阅读说明：本技术 基于子宫颈脱落细胞基因检测的***分期方法与检测试剂盒 (Cervical cancer staging method and detection kit based on cervical exfoliated cell gene detection ) 是由 曾新 柳宇 许争峰 李萍 胡平 毛鹏远 张根 芮璨 栾婷 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基于子宫颈脱落细胞基因检测的宫颈癌分期方法,采集子宫颈脱落细胞和活体组织、提取全基因组DNA、基因检测以及免疫组化检查；本发明还公开了基于子宫颈脱落细胞基因检测的宫颈癌分期检测试剂盒,包括含有特异性引物的PCR反应液；本发明对正常子宫颈、癌前病变子宫颈、子宫颈癌的脱落细胞进行DNA定量检测,从脱落细胞的角度阐明了P53、P16与子宫颈癌发生发展的相关性,为宫颈癌的分期诊断提供了新的依据；提取宫颈脱落细胞中的DNA进行检测,具有采样量低的优势；取材简便无创且患者无不适感,可在妇产科常规检查生殖系统疾病时获得待检样本,本发明还具有取材无创、副作用小、患者依从性好的优势。(The invention discloses a cervical cancer staging method based on cervical exfoliated cell gene detection, which comprises the steps of collecting cervical exfoliated cells and living tissues, extracting whole genome DNA, performing gene detection and performing immunohistochemical examination; the invention also discloses a cervical cancer stage detection kit based on cervical exfoliated cell gene detection, which comprises PCR reaction liquid containing specific primers; the invention carries out DNA quantitative detection on the cast-off cells of normal cervix, precancerous lesion cervix and cervical cancer, clarifies the correlation between P53 and P16 and the occurrence and development of cervical cancer from the angle of the cast-off cells, and provides a new basis for the staged diagnosis of cervical cancer; the DNA in the exfoliated cervical cells is extracted for detection, so that the method has the advantage of low sampling amount; the invention has the advantages of convenient material taking, no wound, no discomfort of patients, capability of obtaining a sample to be detected in the routine examination of reproductive system diseases in obstetrics and gynecology department, no wound of material taking, small side effect and good compliance of patients.)

基于子宫颈脱落细胞基因检测的***分期方法与检测试 剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，具体为基于子宫颈脱落细胞基因检测的***分期方法与检测试剂盒。

背景技术

***是女性最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病例约50万，死亡约25万例；仅我国，平均每年约有13.5万新发病例、占世界总发病例数的1/4，死亡病例更是达到了年均5万以上；因此，***的防治刻不容缓。依据组织病理学分型，***主要分为鳞状细胞癌(简称鳞癌)和腺癌，其中鳞癌约占75-80％，腺癌约占20-25％。***的早期发现，通常通过定期健康体检而实现。而纵观***的形成历程，癌变之前已会出现细胞由正常转化为异常的现象，有一系列的癌前病变。因此，通过筛查及时发现宫颈病变，根据宫颈病变的级别和期别制定对应的治疗方案，终止其向***发展的趋势，对于提高***的防治效果具有重要意义。

目前，***筛查普遍采用的是宫颈病变三阶梯诊断(液基细胞学、***镜和组织病理学诊断)联合HPV检测，但早期诊断***仍然比较困难。究其原因，主要有以下四点：①液基细胞学检查对宫颈细胞病变级别并无明显区分，且受主观因素影响较大，如血液和黏液细胞的重叠会影响对异常细胞的辨识，降低了准确性，导致假阴性率高，极易漏诊误诊；②***镜和组织病理学诊断均为有创性的检查手段，同时存在取材不易到位、较难得到典型和充足的病理标本的问题；③HPV DNA检测敏感性虽高，但特异性较低，其阳性结果只能提示是否存在短暂感染，预测***发生与进展的价值有待进一步确认。

鉴于目前筛查***的已有方法的局限性，研究者们从蛋白、基因等层面探寻其早期诊断新方法的尝试一直在与时俱进；除了免疫组化、聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交等较为常规的技术方法，利用DNA倍体分析、基因测序、循环游离DNA检测等新技术筛选***标志物并用于检测的研究时有报道，但大多仍停留在科研阶段，尚无法真正用于临床的早期筛查，更不能用于***的分期；故此，发展***早期及分期诊断的无创检测试剂盒仍然是当务之急。

***的疾病发展史已有较多研究，其发生发展是典型的量变到质变过程，需要经历几年到十几年的时间。其中，HPV病毒的持续、反复感染是***发生的重要原因，主要是HPV病毒癌基因蛋白和细胞基因产物(P53和P16等)结合以改变细胞周期和DNA修复,导致基因组不稳定性和细胞周期异常,从而使子宫颈细胞发生恶性转化并发展为***；因此，HPV病毒以外的一些细胞基因产物(P53和P16等)的检测不仅对于***早期筛查十分必要，其变化也可为***分期提供依据。

发明内容

本发明的目的在于提供基于子宫颈脱落细胞基因检测的***分期方法与检测试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于子宫颈脱落细胞基因检测的***分期方法，包括以下步骤：

