccacccaagg cacagctt 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
actccacaga agccccaa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
gcctcccgat acaaagcaga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
gattcatcaa ctcaccccaa caca 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acatagctga ctactaattc cctggat 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
atccacactc caaaagacac caaat 25
<210> 152
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
gcgagggagt tcttcttcta gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
cagtaaagtt tcccaccttg tgagt 25
<210> 154
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 154
cctcctgtaa atgaatgtta ggaaagg 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 155
gtttaatgcc tttatccaag ggcaaa 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 156
ctcttatata gaatcccagc cttccac 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
cttgtcgagg tttggaagac ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 158
gtttgagttg gctccgaacg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 159
ctgagggctc caccccaa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 160
gtgaagagat gggagtaggc tgt 23
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 161
cccatctttt tgttttgtga gggttt 26
<210> 162
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 162
ttaaagcagg atatccacat tgcgta 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 163
ttgctgaaag tccaagagtc ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 164
ggtgagcaat gttcaggaga ttc 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 165
actactagat ccctggacgc tg 22
<210> 166
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 166
ggtggagata agggagtagg ctg 23
<210> 167
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 167
tgcccttcca atggatccac 20
<210> 168
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 168
gtccccagcc caaccctt 18
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 169
ctctggcatt ctgggagctt 20
<210> 170
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 170
tggtaggttt tctgggaagg ga 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 171
tgtcccagaa tgcaagaagc c 21
<210> 172
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 172
ggcattgaag tctcatggaa gcca 24
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 173
acctccgtca tgtgctgtga 20
<210> 174
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 174
ctcaccatcg ctatctgagc a 21
<210> 175
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 175
gcaaccagcc ctgtcgtc 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 176
gcaccaccac actatgtcga a 21
<210> 177
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 177
ttaacccctc ctcccagaga c 21
<210> 178
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 178
ttccagtgtg atgatggtga ggat 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 179
cagcaggcca gtgtgcag 18
<210> 180
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 180
ccggtctctc ccaggaca 18
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 181
gtgaggctcc cctttcttgc 20
<210> 182
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 182
tggtctcctc caccgcttc 19
<210> 183
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 183
gaaactttcc acttgataag aggtcc 26
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 184
ctcccccctg gctccttc 18
<210> 185
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 185
ggggagtagg gccaggaag 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 186
gcccttctgt cttgaacatg agt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 187
gtgggaggct gtcagtgg 18
<210> 188
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 188
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct 50
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 189
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 190
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 190
gtgactggag ttccttggca cccgagaatt cca 33
<210> 191
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 191
cttggcaccc gagaattcca ttgttccttg acgcagag 38
<210> 192
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 192
cttggcaccc gagaattcca gacctggggt atgagcctga 40
<210> 193
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 193
cttggcaccc gagaattcca aggctgaagc tggcgaga 38
<210> 194
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 194
cttggcaccc gagaattcca tgaggacgat ggcagagacg 40
<210> 195
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 195
cttggcaccc gagaattcca gtacagcgaa ggcagagagt 40
<210> 196
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 196
cttggcaccc gagaattcca cacacaggag gaggaaggtg a 41
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 197
cttggcaccc gagaattcca tgtgtggaca tgggctgtg 39
<210> 198
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 198
cttggcaccc gagaattcca acccaagtca ggggcgaa 38
<210> 199
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 199
cttggcaccc gagaattcca gcgtgcaaaa gaaatgccaa gaag 44
<210> 200
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 200
cttggcaccc gagaattcca tagtcactgg cagcaacagt c 41
<210> 201
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 201
cttggcaccc gagaattcca ctgcaaggcc tcgggaga 38
<210> 202
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 202
cttggcaccc gagaattcca attcctggga agtcctcagc t 41
<210> 203
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 203
cttggcaccc gagaattcca gcttggagcc aggtgcct 38
<210> 204
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 204
cttggcaccc gagaattcca catttcccac cctttctcga cgg 43
<210> 205
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 205
cttggcaccc gagaattcca acgggcctgt gtcaagga 38
<210> 206
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 206
cttggcaccc gagaattcca atgcgtcctc gggttcgt 38
<210> 207
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 207
cttggcaccc gagaattcca agcctaggcc gattcgac 38
<210> 208
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 208
cttggcaccc gagaattcca gattcgcggg cacagacg 38
<210> 209
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 209
cttggcaccc gagaattcca ttccagctcc gcctcctc 38
<210> 210
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 210
cttggcaccc gagaattcca cccatatcgt caatcttctc gagg 44
<210> 211
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 211
cttggcaccc gagaattcca tcacagtacc acagagtcta gactc 45
<210> 212
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 212
cttggcaccc gagaattcca aacctcttgt cctccaattt gtcc 44
<210> 213
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 213
cttggcaccc gagaattcca cctgctgcta tgcctcatct tc 42
<210> 214
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 214
cttggcaccc gagaattcca cacgggacca tgcaagacc 39
<210> 215
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 215
cttggcaccc gagaattcca tgggctttcg caagattcct at 42
<210> 216
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 216
cttggcaccc gagaattcca cgtagggctt tcccccact 39
<210> 217
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 217
cttggcaccc gagaattcca cctctattac caattttctt ttgtctttgg g 51
<210> 218
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 218
cttggcaccc gagaattcca acacaatgtg gctatcctgc tt 42
<210> 219
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 219
cttggcaccc gagaattcca ggcaacggtc aggtctct 38
<210> 220
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 220
cttggcaccc gagaattcca ctctgccgat ccatactgcg gaa 43
<210> 221
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 221
cttggcaccc gagaattcca cacttccttt ccatggctgc ta 42
<210> 222
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 222
cttggcaccc gagaattcca ccgtttggga ctctaccgt 39
<210> 223
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 223
cttggcaccc gagaattcca cgtgtgcact tcgcttca 38
<210> 224
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 224
cttggcaccc gagaattcca ttgcccaagg tcttacataa gagg 44
<210> 225
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 225
cttggcaccc gagaattcca gtttgtttaa ggactgggag gagtt 45
<210> 226
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 226
cttggcaccc gagaattcca ggtctgttca ccagcaccat g 41
<210> 227
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 227
cttggcaccc gagaattcca ctgtgccttg ggtggctt 38
<210> 228
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 228
cttggcaccc gagaattcca ttgccttctg atttctttcc ttctatt 47
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 229
cttggcaccc gagaattcca gagtctccgg aacattgttc acc 43
<210> 230
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 230
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 231
cttggcaccc gagaattcca cagctatgtt aatgttaata tgggccta 48
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cttggcaccc gagaattcca gatccactca cagtttccat agg 43
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<213> 人工序列
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cttggcaccc gagaattcca gagaccccag ttgcaaacca g 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 339
cttggcaccc gagaattcca cgcttcttgt cctgcttgct 40
<210> 340
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 340
cttggcaccc gagaattcca acttgataag aggtcccaag acttag 46
<210> 341
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 341
cttggcaccc gagaattcca agcctgggca tccttgag 38
<210> 342
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 342
cttggcaccc gagaattcca caggaagggg ctgaggtc 38
<210> 343
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 343
cttggcaccc gagaattcca catgagtttt ttatggcggg aggt 44
<210> 344
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 344
cttggcaccc gagaattcca cagtggggaa caagaagtgg a 41
<210> 345
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 345
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 346
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 346
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 347
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 347
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataa 27
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