具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1黄颡鱼醛还原酶的基因克隆、表达载体构建及重组蛋白表达纯化

1、黄颡鱼AKR1A1基因的克隆

按照Trizol试剂盒的说明书提取黄颡鱼肝脏总RNA，利用M-MLV反转录酶合成cDNA，于-80℃低温保存。

设计引物AKR1A1-F：5’-ATTGAATTCATGAATGACTATGCAGTGCT-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

AKR1A1-R：CGAAAGCTTATAAGGATCATTAAATGGAT(如SEQ ID NO.4所示)，

其中上游引物序列添加了EcoR I酶切位点，下游引物添加了Hind III酶切位点。

进行常规PCR扩增，扩增产物经回收、纯化、连接并测序后，获得了该基因的开放阅读框序列，所述黄颡鱼AKR1A1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该基因编码的黄颡鱼醛还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、表达载体的构建

将上述PCR扩增产物与原核表达载体pET-28a(+)同时进行EcoR I和Hind III双酶切，分别用DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，并利用T4 DNA连接酶将扩增产物和载体连接，经测序验证后，成功构建得到原核表达载体pET-AKR1A1。

3、黄颡鱼AKR1A1重组蛋白的表达纯化

将上述原核表达载体pET-AKR1A1转化至E.coli BL21(DE3)中，涂布于含50μg/mL的卡那霉素平板上进行抗性筛选，并经菌落PCR验证及SDS-PAGE电泳检测获得阳性表达菌株。

将所述阳性表达菌株按1:50分别接种到200mL含卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，200r·min^-1摇床培养至OD₆₀₀约0.6时，加入1mM IPTG继续培养4h，诱导重组蛋白表达。将诱导好的菌液离心，于4℃、10000r·min^-1离心10min收集菌体，菌体沉淀用PBS缓冲液(50mmol/L，pH＝8.0)重悬，冰上超声裂解细菌，超声5s，间隔10s，总时间20min，然后4℃，10000r·min^-1离心10min，收集沉淀，沉淀用裂解缓冲液(8mol/L尿素，10mmol/L咪唑，50mmol/L PBS，pH＝8.0)洗涤三次后，加入适量裂解缓冲液溶解，用0.45μm滤膜过滤后将上清加到Ni-NTA His Bind Resin纯化柱中，用含有咪唑(100mmol/L)的PBS洗脱，并进行SDS-PAGE检测重组蛋白的纯化情况。

SDS-PAGE电泳结果如图1所示，其中泳道1：空白质粒菌株；泳道2：诱导前的含pET-28-AKR1A1菌株；泳道3：诱导后的含pET-28-AKR1A1菌株；泳道4：纯化后的AKR1A1蛋白；M：Marker。结果显示，本实施例成功实现了重组蛋白AKR1A1的体外表达与纯化。

实施例2 AKR1A1重组蛋白的酶活性检测及底物特异性分析

利用普析通用公司TU-1900紫外分光光度计测定还原型辅酶NADPH在340nm处吸光值的变化，用以评价重组蛋白的活性。酶活单位定义为：醛还原酶在最适条件下每分钟消耗1μmol的NADPH为一个酶活单位(U)。

取比色皿，顺序加入1900μL 50mmol·L^-1PBS(pH 5.0)，90μL酶液，1000μL底物(约40mmol·L^-1)，37℃保温10min后，加入10μL 10mmol·L^-1NADPH，总体系为3mL；将比色皿放入紫外分光光度计中，测定340nm处吸光值的变化并记录，每个底物重复3次。用SPSS20.0进行统计学分析，酶比活力和相对酶活用x±s表示，采用方差分析进行组间比较，当P＜0.01时为差异极显著，当P＜0.05时为差异显著。

按照上述方法，分别测量AKR1A1重组蛋白对苯甲醛、邻苯二甲醛、甲醛、甲酸、戊二醛、甘油醛、2,3-丁二酮、丙酮醛、2,3-戊二酮、乙酰丙酮、葡萄糖等底物的活性。活性测定结果如表1所示。

