一种催化能力提高的淀粉分支酶突变体
阅读说明：本技术 一种催化能力提高的淀粉分支酶突变体 (Starch branching enzyme mutant with improved catalytic capability ) 是由 李兆丰 顾正彪 江海旻 李才明 班宵逢 程力 洪雁 于 2019-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种催化能力提高的淀粉分支酶突变体,属于酶工程技术领域。本发明通过将淀粉分支酶中的底物结合位点附近不带电的氨基酸残基突变为带负电荷的外源性氨基酸残基,得到催化能力提高的淀粉分支酶突变体,与野生型淀粉分支酶相比,本发明所得的淀粉分支酶突变体R158T、Q489E改性产物α-1,6糖苷键相对含量分别为8.2％和10.7％,较淀粉分支酶野生型改性产物提高了10.81％和44.59％。(The invention discloses a starch branching enzyme mutant with improved catalytic capability, and belongs to the technical field of enzyme engineering. The invention obtains the starch branching enzyme mutant with improved catalytic capability by mutating uncharged amino acid residues near a substrate binding site in the starch branching enzyme into exogenous amino acid residues with negative charges, and compared with wild type starch branching enzyme, the starch branching enzyme mutant has the relative contents of alpha-1, 6 glycosidic bonds of modified products of R158T and Q489E which are respectively 8.2 percent and 10.7 percent, and are improved by 10.81 percent and 44.59 percent compared with the wild type modified product of the starch branching enzyme.)
技术领域
本发明涉及一种催化能力提高的淀粉分支酶突变体，属于酶工程技术领域。
背景技术
淀粉广泛存在于自然界中，在食品、医疗等工业方面有广阔的应用潜力，然而天然淀粉存在着易回生、稳定性差、溶解度低等问题，限制了它在工业上的应用。造成这些问题的根本原因在于，天然淀粉含有很多线性长链大分子或分支程度较低的支链分子，这些分子容易通过氢键的作用相互缔合，从而出现回生。而淀粉分子之间相互缔合的容易程度与其分支度有关，与分支度低的淀粉分子相比，分支度高的淀粉分子之间具有更大的空间位阻，故比较不容易相互缔合。因此，若能提高淀粉分子的分支度，则可以有效地改善淀粉的使用缺陷。
淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme；EC 2.4.1.18)是属于α-淀粉酶家族的一类糖基转移酶，能够催化水解淀粉分子α-1,4-糖苷键，产生具有非还原性末端的游离短链，再通过转糖苷作用将其以α-1,6-糖苷键的形式连接至受体链上，由此形成新的α-1,6-分支点。
通过这种转糖基反应，淀粉分支酶可增加淀粉的分支度，提高淀粉的抗消化性和慢消化性，延缓淀粉的回生过程，增强淀粉的稳定性并改善淀粉的使用性能，用于生产具有良好应用价值的淀粉衍生物。因此，淀粉分支酶由于其特有的转糖苷作用而成为生物酶法改性淀粉领域的重要淀粉酶类。
目前，关于用淀粉分支酶改性淀粉从而提高淀粉分支度的报道有很多，然而淀粉分支度提升的程度有限，因此需要对酶进行改造以进一步增强其催化的能力。通常用于改造淀粉分支酶的方法包括物理法、化学法和生物法。相比于物理法和化学法，生物法主要通过蛋白质工程、基因工程等技术手段，从根本上改变酶蛋白分子的空间构象，改善酶蛋白的使用性能，生物法的稳定性更高、安全性更好。但现有的淀粉分支酶只能使产物的分支度达到7％左右。因此，有必要获得一种催化能力提高的淀粉分支酶突变体，其作用于淀粉能生成分支度更高的产物。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种催化能力提高的淀粉分支酶突变体，所述淀粉分支酶突变体含SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
所述淀粉分支酶突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶为亲本酶，将第158位的精氨酸突变为苏氨酸，或将第489位的谷氨酰胺突变为谷氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述亲本酶来源于极端嗜热菌(Rhodothermusobamensis)STB05，所述极端嗜热菌(Rhodothermus obamensis)STB05引用自文献：王哲,辛辰昊,李才明,等.一种极端嗜热淀粉分支酶的表达、纯化及酶学性质研究[J].2019.。
本发明提供了编码上述催化能力提高的淀粉分支酶突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.10所示。
