阅读说明：本技术 基于Toe-hold链置换的微小RNA-21细胞内成像及阿霉素药物递送方法 (Method for micro RNA-21 intracellular imaging and adriamycin drug delivery based on Toe-hold strand displacement ) 是由 常津 秦怡 宫晓群 王涛 彭伟盼 于 2019-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种基于Toe-hold链置换的微小RNA-21细胞内成像及阿霉素药物递送方法,包括:基于金纳米粒子的探针制备；体外微小RNA-21的检测；阿霉素的加载与体外释放：将DNA-A、DNA-B、DNA-C互补配对后,加入阿霉素孵育,使阿霉素充分被嵌入DNA双链,之后利用不同浓度的RNA置换DNA-B、DNA-C进而将阿霉素从DNA双链中释放出来,通过酶标仪测定置换前后溶液中阿霉素的荧光值。本发明首次将Toe-hold链置换反应与肿瘤成像、诊断及治疗相结合,可检测出单个癌细胞中微小RNA-21的含量。(The invention discloses a method for micro RNA-21 intracellular imaging and adriamycin drug delivery based on Toe-hold strand displacement, which comprises the steps of preparing a probe based on gold nanoparticles; detecting in vitro micro RNA-21; loading and in vitro Release of Adriamycin: complementary pairing of DNA-A, DNA-B, DNA-C, adding adriamycin for incubation to enable adriamycin to be fully embedded into DNA double strands, replacing the DNA-B, DNA-C with RNA with different concentrations to further release the adriamycin from the DNA double strands, and measuring the fluorescence value of the adriamycin in the solution before and after replacement by a microplate reader. The invention combines the Toe-hold strand displacement reaction with tumor imaging, diagnosis and treatment for the first time, and can detect the content of micro RNA-21 in a single cancer cell.)

基于Toe-hold链置换的微小RNA-21细胞内成像及阿霉素药物 递送方法

技术领域

本发明涉及基因诊断及药物递送领域，更具体的是涉及一种基于Toe-hold链置换的微小RNA-21细胞内成像及阿霉素药物递送方法。

背景技术

微小RNA(miRNA)是一种具有短长度(约22个核苷酸)的内源性非编码小分子，并与信使RNA结合以参与转录后水平的基因表达调控。大量的研究表明，微小RNA的异常表达与各种疾病，特别是与人类肿瘤和癌症密切相关，因此其在肿瘤诊断、治疗和预后中具有重要临床意义。微小RNA的检测方法众多，然而由于探针递送难、易影响细胞信号通路且不能进行清洗分离等问题，原位成像检测成为其中一大挑战。为实现活细胞内微小RNA实时监测与分析，在众多成像技术中，基于荧光探针的荧光成像技术简单、直观、选择性好、灵敏度高及信息量丰富等优点，而广泛用于细胞内肿瘤标志物的检测。

金纳米载体具有被动靶向以及增强药物毒性等优势，广泛应用到肿瘤诊断和成像等领域。其次，使用DNA修饰纳米粒子，通过其序列可编程以及可搭载抗癌药物的功能，能实现药物的有效递送和可控释放。诊断和药物递送一体化策略将荧光探针选择性成像的特点和药物的释放效果进行整合，从而实现对特定靶点的成像与药物精准释放一体化效应。

基于以上背景，本文提出了一种基于Toe-hold链置换的微小RNA-21细胞内成像及阿霉素药物递送方法，实现对微小RNA-21进行原位成像检测的同时，将抗癌药物阿霉素递送到肿瘤细胞中杀死肿瘤细胞。微小RNA-21原位成像检测是通过微小RNA-21结合到Toe-hold1处并置换标记有FAM荧光的DNA序列实现的，阿霉素的递送是通过将其预先嵌入探针DNA双链中，利用细胞内mRNA结合到Toe-hold2处并置换加载阿霉素部位的一条DNA链实现阿霉素的释放。通过探针的设计，只有在微小RNA大量存在的条件下即探针进入癌细胞时，才能开启阿霉素的释放。最终，通过观察分析FAM和阿霉素的荧光进行肿瘤细胞的成像以及药物释放的监测。

