一种耐受性提高的突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用

文档序号：1624372 发布日期：2020-01-14 浏览：19次 >En<

阅读说明：本技术 一种耐受性提高的突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用 (Mutant Taq DNA polymerase with improved tolerance as well as preparation method and application thereof ) 是由贡怡冯速徐晓昱刘来花曹林张力军聂俊伟瞿志鹏于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种耐受性提高的突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用,本发明所述的一种突变型Taq DNA聚合酶,其是对如SEQ ID NO.1所示的Taq DNA聚合酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多个氨基酸,且与SEQ ID NO.1所示的Taq DNA聚合酶相比,其杂质耐受性显著增强的氨基酸序列。本发明的重组型Taq DNA聚合酶突变体对血液、荧光染料及高离子强度的耐受性明显增强,能够直接进行血液样品的PCR反应检测,节约时间,避免假阴性。(The invention discloses mutant Taq DNA polymerase with improved tolerance as well as a preparation method and application thereof, and the mutant Taq DNA polymerase is an amino acid sequence which inserts, substitutes or deletes 1 or more amino acids in an amino acid sequence of the Taq DNA polymerase shown in SEQ ID NO.1 and has obviously enhanced impurity tolerance compared with the Taq DNA polymerase shown in SEQ ID NO. 1. The recombinant Taq DNA polymerase mutant provided by the invention has obviously enhanced tolerance to blood, fluorescent dye and high ionic strength, can be used for directly carrying out PCR reaction detection on a blood sample, saves time and avoids false negative.)

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种耐受性提高的突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术

DNA聚合酶是一类使用单链DNA作为模板来合成互补DNA链的酶。DNA聚合酶可以将游离核苷酸添加到新形成链的3'末端，使新链以5'-3'方向延伸。大多数DNA聚合酶是具有聚合和核酸外切活性的多功能蛋白质(例如，3'-5'外切核酸酶或5'-3'外切核酸酶活性)。

与其他天然酶一样，DNA聚合酶已经发展了数百万年，以在其天然细胞环境中发挥作用。其中许多几乎完全适应在该环境中工作。但当DNA聚合酶从其天然环境中提取并用于工业或研究时，酶的运行环境和条件不可避免地与其进化的环境和条件大不相同，天然环境进化的限制因素也大多消除，因此，用于工业或研究应用的DNA聚合酶的改进具有巨大的潜力。Taq DNA聚合酶作为第一种被发现的可用于PCR反应的酶，已经进行了非常密集的改造研究，并且有很多生物化学和结构数据可供使用。一些突变位点对于酶的保真度很关键(US6395524，US6602695和US5614365)，一些突变能提高其加A效率(CN201611196755.9)，使酶低温敏感(Barnes和Kermekchiev，2000)，或能增加聚合酶对不同PCR抑制剂的抗性(Kermekchiev MB,Tzekov A and Barnes WM.Cold-sensitive mutants of Taq DNApolymeraseprovide a hot start for PCR.Nucleic Acids Research,2003,31:6139-6147)。

这种Taq DNA聚合酶突变体可用于临床和环境样品中的病原体或特定物质检测，这些样品中通常含有PCR抑制剂(染料，血液，土壤)，这是需要样品处理的主要原因。然而，样品纯化过程非常低效，且劳动密集，同时可能引入新的杂质或造成误差。无需样品处理，直接进行PCR或定量PCR检测是一种更加简便、高效的方案，但这就需要TaqDNA聚合酶能够耐受检测过程中所涉及的抑制剂成分，如血液、荧光染料，高离子强度等，高效获得单一精确的目的条带。例如，SYBR Green嵌入染料用于qPCR，这将抑制Taq DNA聚合酶，并降低PCR效率和灵敏度。对SYBR Green染料的抗性增加，可能与对来自血液和其他PCR抑制剂的酶抗性增加有关(Kermekchiev MB,Kirilova LI,Vail EE,Barnes WM.Mutants of Taq DNApolymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from wholeblood and crude soil samples.Nucleic Acids Research,2009,37:e40.)。

目前，PCR代表了分子生物学应用市场中增长最快的部分之一。正在开发和引入PCR的新应用和PCR的新变体用于研究和诊断应用，例如快速qPCR，数字PCR和需要新型酶特性的直接样品到PCR。因此，工业上需要具有新颖，改进性质的Taq DNA聚合酶衍生物。