S1：从正常子宫颈、子宫颈病变、子***三组人群中采集子宫颈脱落细胞和活体组织；

S2：分别提取子宫颈脱落细胞和活体组织中的全基因组DNA；

S3：对P53、P16基因进行定量检测，从而确定脱落细胞中的基因表达是否与活体组织的检测结果具有一致性；

S4：对正常子宫颈、子宫颈病变、子***三组人群的组织切片进行免疫组化检查，从而确定脱落细胞中P53、P16基因的表达与***分期的关系。

如上所述的基于子宫颈脱落细胞基因检测的***分期检测试剂盒，包括含有特异性引物的PCR反应液，所述PCR反应液包括：P53正向引物、P53反向引物、P16正向引物、P16反向引物、GAPDH正向引物、GAPDH反向引物、10×PCR Buffer、ROX以及无核酸酶水。

优选的，所述PCR反应液各成分的终浓度为：1×PCR Buffer、0.5μM P53正向引物、0.5μM P53反向引物、0.5μM P16正向引物、0.5μM P16反向引物、0.5μM GAPDH正向引物、0.5μM GAPDH反向引物，1×ROX。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明对正常子宫颈、癌前病变子宫颈、子***的脱落细胞进行DNA定量检测，从脱落细胞的角度阐明了P53、P16与子***发生发展的相关性，为***的分期诊断提供了新的依据；

2.提取宫颈脱落细胞中的DNA进行检测，具有采样量低的优势；

3.基于宫颈的位置和结构特点，采集宫颈/***的脱落细胞进行检测，取材简便无创且患者无不适感，可在妇产科常规检查生殖系统疾病时获得待检样本，因此，本发明还具有取材无创、副作用小、患者依从性好的优势。

附图说明

图1 Aa为P53基因在宫颈正常、癌前病变、子***患者的子宫颈组织的表达量变化；

图1 Ab为P53基因在宫颈正常、癌前病变、子***患者的宫颈脱落细胞中的表达量变化；

图2 Ba为P16基因在宫颈正常、癌前病变、子***患者的子宫颈组织的表达量变化；

图2 Bb为P16基因在宫颈正常、癌前病变、子***患者的宫颈脱落细胞中的表达量变化；

图3为P53基因在宫颈正常、癌前病变、子***患者的子宫颈组织中的免疫组化结果；

图4为P16基因在宫颈正常、癌前病变、子***患者的子宫颈组织中的免疫组化结果；

图5为P53基因的扩增曲线与熔解曲线；

图6为P16基因的扩增曲线与熔解曲线；

图7为GAPDH基因的扩增曲线与熔解曲线；

图8为基因扩增产物的电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-图8，本发明提供一种技术方案：基于子宫颈脱落细胞基因检测的***分期方法，包括以下步骤：

S1：从正常子宫颈、子宫颈病变、子***三组人群中采集子宫颈脱落细胞和活体组织；

S2：分别提取子宫颈脱落细胞和活体组织中的全基因组DNA；

S3：对P53、P16基因进行定量检测，从而确定脱落细胞中的基因表达是否与活体组织的检测结果具有一致性；

S4：对正常子宫颈、子宫颈病变、子***三组人群的组织切片进行免疫组化检查，从而确定脱落细胞中P53、P16基因的表达与***分期的关系。

基于子宫颈脱落细胞基因检测的***分期检测试剂盒，包括含有特异性引物的PCR反应液，PCR反应液包括：P53正向引物、P53反向引物、P16正向引物、P16反向引物、GAPDH正向引物、GAPDH反向引物、10×PCR Buffer、ROX以及无核酸酶水。

实施例1：基于子宫颈脱落细胞基因检测的***分期方法；

1.样本：收集***患者宫颈脱落细胞30例，来源子宫切除术术后，病理诊断为***的患者；收集CIN3患者宫颈脱落细胞30例，来源锥切术术后，病理诊断为CIN3的患者；收集非宫颈疾病患者宫颈脱落细胞30例，来源子宫肌瘤切子宫切除术术后，病理诊断为宫颈正常的患者。

2.检测子宫颈脱落细胞中相关基因表达

2.1.宫颈脱落细胞全基因组DNA提取：宫颈脱落细胞全基因组DNA提取使用恺硕生物科技(厦门)有限公司生产的全自动核酸提取仪(型号Super)及该公司生产的基因组DNA提取试剂盒，操作步骤为：取400μL脱落细胞混悬液至1.5mL EP管；16000rpm离心10分钟；去上清；加400μL GTE buffer+40μL蛋白激酶K震荡混匀；60℃水浴一小时，每20分钟震荡一次；将溶解液以16000rpm离心5分钟；移入样品管，上机：①样品基因组DNA提取试剂条摆放至样品架上，②样品管放在T型架W1位置，枪头放在T型架W3位置，收集管放在T型架W5位置，③点击设备屏幕START选择试剂条对应程序代码，选择400μL上样体积，选择100μL洗脱体积，点击START运行设备。