本发明提供了含上述基因的质粒或载体。
本发明提供了携带上述基因的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-20b(+)为表达载体，以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主。
本发明提供了一种提高淀粉分支酶催化能力的方法，是将来源于极端嗜热菌(Rhodothermus obamensis)STB05的淀粉分支酶第158位的精氨酸突变为苏氨酸，或将第489位的谷氨酰胺突变为谷氨酸，所述来源于极端嗜热菌(Rhodothermus obamensis)STB05的淀粉分支酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所示淀粉分支酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明提供了上述淀粉分支酶突变体在水解淀粉方面的应用。
本发明提供了上述基因工程菌在水解淀粉方面的应用。
本发明提供了上述淀粉分支酶突变体在食品领域中的应用。
本发明提供了上述基因工程菌在食品领域中的应用。
本发明的有益效果：
本发明是通过将淀粉分支酶突变体为将淀粉分支酶中的底物结合位点附近不带电的氨基酸残基突变为带负电荷的外源性氨基酸残基，得到催化能力提高的淀粉分支酶突变体。与野生型淀粉分支酶相比，本发明所得的淀粉分支酶突变体以5％(w/w)玉米淀粉溶液为底物，产物分支度分别达到8.2％(R158T)和10.7％(Q489E)，较野生型分别提高了10.81％和44.59％。
附图说明
图1为本发明实施例中各淀粉分支酶野生型及突变体改性前后产物的1H NMR图谱。
图2为本发明实施例中各淀粉分支酶野生型及突变体改性前后产物的α-1,6糖苷键相对含量。
具体实施方式
本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。
本发明涉及的检测方法如下：
(一)α-1,6糖苷键相对含量的测定方法
准确称取20mg样品，溶解于1mL重水中，沸水浴糊化后通过1H NMR(核磁共振氢谱)进行测定。根据计算谱图中α-1,4-糖苷键与α-1,6-糖苷键对应吸收峰的峰面积比例得到α-1,6-糖苷键相对含量。
(二)淀粉分支酶活力的测定方法
用50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)配制0.25％(w/v)的马铃薯支链淀粉溶液作为酶反应的底物，取900μL底物在65℃下保温10min，加入100μL淀粉分支酶后混合均匀并置于65℃水浴条件下反应15min。沸水30min浴灭酶终止反应。待冷却至室温后取300μL反应混合液加入5mL显色液(0.05％(w/v)KI，0.005％(w/v)I2，pH 6.0)置于室温下静置以充分显色。显色15min后在530nm处测定吸光值。
一个酶活力单位(U/mL)定义为：在530nm处，吸光值每分钟降低1％为一个酶活单位。
(三)培养基
LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。
TB培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，KH2PO4 2.3136g/L，K2HPO416.4318g/L，pH 7.0。
实施例1：淀粉分支酶突变体的制备
将来源于Rhodothermus obamensis STB05的淀粉分支酶与来源于Escherichiacoli结合了麦芽七糖的分支酶(引用自文献：Feng L,Fawaz R,Hovde S,et al.CrystalStructures of Escherichia coli Branching Enzyme in Complex with LinearOligosaccharides[J].Biochemistry,2015,54(40):6207-18.)晶体结构overlap，以后者为模板，通过比较底物结合位点氨基酸与底物之间的距离，分别选择了与底物距离较远的158位点和距离较近的489位点，设计了R158T(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码其的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)和Q489E突变体(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码其的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)。
以Rhodothermus obamensis STB05基因组DNA为模板，采用PCR法扩增得到两端分别含Nde I和Xho I限制性酶切位点的gbe基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，将其***到pMD 18-T simple质粒中得到克隆载体pMD 18-T simple/gbe，载体经双酶切后回收含有粘性末端的目的基因片段，并***到经相同内切酶处理过的pET-20b(+)质粒中，得到表达载体pET-20b(+)/gbe。
以表达载体pET-20b(+)/gbe为模板，设计互补引物链(见表1)，引物由金唯智生物科技有限公司合成，参照TaKaRa公司STAR Primer GXL试剂盒说明书所示方法进行定点突变。PCR反应体系依照STAR Primer试剂盒说明书中所设定条件：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)10μL，模板DNA 1μL，正向和反向引物(10μM)均为1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，最后加入超纯水32.5μL。PCR扩增条件为：98℃条件下预变性5min；随后以98℃10s，55℃10s，72℃7min为一个循环，在以上条件下进行35个循环；最后72℃下保温15min。