血液对于PCR有显著抑制效果，目前已经开发了各种DNA提取方法以降低血液组分对PCR的抑制作用，这些预处理步骤通常是耗时，劳动密集，并且只能适应于特定的样品，并非通用方法。此外，即使在使用DNA提取试剂盒后，仍可能存在一些PCR抑制剂。例如，使用血液DNA纯化试剂盒进行样品提纯，进行人类乙型肝炎病毒测试，其中大约14％可能是假阴性(KramvisA.,BukovzerS.and KewM.C.Comparison ofhepatitis B virus DNAextractions from serum by the QIAampblood kit,Genereleaser,and the phenol-chloroform method.J.Clin.Microbiol.,1996,34,2731–2733.)。SYBR Green荧光染料是qPCR的常用染料，但Taq DNA聚合酶对其耐受程度很低。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种耐受性提高的突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用，本发明的重组型Taq DNA聚合酶突变体对血液、荧光染料及高离子强度的耐受性明显增强，能够直接进行血液样品的PCR反应检测，节约时间，避免假阴性。

本发明提供了一种突变型Taq DNA聚合酶，其是对如SEQ ID NO.1所示的Taq DNA聚合酶的氨基酸序列中***、取代、或缺失1个或多个氨基酸，且与SEQ ID NO.1所示的TaqDNA聚合酶相比，其杂质耐受性显著增强的氨基酸序列。

在本发明的一个实施例中，本发明所述的突变型Taq DNA聚合酶(以Taq-Mut表示)，所述突变体在SEQ ID NO.1所示的序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：R266F，A293N，A414F，E466Q，E507K，D732E。

本发明所述的R266F表示第226位氨基酸由精氨酸变成了苯丙氨酸；A293N表示其第293位氨基酸由丙氨酸变成了天冬酰胺；A414F表示其第414位氨基酸由丙氨酸变成了苯丙氨酸；E466Q表示其第466位氨基酸由谷氨酸变成了谷氨酰胺；E507K表示第507位氨基酸由谷氨酸变成了赖氨酸；D732E表示第732位氨基酸由天冬氨酸变成了谷氨酸。

在本发明的一种实施例中，本发明所述的突变型Taq DNA聚合酶Taq-Mut，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或与SEQ ID NO.3所示序列具有80％同一性的具有Taq DNA聚合酶活性的氨基酸序列；优选的具有85％同一性，更优选的具有90％同一性，最优选的，具有95％同一性，进一步优选，具有99％同一性。

另一方面，本发明提供了基于本文所述的各种突变来工程化修饰Taq DNA聚合酶的方法。

在本发明的一种实施例中，本发明还提供编码本发明所述的突变型Taq DNA聚合酶Taq-Mut的核苷酸序列。需要说明的是，由于同一氨基酸可能有多种不同的密码子来决定，所以编码上述突变型Taq DNA聚合酶Taq-Mut的核苷酸序列可以是由SEQ ID NO.2所示野生型Taq DNA聚合酶核苷酸序列突变一个或多个核苷酸形成同义突变得到同样可编码SEQ ID NO.3中氨基酸序列的核苷酸序列。在一种具体的实施例中，编码本发明所述的突变型Taq DNA聚合酶Taq-Mut的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种包含编码本发明所述的突变型Taq DNA聚合酶Taq-Mut的核苷酸序列的重组载体。在一种具体的实施例中，所述重组载体包含如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明还包含一种重组细胞，包含可编码所属突变型Taq DNA聚合酶Taq-Mut的核苷酸序列，或包含可编码所属突变型Taq DNA聚合酶Taq-Mut的核苷酸序列的载体。

进一步的，所述重组细胞所使用的宿主细胞为BL21。

本发明还提供了一种所述可提高杂质耐受性的突变型Taq DNA聚合酶Taq-Mut的制备方法，其包括如下步骤：

1)构建含有编码突变型Taq酶的核苷酸序列的载体：利用含有突变位点信息的引物，对含有野生型Taq DNA聚合酶基因的质粒进行PCR扩增，得到目的条带后利用同源重组得到充足质粒或直接转化得到突变质粒，测序验证核苷酸序列正确；