表1 AKR1A1重组蛋白对不同底物的反应常数

ND：表示未检测到活性

结果显示，所述AKR1A1重组蛋白对所测的醛类物质及中长链酮类物质具有良好的还原活性，但对糖类和乙酰丙酮的活性不明显。

实施例3 AKR1A1重组蛋白对镉胁迫下对肝脏氧化应激的调控作用

1、AKR1A1重组蛋白对镉胁迫下肝脏炎症因子IL-1β基因表达的影响

取60条生长环境相同，体型相近的黄颡鱼(体质量76±5.2g)，经驯化培养后随机等分为4组，分别腹腔注射1、10、100μg的AKR1A1重组蛋白，并以注射PBS缓冲液的作为阴性对照。饲养于终浓度为1.69mg/L氯化镉的除氯水中，于0、6、12、24h分别取3条鱼肝脏，取适量肝脏组织装于1.5mL的离心管中，加入500mL Trizol保存于-80℃以备RNA的提取和相关酶指标测定。以上实验重复三次。

根据GenBank数据库中报道的黄颡鱼IL-1β基因序列，设计实时荧光定量PCR引物IL-rt-F:5’-GCATGGTTCAATCTCTCAGCCTAC-3’和引物IL-rt-R：5’-TGTTCAGCGAGTCACCGGGTCCG-3’，对重金属镉诱导黄颡鱼肝脏中IL-1β的表达量进行分析。实时荧光定量PCR反应体系为：20μl反应体系：10μl SYBR Taq、0.4μl IL-rt-F、0.4μl IL-rt-F、0.4μl Rox RD II、1μl cDNA(100ng/μl)、7.8μlH₂O。反应条件为：95℃10s；95℃5s,60℃34s，40个循环。荧光定量PCR相对表达水平通过公式2^-ΔΔct计算，并通过SPSS19进行单因素方差分析。当P＜0.05时差异显著，当P＜0.01时差异极显著。检测结果如图2所示。

结果显示，在镉刺激早期，IL-1β在黄颡鱼肝脏组织中的表达水平显著提高，6h达到峰值，表达量提高了约1.8倍(P＜0.05)，随后IL-1β表达量开始下降。注射AKR1A1蛋白6h后，低浓度剂量组(1μg)和中等浓度剂量组(10μg)的IL-1β表达量显著低于对照组，高浓度剂量组(100μg)和对照没有明显差异；注射AKR1A1重组蛋白组12h和24h后，高、中和低浓度剂量组的IL-1β表达水平均显著低于对照组，上述结果说明AKR1A1重组蛋白具有抑制重金属镉诱导的IL-1β表达的作用。

2、AKR1A1重组蛋白对镉胁迫下肝脏凋亡因子caspase3a基因表达的影响

黄颡鱼的分组以及各处理组的处理方法与IL-1β的测定相同，根据GenBank数据库中报道的黄颡鱼caspase3a基因序列，设计实时荧光定量PCR引物rt-caspase3a-F：5’-GGAGTTCGGTTGTAGAGTAATATGGT-3’；rt-caspase3a-R：5’-ATGTTACATGGTGCAGGATATGAGT-3’，对重金属镉诱导黄颡鱼肝脏中caspase3a的表达量进行分析。实时荧光定量PCR反应体系、反应条件、计算方法以及数据分析同上。检测结果如图3所示。

结果显示，在重金属镉胁迫早期，肝脏中caspase3a基因表达量显著升高，注射低、中和高剂量的AKR1A1重组蛋白6h后，均显著降低了凋亡因子caspase3a的表达，且三个剂量组间无显著性差异。而在注射后12h和24h，三个不同浓度剂量处理组的黄颡鱼肝脏组织中，凋亡因子caspase3a的基因表达水平都显著低于对照组，不过高剂量组caspase3a的基因表达水平略高于低、中剂量组，说明AKR1A1重组蛋白可抑制重金属镉诱导的细胞凋亡因子capase3a的表达，但过高剂量也可能会诱导细胞凋亡因子capase3a表达。

3、AKR1A1重组蛋白对镉胁迫下肝脏抗炎症因子IL-10基因表达的影响

黄颡鱼的分组以及各处理组的处理方法与IL-1β的测定相同，根据GenBank数据库中报道的黄颡鱼IL-10基因序列，设计实时荧光定量PCR引物rt-IL-10-F：5’-GTTCTTCATACGCCGTCATCCG-3’；rt-IL-10-R:5’-GATCCTACATTTAAACAGCTCCCTC-3’，对重金属镉刺激下黄颡鱼肝脏中IL-10的表达进行分析。实时荧光定量PCR反应体系、反应条件、计算方法以及数据分析同上。检测结果如图4所示。