表1淀粉分支酶突变位点的引物
1下划线碱基对应于相应突变氨基酸。
实施例2：含有表达本发明淀粉分支酶突变体基因的基因工程菌的构建
在37℃下，用DpnI处理PCR产物2h，随后将处理好的PCR产物转化到E.coli JM 109中，将转化的E.coli JM 109涂布到含有100μg/mL氨苄霉素的LB琼脂培养基中，在37℃恒温箱中过夜培养12h，从中挑选出单菌落接种到含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃下、200r/min培养过夜并按照质粒提取试剂盒说明书所示方法提取质粒鉴定测序。将构建好的目的质粒通过化学转化法转入表达宿主E.coli BL21(DE3)感受态中。最终得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/gbe)。
实施例3：本发明淀粉分支酶突变体的表达
宿主菌活化培养：将E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/gbe)在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取阳性单菌落接种于含有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中。将该离心管置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养8-10h。
发酵培养：将活化好的菌种培养液1mL接种于含有50mL TB液体培养基的250mL三角瓶中，并置于回转式摇床中以200r/min的速率，在37℃下培养96h。
各培养基在使用前添加终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素。
实施例4：本发明淀粉分支酶突变体的酶活检测
以50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)配制浓度为0.25％(w/v)的马铃薯支链淀粉溶液，加入一定量的淀粉分支酶野生型和突变体R158T、Q489E分别在65℃下进行反应并按照上述所示方法测定淀粉分支酶突变体的活力。酶活检测结果如表2所示，突变体R158T、Q489E的酶活与野生型相比无显著性差异，这说明这些定点突变并未造成淀粉分支酶的总活力降低。
表2野生型和突变体GBE的酶活力
1每个值为3次平行实验的平均值。
实施例5：本发明淀粉分支酶突变体的产物分支度分析
准确称取玉米淀粉溶于pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(50mmol/L)，配制成5％w/v(以干基计)的淀粉乳，混合均匀后沸水浴30min后，置于65℃水浴摇床中(转速160r/min)保温15min。分别添加100U/g Ro-GBE野生型、突变体R158T、Q489E反应12h后，沸水浴30min。样品于-80℃超低温冰箱中放置12h后，冷冻干燥72h，研磨过100目筛，备用。分别称取20mg原玉米淀粉(对照)及其改性样品溶于1mL重水中，通过1H NMR(核磁共振氢谱)进行测定。
通过计算谱图中α-1,4-糖苷键与α-1,6-糖苷键对应吸收峰的峰面积可得到α-1,6-糖苷键的相对含量，结果如表3、图1、图2所示。突变体R158T、Q489E的改性产物α-1,6糖苷键相对含量分别为8.2％和10.7％，与野生型相比，突变体改性产物的分支度分别提高了10.81％和44.59％，说明尽管定点突变并未改变淀粉分支酶的活力，却提高了其转苷催化的能力。这可能是由于淀粉分支酶的总活力包括水解活力和分支活力，而R158T和Q489E位点的突变使其在保持总活力的情况下，提高了分支活力在总活力中的占比，从而使淀粉分支酶在淀粉改性过程中更倾向于转苷反应，从而使产物的分支度进一步提高。
表3淀粉分支酶改性前后的产物分支度
1每个值为3次平行实验的平均值。——指淀粉本身的α-1,6糖苷键相对含量。
对比例1
以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶为亲本酶，将第489位的谷氨酰胺突变为甘氨酸，其余步骤与实施例一致。结果表明，Q489G改性后样品的α-1,6糖苷键相对含量为7.27％，与野生型相比降低了1.89％。
对比例2
以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶为亲本酶，将第489位的谷氨酰胺突变为精氨酸，其余步骤与实施例一致。结果表明，Q489R改性后样品的α-1,6糖苷键相对含量为7.41％，与野生型相比无显著性差异。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种催化能力提高的淀粉分支酶突变体
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 621
<212> PRT
<213> Rhodothermus obamensis
<400> 1
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Leu Phe Val Leu Asn Phe Thr Pro Val Pro Arg Glu His Tyr Arg Val
545 550 555 560