发明内容

本发明为克服现有技术的不足，提供一种基于Toe-hold链置换的微小RNA-21细胞内成像及阿霉素药物递送方法。

本发明的技术方案如下：一种基于Toe-hold链置换的微小RNA-21细胞内成像及阿霉素药物递送方法，说明如下：

1)基于金纳米粒子的探针制备方法如下：将设计的三条DNA链标记巯基的DNA-A、标记Cy5荧光的DNA-B以及标记FAM荧光的DNA-C进行互补配对，之后通过巯基化的DNA-A将已配对的三条DNA链修饰在金纳米粒子表面。

2)体外微小RNA-21的检测：将不同浓度的微小RNA-21与探针溶液混合，待充分反应后，通过检测FAM荧光强度的变化，实现对微小RNA的检测；

3)阿霉素的加载与体外释放试验：将DNA-A、DNA-B、DNA-C互补配对后，加入阿霉素孵育，使阿霉素充分被嵌入DNA双链，之后利用不同浓度的RNA置换DNA-B、DNA-C进而将阿霉素从DNA双链中释放出来，通过酶标仪测定置换前后溶液中阿霉素的荧光值。

用于微小RNA-21胞内检测成像及阿霉素释放的探针制备具体如下：

本发明的一种微小RNA-21胞内检测成像及阿霉素释放的探针制备具体如下：

(1)称取24.5mg柠檬酸三钠于烧瓶中并加入37.5mL的双蒸水，将烧瓶置于集热式磁力搅拌器上搅拌加热，待液体快要沸腾时加入0.3mL的三水合氯金酸，搅拌反应10分钟，停止加热，待其自然冷却至室温后，12000r离心20分钟并用双蒸水10倍浓缩重悬，保存于4℃；

(2)将DNA-A、DNA-B和DNA-C按照摩尔比为1：2：2-1：4：4的比例混合于PBS中，37℃反应2小时，使三条DNA链充分互补配对；

(3)将三(2-羧乙基)膦与配对的DNA按与DNA-A摩尔比为100：1的比例混合，室温下涡旋仪上低速旋转1小时；

(4)反应结束后，将10倍浓缩的AuNP按照与当前溶液体积比为1：1的比例混合，在涡旋仪上低速旋转16-24小时；

(5)分多次加入1M的NaCl溶液，使其终浓度达到0.3M；

(6)采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗多次以除去未修饰在AuNP粒子表面的DNA，最后用与加入的金纳米粒子等体积的PBS重悬，得到DNA修饰的AuNP探针。

本发明的一种微小RNA-21胞内检测成像及阿霉素释放的体外微小RNA-21的检测实验具体操作步骤如下：将DNA修饰的AuNP探针与不同浓度的微小RNA-21等体积混合(0-1000nM)，然后将上述混合溶液置于金属浴中，37℃反应1-2h。反应结束后，测定溶液FAM荧光强度。

具体说明如下：

DNA-A链与DNA-B、DNA-C互补配对之后，在其5’末端延伸出10个碱基作为微小RNA的Toe-hold，微小RNA可以先结合到DNA-A的Toe-hold处，逐渐与DNA-A互补配对的同时，将DNA-C链进行置换，进而将其释放，远离AuNP进而恢复FAM的荧光，用于定量监测微小RNA。这种由Toe-hold介导的链置换反应Toe-hold长度仅需要4个碱基微小RNA就可以结合并实现链置换，且这一过程无需酶等物质的参与，可自发进行，适合用于细胞复杂液体环境下的反应。

本发明的一种用于微小RNA-21胞内检测成像及阿霉素释放的阿霉素的加载与体外释放试验具体如下：将DNA-A、DNA-B、DNA-C按照摩尔比为1：2：2-1：4：4于PBS中在37℃下反应1-2h，使三者充分互补配对，反应结束后将与DNA-A摩尔比为2：1-10：1的盐酸阿霉素与DNA溶液混合，室温下在涡旋仪上低速旋转1h使阿霉素嵌入DNA双链中，反应结束后用多功能酶标仪检测载入DOX前后溶液的荧光值(激发波长：475-485nm，发射波长585-595nm)。将微小RNA-21和mRNA加入溶液中，使其终浓度为1μM，将上述混合溶液置于金属浴中，37℃反应1-2h。反应结束后，测定反应前后溶液阿霉素的荧光强度。

具体说明如下：阿霉素是是一种蒽环类抗生素，抗瘤谱广，可广泛应用于血液系统肿瘤、乳腺癌、肺癌等众多癌症的治疗，其平面芳香族分子的发色团部分能够优先嵌入到DNA双链的GC碱基对之间，嵌入DNA之后可使其荧光减弱，当微小RNA和mRNA置换DNA-B、DNA-C的同时可将阿霉素从DNA双链中释放出来，进而恢复其荧光，这种荧光强度的变化可通过酶标仪进行检测。