2)将步骤1)中得到的载体转化宿主细胞得到重组细胞；将含有正确核苷酸序列的载体转化到宿主细胞中，利用抗生素筛选得到正确的重组细胞；

3)培养、表达并收集重组细胞，提取纯化突变型Taq酶。

进一步的，步骤1)中，所述引物的具体序列如下：

R266F-1：CGGGAGCCCGACTTCGAGAGGCTTAGGGCCTTTCTG(SEQ ID NO.5)；

R266F-2：CCTAAGCCTCTCGAAGTCGGGCTCCCGCCTTTTGGC(SEQ ID NO.6)；

A293N-1：GAAAGCCCCAAGAACCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCC(SEQ ID NO.7)；

A293N-2：GGCCTCCTCCAGGTTCTTGGGGCTTTCCAGAAGGCC(SEQ ID NO.8)；

A414F-1：GAGAGGCTCTTCTTCAACCTGTGGGGGAGGCTTGAG(SEQ ID NO.9)；

A414F-2：CCCCCACAGGTTGAAGAAGAGCCTCTCGGAAAGGGC(SEQ ID NO.10)；

E466Q-1：GAGGTGGCCGAGCAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAG(SEQ ID NO.11)；

E466Q-2：GAGGCGGGCGATCTGCTCGGCCACCTCCAGGGACAA(SEQ ID NO.12)；

E507K-1：ATCGGCAAGACGAAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACC(SEQ ID NO.13)；

E507K-2：CTTGCCGGTCTTCTTCGTCTTGCCGATGGCGGGAAG(SEQ ID NO.14)；

D732E-1：CGCTACGTGCCAGAGCTAGAGGCCCGGGTGAAGAGC(SEQ ID NO.15)；

D732E-2：CCGGGCCTCTAGCTCTGGCACGTAGCGGCGGCGGCC(SEQ ID NO.16)。

本发明上述引物中包含了所需突变的位点和替换后的核苷酸。

本发明还提供本发明所述的突变型Taq DNA聚合酶Taq-Mut在生物技术领域中的应用。更具体优选的，是在PCR领域中的应用。具体的，在一些实施方案中，本发明涉及的突变型Taq DNA聚合酶Taq-Mut在包含血液的样品、包含SYBR Green的样品或/和含盐样品的PCR领域中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明对现有的野生型Taq DNA聚合酶进行提高杂质耐受性的定向改造，构建突变型Taq DNA聚合酶，其能够耐受更高的血液样品浓度、SYBR Green浓度以及盐离子浓度，表现出更高的聚合扩增能力及更低的假阴性率。该突变型Taq DNA聚合酶的杂质耐受度得到提升。

(2)突变型Taq DNA聚合酶可在含有20％血液的PCR体系中进行扩增，产物扩增与无血情况无显著差异，省去了血液样本检测的纯化步骤，可应用于大量未提纯样本的快速扩增，且所需酶的用量比野生型Taq DNA聚合酶下降至少3倍。

(3)突变型Taq DNA聚合酶对于SYBR Green染料的耐受性是野生型Taq DNA聚合酶的至少4倍，与野生型酶相比能够更快和/或更有效地进行DNA扩增的突变体。

(4)突变型Taq DNA聚合酶对于PCR体系中KCl浓度的耐受比野生型Taq DNA聚合酶至少提高3倍，至少在含有150mM KCl的扩增体系中，扩增不受影响。

附图说明

图1为本发明实施例3扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中1-3道为Taq DNA聚合酶的扩增结果，其中加入酶量依次分别为60ng、40ng和20ng；4-6道为突变型Taq DNA聚合酶的扩增结果，其中加入酶量依次分别为60ng、40ng和20ng；

图2为本发明实施例4扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中1-2道为Taq DNA聚合酶的扩增结果，其中KCl终浓度依次分别为50mM和150mM；3-4道为突变型Taq DNA聚合酶的扩增结果，其中KCl终浓度依次分别为50mM和150mM；

图3为本发明实施例5扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中1-5道为Taq DNA聚合酶的扩增结果，其中SYBR Green染料终浓度依次分别为0×、1×、3×、4×和5×；6-10道为突变型Taq DNA聚合酶的扩增结果，其中SYBR Green染料终浓度依次分别为0×、1×、3×、4×和5×。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，例如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：构建含有编码突变型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列的载体