Gly Val Pro Ile Gly Gly Pro Trp His Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala
565 570 575
Val Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Met Gly Asn Phe Gly Arg Val Glu Ala
580 585 590
Val Pro Glu Ser Trp His Gly Arg Pro Phe His Leu Glu Leu Thr Leu
595 600 605
Pro Pro Leu Ala Ala Leu Ile Leu Glu Pro Glu His Gly
610 615 620
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggcgtcaca aaactcccgg cgagtccttc tcttaccggg agatt 45
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
actcgccggg agttttgtga cgccaggagc ccagatgtac ct 42
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgctggacg aaccctacca tcgaggtatt cagctgt 37
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggtagggt tcgtccagca ggtgccattc gagct 35
<210> 8
<211> 1890
<212> DNA
<213> Rhodothermus obamensis
<400> 8
catatgagct ggctcacgga agaagacatc cggcgctggg aaagcggtac gttctacgac 60
agttaccgaa agctgggcgc ccatcccgac gacgaaggca cctggttctg cgtctgggcg 120
ccgcatgccg atggcgtctc ggtgctcgga gcgttcaacg actggaatcc ggaggccaac 180
ccgctggagc gctacggcgg cggcctgtgg gccggttacg taccgggagc gcgcccgggc 240
cacacctaca agtatcgcat ccggcacggc ttctatcagg ccgacaagac ggatccctac 300
gccttcgcca tggagccgcc taccggcagt cccatcgaag ggctggcctc catcatcacg 360
cggctcgact acacctggca cgacgacgaa tggatgcggc gccggaaggg tccggccagc 420
ctttacgagc cggtttccat ctacgaggta catctgggct cctggcgtca caaacggccc 480
ggcgagtcct tctcttaccg ggagattgcc gagccgctgg ccgactacgt gcaggagatg 540
ggcttcacgc acgtggagct gctgcccgtc atggaacatc cctactacgg ctcctggggc 600
tatcaggtgg tgggctacta cgccccaacg tttcgctacg gatcacccca ggacctgatg 660
tacctgatcg actacctgca ccagcgcggc atcggcgtca tcctcgactg ggtcccgagc 720
cactttgcgg ccgatcccca gggactggtt ttcttcgacg ggaccacact cttcgaatac 780
gacgatccca agatgcgcta tcaccctgac tggggtacgt atgtgttcga ttacaacaag 840
ccgggcgtac gcaactttct gatttccaac gcacttttct ggctcgaaaa gtaccacgtc 900
gacgggctgc gcgtcgatgc ggtggcttct atgctctacc gggactactc acgcaaggag 960
tggacaccca acatcttcgg cggccgtgaa aacctggagg ccattgattt catcaagaaa 1020
ttcaacgaaa cggtctacct gcacttcccc gaggccatga cgatcgccga ggagtcgacg 1080
gcctggcccg gcgtgtcggc ccccacctac aacaacggtc tgggcttcct ctacaagtgg 1140
aacatgggct ggatgcacga cacgctggac tacatccagc gcgatcccat ctaccgcaag 1200
tatcaccacg acgagctgac cttctcgctc tggtacgcct tttcggagca ctacgtcctg 1260
ccgctctcgc acgacgaggt ggtgcacggc aagggctcgc tctggggtaa aatgcccggc 1320
gacgactggc agaaggcagc caacttgcgc ctgctctttg gccacatgtg gggccatccg 1380
ggcaaaaaac tgctcttcat gggcggcgag ttcggccagc accacgagtg gaaccacgac 1440