采用探针与细胞共孵育方式进行细胞内微小RNA-21的检测成像及阿霉素的释放。

1)将用完全培养基20-30倍稀释的金纳米粒子探针加入长满80％-90％6cm细胞培养皿的海拉细胞中，在37℃培养箱中培养4-7h，使探针充分被海拉细胞内吞。

2)用PBS清洗2-3次，洗去未吞入细胞的探针。

3)最后加入完全培养基，在荧光倒置显微镜下进行观察,利用FAM进行细胞成像，根据是否能观察到阿霉素的荧光进行定性分析其是否从探针DNA双链中释放入细胞。

细胞内微小RNA-21的定量则是将完成探针内吞的细胞用胰酶进行消化，利用流式细胞仪收取10000个细胞的FAM荧光值，根据在体外建立的FAM荧光值与微小RNA-21浓度的相对应关联公式，实现对微小RNA-21的定量检测。

检测结果

(1)定性检测：在海拉细胞中过表达微小RNA-21的条件下，微小RNA-21可以结合到内吞入细胞的探针上并能将标记有FAM荧光的DNA-C置换使其荧光恢复，进而在荧光倒置显微镜下能观察到FAM荧光的变化，实现利用癌细胞内微小RNA-21的成像。

(2)定量检测：利用流式细胞仪收取一定数量细胞的FAM荧光值，根据FAM荧光强度与不同微小RNA-21浓度的相对应关联公式，计算出海拉细胞中微小RNA-21的浓度。

本发明制备的一种用于微小RNA-21细胞内检测成像及阿霉素药物递送方法，优势在于：

1、本发明首次将Toe-hold链置换反应与肿瘤成像、诊断及治疗相结合，可检测出单个癌细胞中微小RNA-21的含量，与其他方法检测结果一致，并利用微小RNA-21进行了肿瘤细胞的成像，为癌症的诊疗一体化提供了新思路。

2、本发明所设计的探针可有效诊断区别出正常细胞与肿瘤细胞，实现了阿霉素在肿瘤细胞中的有效释放而使其在正常细胞中无法大量释放，大大降低了阿霉素对正常细胞的毒副作用。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的金纳米粒子探针可用于微小RNA-21和阿霉素的释放的验证：图a为加入RNA后溶液的颜色变化；图b为琼脂糖胶电泳证明RNA成功将DNA-B和DNA-C进行置换(其中1为金纳米粒子探针、2-3分别在探针中加入mRNA、微小RNA、微小RNA和mRNA)。

图2为本发明实施例1制备的辣金纳米粒子探针用于微小RNA-21的体外检测：

a-不同浓度微小RNA-21检测荧光图；b-不同浓度微小RNA-21检测趋势图；

c-不同浓度微小RNA-21检测标准曲线。

图3为本发明实施例3将不同浓度的阿霉素载入DNA双链中的荧光强度。

图4为本发明实施例1(1)制备的辣根过氧化物酶标探针用于细胞内微小RNA-21的检测成像以及阿霉素的释放：

图中分别为明场、FAM、阿霉素和融合的图像。

具体实施方式

下面的实施案例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实施例1：

称取24.5mg柠檬酸三钠于烧瓶中并加入37.5mL的双蒸水，将烧瓶置于集热式磁力搅拌器上搅拌加热，待液体快要沸腾时加入0.3mL的三水合氯金酸，搅拌反应10分钟，停止加热，待其自然冷却至室温后，12000r离心20分钟并用双蒸水10倍浓缩重悬，保存于4℃；将DNA-A、DNA-B和DNA-C按照摩尔比为1：2：2的比例混合于PBS中，37℃反应2小时，使三条DNA链充分互补配对；将三(2-羧乙基)膦与配对的DNA按与DNA-A摩尔比为100：1的比例混合，室温下涡旋仪上低速旋转1小时；反应结束后，将10倍浓缩的AuNP按照与当前溶液体积比为1：1的比例混合，在涡旋仪上低速旋转16-24小时；分多次加入1M的NaCl溶液，使其终浓度达到0.3M；采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗多次以除去未修饰在AuNP粒子表面的DNA，最后用与加入的金纳米粒子等体积的PBS重悬，得到DNA修饰的AuNP探针。取10μL探针分别加入微小RNA和微小RNA与mRNA(对应图1中3、4号)，使微小RNA和mRNA的终浓度为1μM,在37℃下反应2h，用C600进行成像，之后进行琼脂糖凝胶电泳。