利用基因合成的方法，合成引物序列如下：

R266F-1：CGGGAGCCCGACTTCGAGAGGCTTAGGGCCTTTCTG(SEQ ID NO.5)；

R266F-2：CCTAAGCCTCTCGAAGTCGGGCTCCCGCCTTTTGGC(SEQ ID NO.6)；

A293N-1：GAAAGCCCCAAGAACCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCC(SEQ ID NO.7)；

A293N-2：GGCCTCCTCCAGGTTCTTGGGGCTTTCCAGAAGGCC(SEQ ID NO.8)；

A414F-1：GAGAGGCTCTTCTTCAACCTGTGGGGGAGGCTTGAG(SEQ ID NO.9)；

A414F-2：CCCCCACAGGTTGAAGAAGAGCCTCTCGGAAAGGGC(SEQ ID NO.10)；

E466Q-1：GAGGTGGCCGAGCAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAG(SEQ ID NO.11)；

E466Q-2：GAGGCGGGCGATCTGCTCGGCCACCTCCAGGGACAA(SEQ ID NO.12)；

E507K-1：ATCGGCAAGACGAAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACC(SEQ ID NO.13)；

E507K-2：CTTGCCGGTCTTCTTCGTCTTGCCGATGGCGGGAAG(SEQ ID NO.14)；

D732E-1：CGCTACGTGCCAGAGCTAGAGGCCCGGGTGAAGAGC(SEQ ID NO.15)；

D732E-2：CCGGGCCTCTAGCTCTGGCACGTAGCGGCGGCGGCC(SEQ ID NO.16)。

以包含野生型Taq DNA聚合酶核苷酸序列的质粒为模板，利用PCR对野生型TaqDNA聚合酶(其序列如SEQ ID NO.2所示)进行扩增。PCR扩增分为6个反应，分别以R266F-1和A293N-2，A293N-1和A414F-2，A414F-1和E466Q-2，E466Q-1和E507K-2，E507K-1和D732E-2，E732E-1和R266F-2为引物，在50μL反应体系中，10uM的引物各加入2μL，以Phanta MaxSuper-Figelity DNA Polymerase(由南京诺唯赞生物科技有限公司生产，Vazyme,货号P505)为DNA聚合酶。扩增条件为95℃30s；95℃15s；60℃15s；72℃4min；72℃5min，共30个循环。

扩增结束后，在50μL反应体系中直接加入1μL DpnI(由NEB公司生产，货号#R0176L)，37℃恒温孵育2小时，消化原始质粒模板。以1％-1.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，得到目的条带后切胶回收。将回收产物利用Mut Express MμLtiS Fast Mutagenesis Kit V2(由南京诺唯赞生物科技有限公司生产，Vazyme,货号C215)进行重组反应，37℃恒温孵育0.5小时。

取20μL冷却重组反应液，加入到100μL DH5a感受态细胞(由南京诺唯赞生物科技有限公司生产，Vazyme,货号C502)中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90秒，冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基，37℃摇菌45min。取100μL菌液均匀涂布在含有质粒对应抗性抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。第二天挑取单克隆，测序鉴定。测序结果表明：本发明合成的突变性Taq DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例2获得突变型Taq DNA聚合酶

取10ng测序验证无误的载体以同样的转化方法转化到BL21(DE3)感受态细胞(由南京诺唯赞生物科技有限公司生产，Vazyme,货号C504)中，涂布在含有质粒对应抗性抗生素的LB平板上，37℃过夜培养。第二天挑取单克隆。经液体培养基培养、诱导表达后，纯化得到突变型Taq DNA聚合酶纯酶。所述突变型Taq DNA聚合酶命名为Taq-Mut，由832个氨基酸组成，其具体序列见SEQ ID NO.3。

实施例3血液耐受性能

使用新鲜采集的人全血在PCR反应中测试Taq-Mut扩增320bp PCR扩增子的能力。在含有20mM Tris-HCl(pH 8.4)和20mM KCl的缓冲液中进行反应。示例性反应组分显示在表1中，其中Taq DNA聚合酶的加入量分别为60、40和20ng。该测定的示例性循环过程显示在表2中。