2.2.DNA定量：取上述提取的总DNA 2μL，利用紫外分光光度计测定波长260nm和280nm处的吸光度值，根据260/280比值判断所提取DNA的纯度，并记录DNA浓度。

2.3.荧光定量PCR反应：使用Takara试剂盒进行实时荧光定量PCR，具体反应体系如下：

反应条件：95℃预变性30s；95℃5s，60℃35s，循环次数40次。

2.4.基因表达定量：以GAPDH为内参基因，采用相对定量法分析P53、P16表达水平，计算方法为：2-△△CT，统计学分析采用SPSS19软件进行数据分析，双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3.结果：脱落细胞中P53、P16基因表达量在非宫颈疾病患者、CIN3患者、***患者中逐渐升高，其差异具有统计学意义。

实施例2：基于子宫颈脱落细胞基因检测的***分期方法的确认；

1.样本：收集***患者宫颈组织30例，来源子宫切除术术后，病理诊断为***的患者；收集CIN3患者宫颈组织30例，来源锥切术术后，病理诊断为CIN3的患者；收集非宫颈疾病患者宫颈组织30例，来源子宫肌瘤切子宫切除术术后，病理诊断为宫颈正常的患者。

2.检测子宫颈组织中相关基因表达

2.1.宫颈组织全基因组DNA提取：组织样本全基因组DNA提取使用恺硕生物科技(厦门)有限公司生产的全自动核酸提取仪(型号Super)及该公司生产的基因组DNA提取试剂盒，操作步骤为：取-80度冻存的宫颈组织约50mg，放入液氮中进行研磨，至无大颗粒组织时转移至1.5mL EP管，加入40μl蛋白激酶消化一小时；56℃水浴1小时以上；13000rpm离心5分钟，取400μL上清转移至样品管中；上机：①样品基因组DNA提取试剂条摆放至样品架上，②样品管放在T型架W1位置，枪头放在T型架W3位置，收集管放在T型架W5位置，③点击设备屏幕START选择试剂条对应程序代码，选择400μL上样体积，选择100μL洗脱体积，点击START运行设备。

2.2.DNA定量：取上述提取的总DNA 2μl，利用紫外分光光度计测定波长260nm和280nm处的吸光度值，根据260/280比值判断所提取DNA的纯度，并记录DNA浓度。

2.3.荧光定量PCR反应：使用Takara试剂盒进行实时荧光定量PCR，具体反应体系如下：

反应条件：95℃预变性30s；95℃5s，60℃35s，循环次数40次。

2.4.基因表达定量：以GAPDH为内参基因，采用相对定量法分析P53、P16表达水平，计算方法为：2-△△CT，统计学分析采用SPSS19软件进行数据分析，双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.5.免疫组化实验确认：选择***患者组织、CIN3患者组织、宫颈正常患者组织各10例；组织样本免疫组化工作液及抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司，操作步骤为：①切片，②根据一抗的要求，对组织切片柠檬酸抗原修复后置于蒸馏水中，③滴加一抗，4℃孵育过夜，PBS冲洗，④滴加二抗，室温15分钟，PBS冲洗，⑤DAB工作液显色1-2钟，⑥自来水水冲洗、苏木素复染、脱水、封片。

3.结果：①荧光定量PCR表明组织中P53、P16基因表达量在非宫颈疾病患者、CIN3患者、***患者中逐渐升高，其差异具有统计学意义；②荧光定量PCR表明非宫颈疾病患者、CIN3患者、***患者的组织与脱落细胞中P53、P16基因表达量的变化具有一致性；③免疫组化实验结果表明非宫颈疾病患者、CIN3患者、***患者组织中P53、P16蛋白的表达量变化与组织及脱落细胞中P53、P16 DNA的表达量变化具有一致性。从而阐明了宫颈脱落细胞中P53、P16的DNA表达量变化与子***发生发展具有相关性，可根据其对宫颈病变进行分期诊断。

实施例3：基于子宫颈脱落细胞基因检测的***分期检测试剂盒；

1.引物的设计与合成

针对人基因组中P53、P16基因和内参基因GAPDH，分别设计引物，经扩增反应与核酸电泳确认特异性与敏感性。引物序列如下表所示：

2.PCR反应液组成

包括含有上述特异性引物的PCR反应液，PCR反应液包括：P53正向引物、P53反向引物、P16正向引物、P16反向引物、GAPDH正向引物、GAPDH反向引物，10×PCR Buffer，1×ROX，无核酸酶水。其中，PCR引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成；10×PCR Buffer，染料，dNTP，Taq酶，无核酸酶水均购自南京泽塔仪器设备有限公司。

PCR反应液各成分的终浓度为：1×PCR Buffer，0.5μM P53正向引物、0.5μM P53反向引物、0.5μM P16正向引物、0.5μM P16反向引物、0.5μM GAPDH正向引物、0.5μM GAPDH反向引物，1×ROX。

本发明中，图8为基因扩增产物的电泳图(1：β-actin，2：Rb，3：P53，4：TERC，5：HPV18，6：HPV16，7：CERB2，8：EFGR，9：GAPDH，10：P16)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。