实施例2：

将实施例1中制备的探针与不同浓度的微小RNA-21(0、1、5、10、50、100、250、500、1000nM)等体积混合，然后将上述混合溶液置于金属浴中，37℃反应2h。反应结束后，测定溶液FAM荧光强度。随着微小RNA浓度的增加，FAM的荧光值逐渐增加，如图a、b，取图b微小RNA浓度为0-100nM的线性区间做标准曲线得出微小RNA与荧光值之间的关系，如图c。

实施例3：

(1)将DNA-A、DNA-B、DNA-C按照摩尔比为1：2：2于PBS中在37℃下反应2h，使三者充分互补配对，反应结束后将DNA溶液加入终浓度为1μM阿霉素溶液中，并使DNA-A与阿霉素的摩尔比为0.01，室温下在涡旋仪上低速旋转1h使阿霉素嵌入DNA双链中，反应结束后用多功能酶标仪检测溶液的荧光值(激发波长：475-485nm，发射波长585-595nm)。

(2)将DNA-A、DNA-B、DNA-C按照摩尔比为1：2：2于PBS中在37℃下反应2h，使三者充分互补配对，反应结束后将DNA溶液加入终浓度为1μM阿霉素溶液中，并使DNA-A与阿霉素的摩尔比为0.03，室温下在涡旋仪上低速旋转1h使阿霉素嵌入DNA双链中，反应结束后用多功能酶标仪检测溶液的荧光值(激发波长：475-485nm，发射波长585-595nm)。

(3)将DNA-A、DNA-B、DNA-C按照摩尔比为1：2：2于PBS中在37℃下反应2h，使三者充分互补配对，反应结束后将DNA溶液加入终浓度为1μM阿霉素溶液中，并使DNA-A与阿霉素的摩尔比为0.05，室温下在涡旋仪上低速旋转1h使阿霉素嵌入DNA双链中，反应结束后用多功能酶标仪检测溶液的荧光值(激发波长：475-485nm，发射波长585-595nm)。

(4)将DNA-A、DNA-B、DNA-C按照摩尔比为1：2：2于PBS中在37℃下反应2h，使三者充分互补配对，反应结束后将DNA溶液加入终浓度为1μM阿霉素溶液中，并使DNA-A与阿霉素的摩尔比为0.1，室温下在涡旋仪上低速旋转1h使阿霉素嵌入DNA双链中，反应结束后用多功能酶标仪检测溶液的荧光值(激发波长：475-485nm，发射波长585-595nm)。

(5)将DNA-A、DNA-B、DNA-C按照摩尔比为1：2：2于PBS中在37℃下反应2h，使三者充分互补配对，反应结束后将DNA溶液加入终浓度为1μM阿霉素溶液中，并使DNA-A与阿霉素的摩尔比为0.3，室温下在涡旋仪上低速旋转1h使阿霉素嵌入DNA双链中，反应结束后用多功能酶标仪检测溶液的荧光值(激发波长：475-485nm，发射波长585-595nm)。

(6)将DNA-A、DNA-B、DNA-C按照摩尔比为1：2：2于PBS中在37℃下反应2h，使三者充分互补配对，反应结束后将DNA溶液加入终浓度为1μM阿霉素溶液中，并使DNA-A与阿霉素的摩尔比为0.5，室温下在涡旋仪上低速旋转1h使阿霉素嵌入DNA双链中，反应结束后用多功能酶标仪检测溶液的荧光值(激发波长：475-485nm，发射波长585-595nm)。

实施例4：

采用探针与细胞共孵育方式进行细胞内微小RNA-21的检测成像及阿霉素的释放。将用完全培养基20-30倍稀释的金纳米粒子探针加入长满80％-90％6cm细胞培养皿的海拉细胞中，在37℃培养箱中培养4-7h，使探针充分被海拉细胞内吞。之后，用PBS清洗2-3次，洗去未吞入细胞的探针。最后加入完全培养基，在荧光倒置显微镜下进行观察,利用FAM进行细胞成像，根据是否能观察到阿霉素的荧光进行定性分析其是否从探针DNA双链中释放入细胞。