阅读说明：本技术 低起始量血浆游离dna甲基化建库试剂盒及方法 (Kit and method for methylation library construction of low-initial-amount plasma free DNA ) 是由 夏渝东 郑子鹏 沈俊芳 于 2019-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酶法甲基化建库方法,该方法通过TET酶甲基化处理,一定程度地降低甲基化建库过程中DNA的损伤,从而降低核酸样品中DNA的投入量要求；此外,进一步配合本发明的末端修复和加A反应一步试剂,能够实现一管建库,减少纯化步骤；进一步配合本发明的DNA连接酶增强液,能够提高连接效率,提高建库质量和测序质量；并且本发明方法建库起始量低,DNA投入量可低至1ng,适于包括cfDNA在内的微量建库。(The invention discloses an enzymatic methylation library construction method, which reduces the damage of DNA in the methylation library construction process to a certain extent through TET enzyme methylation treatment, thereby reducing the input requirement of the DNA in a nucleic acid sample; in addition, by further matching with the terminal repair and A reaction one-step reagent, one-tube library construction can be realized, and purification steps are reduced; by further matching with the DNA ligase enhancement solution, the ligation efficiency can be improved, and the library construction quality and the sequencing quality can be improved; the method has low initial database building amount and DNA input amount as low as 1ng, and is suitable for micro database building including cfDNA.)

低起始量血浆游离DNA甲基化建库试剂盒及方法

技术领域

本发明属于甲基化测序领域，更具体地涉及一种甲基化建库方法及建库试剂盒。

背景技术

血液游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)是人体组织排放到血液里的DNA片段，在健康人体内，血浆中可以发现少量的游离DNA，片段主要在160～175bp或其整数倍。健康人血浆中的游离DNA主要来源于凋亡细胞。与健康人相比，肿瘤病人的cfDNA含量升高，这些cfDNA可以来自于肿瘤组织，循环肿瘤细胞和正常组织。ctDNA(Circulating tumor DNA)是体液中全部游离循环DNA(cfDNA)的一种，是仅有肿瘤细胞释放的携带有肿瘤特异性遗传学改变的自由基因组片段。ctDNA可以揭示肿瘤综合性的遗传信息，准确反映肿瘤组织的异质性及肿瘤负荷，并且具有在同一患者身上反复进行检测的纵向监测能力。

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。而DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系，研究表明甲基化异常可以作为肿瘤标记物用于血液游离DNA(cfDNA)的检测，DNA甲基化检测在肿瘤早期筛查，动态检测和预后指导中有重要的作用。

目前通过下一代测序来检测甲基化的主要技术是通过重亚硫酸盐处理基因组DNA(Bisulfite方法)，而采用重亚硫酸盐处理DNA会导致DNA的大量损失，这导致甲基化检测需要较高的DNA投入量和较高的扩增循环数的问题。由于cfDNA的含量非常微量，往往难以有效满足基于重亚硫酸盐的甲基化建库方法的DNA投入量要求，并且过高的扩增循环数又会引入更多的测序误差，因此传统的cfDNA甲基化建库质量往往很低。

基于此，提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲基化建库方法及建库试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种甲基化建库方法，包括步骤：