acgcagctcg aatggcacct gctggaccag ccctaccatc gaggtattca gctgtgggtg 1500
tgcgatctga accacctcta ccgtacgaat ccggccctct ggcacgacgg accggaaggg 1560
ttcgagtgga tcgacttcag cgaccgcgac cagagcgtga tctgttacct gcgcaagaat 1620
gccggccgca tgctgctgtt cgtgctgaac tttacgcccg tgccacgcga gcactaccgc 1680
gtgggcgtgc cgatcggtgg cccctggcac gaggtgctca acagcgacgc ggtggcctac 1740
ggcgggagcg ggatgggcaa cttcggccgc gtcgaggcgg tgcccgagtc ctggcacggc 1800
cgccccttcc acttagagct gacgcttccc ccgctggccg ccctcatcct ggagccggag 1860
cacgggctcg agcaccacca ccaccaccac 1890
<210> 9
<211> 1890
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
catatgagct ggctcacgga agaagacatc cggcgctggg aaagcggtac gttctacgac 60
agttaccgaa agctgggcgc ccatcccgac gacgaaggca cctggttctg cgtctgggcg 120
ccgcatgccg atggcgtctc ggtgctcgga gcgttcaacg actggaatcc ggaggccaac 180
ccgctggagc gctacggcgg cggcctgtgg gccggttacg taccgggagc gcgcccgggc 240
cacacctaca agtatcgcat ccggcacggc ttctatcagg ccgacaagac ggatccctac 300
gccttcgcca tggagccgcc taccggcagt cccatcgaag ggctggcctc catcatcacg 360
cggctcgact acacctggca cgacgacgaa tggatgcggc gccggaaggg tccggccagc 420
ctttacgagc cggtttccat ctacgaggta catctgggct cctggcgtca caaaactccc 480
ggcgagtcct tctcttaccg ggagattgcc gagccgctgg ccgactacgt gcaggagatg 540
ggcttcacgc acgtggagct gctgcccgtc atggaacatc cctactacgg ctcctggggc 600
tatcaggtgg tgggctacta cgccccaacg tttcgctacg gatcacccca ggacctgatg 660
tacctgatcg actacctgca ccagcgcggc atcggcgtca tcctcgactg ggtcccgagc 720
cactttgcgg ccgatcccca gggactggtt ttcttcgacg ggaccacact cttcgaatac 780
gacgatccca agatgcgcta tcaccctgac tggggtacgt atgtgttcga ttacaacaag 840
ccgggcgtac gcaactttct gatttccaac gcacttttct ggctcgaaaa gtaccacgtc 900
gacgggctgc gcgtcgatgc ggtggcttct atgctctacc gggactactc acgcaaggag 960
tggacaccca acatcttcgg cggccgtgaa aacctggagg ccattgattt catcaagaaa 1020
ttcaacgaaa cggtctacct gcacttcccc gaggccatga cgatcgccga ggagtcgacg 1080
gcctggcccg gcgtgtcggc ccccacctac aacaacggtc tgggcttcct ctacaagtgg 1140
aacatgggct ggatgcacga cacgctggac tacatccagc gcgatcccat ctaccgcaag 1200
tatcaccacg acgagctgac cttctcgctc tggtacgcct tttcggagca ctacgtcctg 1260
ccgctctcgc acgacgaggt ggtgcacggc aagggctcgc tctggggtaa aatgcccggc 1320
gacgactggc agaaggcagc caacttgcgc ctgctctttg gccacatgtg gggccatccg 1380
ggcaaaaaac tgctcttcat gggcggcgag ttcggccagc accacgagtg gaaccacgac 1440
acgcagctcg aatggcacct gctggaccag ccctaccatc gaggtattca gctgtgggtg 1500
tgcgatctga accacctcta ccgtacgaat ccggccctct ggcacgacgg accggaaggg 1560
ttcgagtgga tcgacttcag cgaccgcgac cagagcgtga tctgttacct gcgcaagaat 1620