结果显示，相较于金属镉胁迫早期，在重金属镉胁迫12h和24h的肝脏中IL-10基因表达量显著降低。其中低剂量AKR1A1重组蛋白没有明显促进IL-10表达的作用，而注射中等剂量和高剂量的AKR1A1重组蛋白后6h，12h和24h都显著提高了IL-10基因的表达，说明AKR1A1重组蛋白具有促进肝脏细胞中抗炎症因子IL-10的表达，从而对肝脏起到了保护作用。

4、AKR1A1重组蛋白对镉胁迫下肝脏过氧化氢酶CAT活性的影响

黄颡鱼的分组以及各处理组的处理方法与IL-1β的测定相同，使用RIPA裂解液(上海碧云天生物公司)提取肝脏组织总蛋白，使用BCA试剂盒(碧云天生物，中国上海)测定总蛋白浓度。使用ELISA试剂盒(上海酶联)检测过氧化氢酶CAT活性。具体操作按照试剂盒说明书进行。检测结果如图5所示。

结果显示，相较于对照组，注射了高、中和低剂量AKR1A1重组蛋白的黄颡鱼肝脏组织中CAT的活性在镉处理6h均显著升高，而且低剂量组CAT活性最高；处理后12h，中、高剂量组的CAT活性仍显著高于对照组；处理后24h，各剂量注射组和对照组之间均没有表现CAT活性差异，这表明AKR1A1重组蛋白在镉胁迫早期具有提高CAT活性的作用。

5、AKR1A1重组蛋白对镉胁迫下肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

黄颡鱼的分组以及各处理组的处理方法与IL-1β的测定相同，使用RIPA裂解液(上海碧云天生物公司)提取肝脏组织总蛋白，使用BCA试剂盒(碧云天生物，中国上海)测定总蛋白浓度。使用ELISA试剂盒(上海酶联)检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。具体操作按照试剂盒说明书进行。检测结果如图6所示。

结果显示，相比对照组，注射了高、中剂量AKR1A1重组蛋白的黄颡鱼肝脏组织中GSH-Px的活性在镉处理6h、12h和24h均显著升高，而低剂量组GSH-Px活性在处理后24h和对照组没有显著差异。这表明注射中、高浓度AKR1A1重组蛋白在镉胁迫过程中具有提高GSH-Px活性的作用。

6、AKR1A1重组蛋白对镉胁迫下肝脏总抗氧化能力T-AOC的影响

黄颡鱼的分组以及各处理组的处理方法与IL-1β的测定相同，使用RIPA裂解液(上海碧云天生物公司)提取肝脏组织总蛋白，使用BCA试剂盒(碧云天生物，中国上海)测定总蛋白浓度。使用ELISA试剂盒(上海酶联)检测总抗氧化能力T-AOC的含量。具体操作按照试剂盒说明书进行。检测结果如图7所示。

结果显示，相比对照组，注射了低浓度和中浓度剂量AKR1A1重组蛋白的黄颡鱼肝脏组织中T-AOC含量在镉处理6h和12h均显著升高，而在处理后24h，所有剂量处理组的T-AOC含量相对对照组均没有明显差异。这表明，注射中浓度和低浓度剂量的重组蛋白可以提高肝脏组织镉胁迫早期的抗氧化能力，从而对黄颡鱼肝脏具有保护作用，有效减少了重金属镉胁迫下的氧化损伤。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 长江大学

<120> 一种黄颡鱼醛还原酶重组蛋白及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 324

<212> PRT

<213> 黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)