示例性引物序列如下：

Primer-L：TAGTGGTGGCTGACCTGTTCTCT(SEQ ID NO.17)

Primer-R：TCGTCGATCTCCTGTTGGACA(SEQ ID NO.18)

表1 PCR检测体系示例。总体积为50μL

表2 PCR循环过程示例

将反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，并评估产物是否存在，以及正确片段大小的条带强度。示例性结果显示在图1中。仅需要20ng Taq-Mut即可产生与加入60ng Taq DNA聚合酶相当的产物量。

实施例4高盐耐受性能

在存在高或低浓度KCl的情况下，在PCR反应中以lambda DNA(购买自ThermoFisher，货号为#SD0011)为模板测试Taq-Mut和Taq DNA聚合酶扩增1.46kb PCR扩增子的能力。反应在含有20mM Tris-HCl(pH8.4)的缓冲液中进行。示例性反应组分显示在表3中。该测定的示例性循环过程显示在表4中。

示例性引物序列如下：

Primer-1：TACACGAACCTGATGAACA(SEQ ID NO.19)

Primer-2：TCTAACTATTACCTGCGAACT(SEQ ID NO.20)

表3 PCR检测体系示例。总体积为50μL

表4 PCR循环过程示例

将反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，并评估产物是否存在，以及正确片段大小的条带强度。示例性结果显示在图2中。Taq在含有50mM KCl的10mM Tris-HCl缓冲液中可以扩增，但产量低于Taq-Mut。Taq DNA聚合酶在含有150mM KCl的PCR体系中没有扩增，而Taq-Mut可以扩增，且产物量相较于50mM KCl体系没有明显变化，表明Taq-Mut比Taq更耐盐。

实施例5SYBR Green耐受性能

在存在不同浓度SYBR Green的情况下，在PCR反应中以lambda DNA(购买自ThermoFisher，货号为#SD0011)为模板测试Taq-Mut和Taq DNA聚合酶扩增1.46kb PCR扩增子的能力。反应在含有20mM Tris-HCl(pH 8.4)的缓冲液中进行。示例性反应组分显示在表5中。该测定的示例性循环过程同表5。

示例性引物序列如下：

Primer-1：TACACGAACCTGATGAACA(SEQ ID NO.19)

Primer-2：TCTAACTATTACCTGCGAACT(SEQ ID NO.20)

表5 PCR检测体系示例。总体积为50μL

将反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，并评估产物是否存在，以及正确片段大小的条带强度。示例性结果显示在图3中。Taq DNA聚合酶可耐受1×浓度的SYBR Green，而Taq-Mut可耐受4×浓度，表明Taq-Mut比Taq更耐SYBR Green。

序列表

<110> 南京诺唯赞生物科技有限公司

<120> 一种耐受性提高的突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 832

<212> PRT

<213> 水生嗜热菌(Thermus aquaticus)

<400> 1

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 2

<211> 2496

<212> DNA

<213> 水生嗜热菌(Thermus aquaticus)

<400> 2

atgaggggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60

cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120

gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180

gcggtgatcg tggtctttga cgccaaggcc ccctccttcc gccacgaggc ctacgggggg 240

tacaaggcgg gccgggcccc cacgccggag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300

gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360

gtcctggcca gcctggccaa gaaggcggaa aaggagggct acgaggtccg catcctcacc 420

gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgccctcca ccccgagggg 480

tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540

gactaccggg ccctgaccgg ggacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600

gagaagacgg cgaggaagct tctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660

ctggaccggc tgaagcccgc catccgggag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720

ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780

aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840

ctcctccacg agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900

ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960

cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020

gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080

ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140

gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200

gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260

gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320

ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380

ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440

cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500

cccgccatcg gcaagacgga gaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560

gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtaccggga gctcaccaag 1620

ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680

cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740

ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tccgccgggc cttcatcgcc 1800

gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860

cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920

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gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggag 2496

<210> 3

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Phe Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Asn Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

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Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

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Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

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Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Phe Asn Leu

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Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Gln Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Lys Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

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Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

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Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

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Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Glu Leu Glu Ala Arg

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Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

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Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

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820 825 830

<210> 4

<211> 2496

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4