(1)对核酸样品同时进行末端修复和加A反应；

(2)将步骤(1)产物进行甲基化接头连接；

(3)将步骤(2)产物进行酶法甲基化处理，所述酶法甲基化处理步骤依次为TET酶处理、终止TET酶反应、DNA变性处理、胞嘧啶脱氨酶处理；

(4)将步骤(3)产物进行PCR扩增。

可选的，步骤(1)中，核酸样品中DNA含量低至1ng。

可选的，甲基化接头连接试剂包括T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、甲基化接头。

可选的，T4 DNA连接酶缓冲液包括40-80mM Tris-HCl、8-15mM MgCl₂、3-7mM DTT，0.8-1.5mM ATP。

可选的，甲基化接头连接试剂进一步包括DNA连接酶增强液，所述DNA连接酶增强液包括如下a)或b)的组成：

a)氯化六氨合钴

b)氯化六氨合钴和甜菜碱；

可选的，氯化六氨合钴在反应体系的初始浓度为0.1-1mM。

可选的，甜菜碱在反应体系的初始浓度为0.5-3M。

可选的，末端修复和加A反应是一步反应；

所述一步反应的试剂包括：ER/dA酶混合液、ER/dA反应缓冲液。

可选的，ER/dA酶混合液包括T4多核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶。

可选的，在反应体系中的初始浓度：T4多核苷酸激酶为0.2-1U/μl，Taq DNA聚合酶为0.01-0.8U/μl，T4 DNA聚合酶为0.1-1U/μl。

可选的，ER/dA反应缓冲液包括：dATP、dNTP、Tris-HCl、MgCl₂、DTT。

可选的，在反应体系中的初始浓度，dATP为0.1-1nmol/μl、dNTP为0.1-1nmol/μl、Tris-HCl为50-100mM、MgCl₂为5-20mM、DTT为2-10mM。

可选的，步骤(3)的酶法甲基化处理试剂包括Enzymatic Methyl-seq Kit。

可选的，步骤(4)的PCR扩增试剂包括i5 Index Primer，Universal Primer和KAPAHiFi HotStart Uracil+ReadyMix。

可选的，在接头连接、终止TET酶反应、胞嘧啶脱氨酶处理至少一种步骤后还包括纯化步骤。

一种甲基化建库试剂盒，包括：

末端修复和加A反应试剂、甲基化接头连接试剂、酶法甲基化处理试剂、PCR扩增试剂；所述试剂如以上任一项所定义。

可选的，所述试剂盒还包括纯化试剂。

DNA连接酶增强液，包括如下a)或b)的组成：

a)氯化六氨合钴

b)氯化六氨合钴和甜菜碱；

可选的，氯化六氨合钴在反应体系的初始浓度为0.1-1mM；

可选的，甜菜碱在反应体系的初始浓度为0.5-3M。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种酶法甲基化建库方法，该方法通过TET酶甲基化处理，一定程度地降低甲基化建库过程中DNA的损伤，从而降低核酸样品中DNA的投入量要求；此外，进一步配合本发明的末端修复和加A反应一步试剂，能够实现一管建库，减少纯化步骤；进一步配合本发明的DNA连接酶增强液，能够提高连接效率，提高建库质量和测序质量；并且本发明方法建库起始量低，DNA投入量可低至1ng，适于包括cfDNA在内的微量建库。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

鉴于现有技术基于重亚硫酸盐处理处理存在对DNA损伤大、回收率低、DNA投入量大，微量核酸样品建库扩增循环数高、进而建库质量差的缺点。

本发明提出一种甲基化建库方法，包括步骤：

(1)对核酸样品同时进行末端修复和加A反应；

(2)将步骤(1)产物进行甲基化接头连接；

(3)将步骤(2)产物进行酶法甲基化处理，所述酶法甲基化处理步骤依次为TET酶处理、终止TET酶反应、DNA变性处理、胞嘧啶脱氨酶处理；

(4)将步骤(3)产物进行PCR扩增。

本发明通过TET酶处理一定程度地降低甲基化建库过程中DNA的损伤，从而降低核酸样品中DNA的投入量要求。

TET酶是生物体内存在的一种α-酮戊二酸(α-KG)和Fe²⁺依赖的双加氧酶，TET酶家族有三个成员，分别为TET1、TET2和TET3，三种TET酶均具有将5-mC转化为5-hmC的能力。所述TET酶任选TET1、TET2或TET3。

步骤(1)中，末端修复和加A反应可以是一步反应或两步反应，作为一种实施方式，末端修复和加A反应为一步反应，所述一步反应试剂包括：ER/dA酶混合液、ER/dA反应缓冲液。

作为一种实施方式，ER/dA酶混合液包括T4多核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶；可选的，在反应体系中的初始浓度：T4多核苷酸激酶为0.2-1U/μl，Taq DNA聚合酶为0.01-0.8U/μl，T4 DNA聚合酶为0.1-1U/μl。