<400> 1

Met Asn Asp Tyr Ala Val Leu Asn Thr Gly Arg Lys Met Pro Leu Val

1 5 10 15

Gly Leu Gly Thr Trp Lys Ser Glu Ser Gly Lys Val Lys Gln Ala Val

20 25 30

Ile Trp Ala Leu Gln Ala Gly Tyr Arg His Ile Asp Cys Ala Ser Ile

35 40 45

Tyr Gly Asn Glu Ser Glu Ile Gly Glu Ala Phe Gln Glu Met Leu Gly

50 55 60

Pro Asp Lys Ala Leu Lys Arg Glu Asp Val Phe Val Thr Ser Lys Leu

65 70 75 80

Trp Asn Thr Lys His His Pro Glu Asp Val Glu Pro Ser Leu Leu Asn

85 90 95

Ser Leu Lys Glu Leu Lys Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile His

100 105 110

Trp Pro Tyr Ala Phe Lys Gln Gly Asp Ser Thr Phe Pro Arg Lys Glu

115 120 125

Asp Gly Thr Leu Leu Tyr Asp Asp Ile Asp Tyr Lys Val Thr Trp Ala

130 135 140

Ala Met Glu Lys Leu Val Glu Lys Gly Leu Val Arg Ala Ile Gly Leu

145 150 155 160

Ser Asn Phe Asn Ser Arg Gln Ile Asp Asp Ile Leu Ser Val Ala Asn

165 170 175

Ile Lys Pro Thr Val Leu Gln Val Glu Gly His Pro Tyr Leu Ala Gln

180 185 190

Val Glu Leu Leu Ala His Cys Arg Glu Arg Gly Leu Val Met Thr Ala

195 200 205

Tyr Ser Pro Leu Gly Ser Pro Asp Arg Ala Trp Lys Arg Pro Asp Glu

210 215 220

Pro Val Ile Leu Glu Glu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ala Lys Lys Tyr

225 230 235 240

Asn Lys Ser Pro Ala Gln Ile Ile Ile Arg Trp Gln Thr Gln Arg Ser

245 250 255

Val Val Thr Ile Pro Lys Ser Val Thr Glu Ser Arg Ile Lys Glu Asn

260 265 270

Ile Gln Val Phe Asp Phe Thr Leu Glu Ser Ala Glu Met Asp Ser Val

275 280 285

Thr Ala Leu Asn Lys Gly Trp Arg Tyr Ile Val Pro Thr Ile Thr Val

290 295 300

Asp Gly Lys Phe Val Pro Arg Asp Ala Gly His Pro Tyr Tyr Pro Phe

305 310 315 320

Asn Asp Pro Tyr

<210> 2

<211> 975

<212> DNA

<213> 黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)

<400> 2

atgaatgact atgcagtgct gaacaccggg cgaaagatgc cacttgttgg actggggacg 60

tggaagagtg agtccggaaa ggtgaaacag gcggttatat gggctcttca ggctggatat 120

cggcacatcg actgcgcttc gatttatgga aatgaatcag aaattggtga agcctttcag 180

gagatgttgg ggcctgataa agccttgaaa cgagaagacg tgtttgtgac ctccaaattg 240

tggaacacga agcaccatcc tgaggatgtg gagccatcac tgctaaacag cctgaaagag 300

ctgaagctgg agtacctgga cctctacctc attcactggc cttatgcctt taagcagggg 360

gatagcactt tccccagaaa ggaagatggg accttactgt atgatgacat tgattacaag 420

gtgacgtggg ccgccatgga gaaactcgtc gaaaagggac ttgtgagggc tatcgggctc 480

tctaacttca acagcagaca gattgatgat atcttgtccg tggccaacat aaagcctact 540

gttttacagg tggagggtca tccttatctt gcccaggtgg agcttcttgc tcactgcagg 600

gagaggggct tagtgatgac tgcctacagt ccacttggct ctccagatcg tgcttggaag 660

agaccagatg agccagttat cttagaggag ccagtcattg cagctctagc caagaagtac 720

aacaaatctc ctgcacaaat tataatcagg tggcagactc agcgaagtgt tgtgacgatc 780

ccaaagagtg ttacagagtc tcgcattaaa gaaaatattc aggtttttga tttcactctt 840

gagtctgccg agatggacag tgtgacagca ttgaacaaag gctggagata cattgtgcca 900

actattactg ttgatggcaa gtttgtacca agggatgcag gacatcccta ctatccattt 960

aatgatcctt attaa 975

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attgaattca tgaatgacta tgcagtgct 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgaaagctta taaggatcat taaatggat 29