gccggccgca tgctgctgtt cgtgctgaac tttacgcccg tgccacgcga gcactaccgc 1680
gtgggcgtgc cgatcggtgg cccctggcac gaggtgctca acagcgacgc ggtggcctac 1740
ggcgggagcg ggatgggcaa cttcggccgc gtcgaggcgg tgcccgagtc ctggcacggc 1800
cgccccttcc acttagagct gacgcttccc ccgctggccg ccctcatcct ggagccggag 1860
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<210> 10
<211> 1890
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
catatgagct ggctcacgga agaagacatc cggcgctggg aaagcggtac gttctacgac 60
agttaccgaa agctgggcgc ccatcccgac gacgaaggca cctggttctg cgtctgggcg 120
ccgcatgccg atggcgtctc ggtgctcgga gcgttcaacg actggaatcc ggaggccaac 180
ccgctggagc gctacggcgg cggcctgtgg gccggttacg taccgggagc gcgcccgggc 240
cacacctaca agtatcgcat ccggcacggc ttctatcagg ccgacaagac ggatccctac 300
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cggctcgact acacctggca cgacgacgaa tggatgcggc gccggaaggg tccggccagc 420
ctttacgagc cggtttccat ctacgaggta catctgggct cctggcgtca caaacggccc 480
ggcgagtcct tctcttaccg ggagattgcc gagccgctgg ccgactacgt gcaggagatg 540
ggcttcacgc acgtggagct gctgcccgtc atggaacatc cctactacgg ctcctggggc 600
tatcaggtgg tgggctacta cgccccaacg tttcgctacg gatcacccca ggacctgatg 660
tacctgatcg actacctgca ccagcgcggc atcggcgtca tcctcgactg ggtcccgagc 720
cactttgcgg ccgatcccca gggactggtt ttcttcgacg ggaccacact cttcgaatac 780
gacgatccca agatgcgcta tcaccctgac tggggtacgt atgtgttcga ttacaacaag 840
ccgggcgtac gcaactttct gatttccaac gcacttttct ggctcgaaaa gtaccacgtc 900
gacgggctgc gcgtcgatgc ggtggcttct atgctctacc gggactactc acgcaaggag 960
tggacaccca acatcttcgg cggccgtgaa aacctggagg ccattgattt catcaagaaa 1020
ttcaacgaaa cggtctacct gcacttcccc gaggccatga cgatcgccga ggagtcgacg 1080
gcctggcccg gcgtgtcggc ccccacctac aacaacggtc tgggcttcct ctacaagtgg 1140
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tatcaccacg acgagctgac cttctcgctc tggtacgcct tttcggagca ctacgtcctg 1260
ccgctctcgc acgacgaggt ggtgcacggc aagggctcgc tctggggtaa aatgcccggc 1320
gacgactggc agaaggcagc caacttgcgc ctgctctttg gccacatgtg gggccatccg 1380
ggcaaaaaac tgctcttcat gggcggcgag ttcggccagc accacgagtg gaaccacgac 1440
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tgcgatctga accacctcta ccgtacgaat ccggccctct ggcacgacgg accggaaggg 1560
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gccggccgca tgctgctgtt cgtgctgaac tttacgcccg tgccacgcga gcactaccgc 1680
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cgccccttcc acttagagct gacgcttccc ccgctggccg ccctcatcct ggagccggag 1860
cacgggctcg agcaccacca ccaccaccac 1890