作为一种实施方式，ER/dA反应缓冲液包括：dATP、dNTP、Tris-HCl、MgCl₂、DTT；可选的，在反应体系中的初始浓度，dATP为0.1-1nmol/μl、dNTP为0.1-1nmol/μl、Tris-HCl为50-100mM、MgCl₂为5-20mM、DTT为2-10mM。

一步反应条件为25-35℃孵育25-40min，然后70-75℃孵育25-40min。

本发明开发的一步反应无需加Klenow Fragment，一步反应能够节约纯化步骤，减少DNA样品的损失，实现一管建库。

步骤(2)中，甲基化接头连接试剂包括：T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、甲基化接头。

作为一种实施方式，T4 DNA连接酶缓冲液包括40-80mM Tris-HCl、8-15mM MgCl₂、3-7mM DTT，0.8-1.5mM ATP。

T4 DNA连接酶在反应体系的浓度为20-50U/μl。

甲基化接头是指接头的C碱基进行了甲基化处理。

作为一种实施方式，接头是由接头1和接头2退火形成，接头在反应体系的10-30pmol/μl

接头1序列为：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’

接头2序列为：5’-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’

作为一种实施方式，甲基化接头连接试剂进一步包括：DNA连接酶增强液，所述DNA连接酶增强液包括如下a)或b)的组成：

a)氯化六氨合钴

b)氯化六氨合钴和甜菜碱；

可选的，氯化六氨合钴在反应体系的初始浓度为0.1-1mM；具体的，其使用浓度典型但非限制的为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM；本发明发现氯化六氨合钴能提高文库质量和测序质量。

可选的，甜菜碱在反应体系的初始浓度为0.5-3M；具体的，其使用浓度典型但非限制的为0.5M、0.8M、1M、1.5M、1.8M、2M、2.5M、3M；本发明发现甜菜碱能够与氯化六氨合钴协同提高文库质量和测序质量。

甲基化接头连接条件通常为25-30℃孵育20-40min。

作为一种实施方式，步骤(3)的酶法甲基化处理试剂包括Enzymatic Methyl-seqKit。

作为一种实施方式，步骤(4)的PCR扩增试剂包括i5 Index Primer，UniversalPrimer和KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix。

其中i5 Index Primer，Universal Primer为illumina适配引物，Index可自行设计，为本领域常规技术。

可选的，在接头连接、终止TET酶反应、胞嘧啶脱氨酶处理至少一种步骤后还包括纯化步骤；纯化试剂如Agencourt AMPure XP Beads。

基于本发明的建库方法，核酸样品的DNA起始量低，且相比传统的重亚硫酸盐甲基化建库法，文库质量及测序质量显著提高。

本发明还提供一种甲基化建库试剂盒，包括：

末端修复和加A反应试剂、甲基化接头连接试剂、酶法甲基化处理试剂、PCR扩增试剂；

所述试剂如本发明甲基化建库方法所定义。

可选的，所述试剂盒还包括纯化试剂。

本发明还提供DNA连接酶增强液，其定义同上所述。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、末端修复和加A

将含核酸的溶液作为模板DNA，进行末端修复和加A反应。

试剂：ER/dA酶混合液(含T4多核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶)、5XER/dA反应缓冲液(含dNTP、Tris-HCl、MgCl₂、DTT)。

50μl反应体系中模板DNA的投入量至少为1ng，T4多核苷酸激酶浓度为0.6U/μl，Taq DNA聚合酶浓度为0.3U/μl，T4 DNA聚合酶浓度为0.5U/μl，dATP浓度为0.15nmol/μl，dNTP浓度为0.3nmol/μl，Tris-HCl浓度为80mM，MgCl₂浓度为15mM，DTT的浓度为7mM。

反应条件：30℃孵育30min，然后72℃孵育30min。

具体反应体系：

试剂	体积μl
		模板DNA	X
无核酸酶水	32.5-X
		5X ER/dA反应缓冲液	10
ER/dA酶混合液	7.5

2、甲基化接头连接

取末端修复加A的产物进行甲基化接头连接。

试剂：T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、甲基化接头。

80μl反应体系中：T4 DNA连接酶浓度为30U/μl；接头是由接头1和接头2退火形成，浓度为15pmol/μl、T4 DNA连接酶缓冲液包括50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、5mM DTT、1mMATP。

接头1序列为：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

接头2序列为：TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T

接头中的C碱基需要做甲基化处理。

反应条件：25℃孵育30min。

具体反应体系：

试剂	体积μl
		末端修复加A的产物	50
无核酸酶水	16.75
		T4 DNA Ligase	4
T4 DNA Ligation Buffer	8
		接头	1.25

反应结束后用Agencourt AMPure XP Beads进行纯化可以得到连接产物。

3、酶法甲基化处理

取连接产物进行甲基化处理，采用Enzymatic Methyl-seq Kit。

(1)TET酶处理

TET酶处理试剂：TET2缓冲液，氧化补充液，氧化增强液，TET2，亚铁溶液。

反应条件为：37℃孵育1小时。

具体反应体系如下：

试剂	体积μl
		连接产物	29
TET2缓冲液	10
		氧化补充液	1
氧化增强液	1
		TET2	4
亚铁溶液	5

(2)终止反应

往TET酶处理产物中加入1ul反应终止剂。

反应条件为：37℃孵育30min。

反应结束后用Agencourt AMPure XP Beads进行纯化可以得到16μl终止反应产物。

(3)DNA变性

往16ul的终止反应产物中加入4ul的0.1mol NaOH溶液。

反应条件为：50℃孵育10min。

(4)胞嘧啶脱氨基

胞嘧啶脱氨基试剂：胞嘧啶脱氨酶反应缓冲液，BSA，胞嘧啶脱氨酶。

反应条件为：37℃孵育3h。

具体反应体系如下：

试剂	体积μl
		DNA变性产物	20
胞嘧啶脱氨酶反应缓冲液	10
		BSA	1
胞嘧啶脱氨酶	1
		无核酸酶水	68

反应结束后用Agencourt AMPure XP Beads进行纯化可以得到甲基化处理产物。

4、PCR扩增

PCR扩增试剂：i5 Index Primer，Universal Primer，KAPA HiFi HotStartUracil+ReadyMix。

反应体系中i5 Index Primer和Universal Primer的浓度均为10pmol；KAPA HiFiHotStart Uracil+ReadyMix的投入体积为15ul。其中i5 Index Primer为标签序列。

反应条件为：98℃1min；98℃15S，60℃30S，72℃30S，若干个循环；72℃1min。其中循环数由建库DNA初始投入量决定，核酸样品为1-10ng时，循环数为18个循环；核酸样品为10-50ng，循环数为12-15个循环；核酸样品＞50ng，循环数8-10个循环。

具体反应体系如下：

反应结束后用Agencourt AMPure XP Beads进行纯化可以得到建库产物。

采用本实施例方法，分别对1ng和10ng的DNA含量样本进行测试(两个重复)，结果如下：

对比例1

将步骤(3)用传统的重亚硫酸盐进行甲基化处理，其余步骤同实施例1。

采用本实施例方法，分别对1ng和10ng的DNA含量样本进行测试(两个重复)，结果如下：

实施例2

本发明设计了一种DNA连接酶增强液，测试其对本发明甲基化建库的作用。

(1)测试氯化六氨合钴对对本发明甲基化建库的作用，以10ngDNA投入量为例，结果如下：

(2)测试甜菜碱对本发明甲基化建库的作用，以10ngDNA投入量为例

从结果显示，氯化六氨合钴能够提高文库质量；进一步添加甜菜碱能够一定程度提高文库质量。

测试例

对发明实施例及对比例构建的文库进行上机测序：文库使用AgilentBioanalyzer 2100配合High sensitivity DNA kit进行片段质检，通过后(主峰在400-500bp)，进行qpcr对文库进行定量。对定量后的文库按照测序数据量比例进行混合并且稀释到2nM,对稀释后的文库进行变性处理。变性处理结束后进行梯度稀释到上机浓度。将稀释好的文库加到测序试剂盒对应的样品孔中并按照对应测序仪的操作规程进行测序。

测序数据如下所示，可见本发明试剂及方法能够加大提高测序质量：