一种烟酸通过gpr109a受体制备缓解奶牛乳腺纤维化药物的应用
阅读说明：本技术 一种烟酸通过gpr109a受体制备缓解奶牛乳腺纤维化药物的应用 (Application of nicotinic acid in preparation of medicine for relieving cow's milk gland fibrosis through GPR109A receptor ) 是由 付守鹏 柳巨雄 阚兴池 郭文晋 徐平 黄雅萍 曹宇 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种烟酸通过GPR109A受体制备缓解奶牛乳腺纤维化药物的应用,包括以下步骤：S1、体内和体外实验对比在正常奶牛和纤维化倾向奶牛乳腺中GPR109A受体表达差异情况的分析,明确GPR109A受体在乳腺纤维化奶牛乳腺重高表达。S2、奶牛乳腺上皮细胞中纤维化表型的检测：具体分别在奶牛乳腺上皮细胞中检测TGF-β1、α-SMA、Collagen2、E-cadherin、在烟酸缓解后的变化情况。本发明制定全新的奶牛乳腺纤维化倾向的缓解策略,通过收集正常和乳腺纤维化的乳腺组织,分离原代奶牛乳腺上皮细胞,利用分子生物学方法全面的评估了烟酸对奶牛乳腺纤维化倾向的缓解效果。烟酸能够有效减少乳腺上皮细胞中纤维化表型的升高,从而达到保护乳腺纤维化疾病发生的目的。(The invention discloses an application of nicotinic acid in preparing a medicine for relieving cow's milk gland fibrosis through a GPR109A receptor, which comprises the following steps: s1, analysis of in vivo and in vitro experiments comparing the difference of GPR109A receptor expression in the mammary glands of normal cows and fibrosis-prone cows confirms that GPR109A receptor is highly expressed in the mammary glands of the mammary fibrosis cows. S2, detection of a fibrotic phenotype in cow mammary epithelial cells: specifically, the change conditions of TGF-beta 1, alpha-SMA, Collagen2, E-cadherin and the change conditions after the niacin is relieved are respectively detected in the mammary epithelial cells of the dairy cattle. The invention makes a brand-new cow's milk gland fibrosis tendency relieving strategy, separates primary cow mammary gland epithelial cells by collecting normal and mammary gland fibrosis mammary tissues, and comprehensively evaluates the relieving effect of nicotinic acid on cow's milk gland fibrosis tendency by using a molecular biological method. Nicotinic acid can effectively reduce the increase of the fibrosis phenotype in mammary epithelial cells, thereby achieving the purpose of protecting the occurrence of mammary fibrosis diseases.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体为一种烟酸通过GPR109A受体制备缓解奶牛乳腺纤维化药物的应用。
背景技术
奶牛乳腺纤维化是乳腺组织细胞外基质大量堆积，疤痕组织增生，导致乳腺功能性实质细胞坏死并被结缔组织填充的一种现象。炎症反应是起始纤维化反应进程的主要因素。奶牛乳腺纤维化是一种慢性进行性疾病，不同类型的乳腺疾病均可能发展为乳腺纤维化。乳腺炎是乳腺疾病中非常重要的一种疾病，每年全球因为奶牛乳腺炎而造成的经济损失高达3000亿元人民币。乳腺炎的症状相对容易缓解，但是乳腺炎症后的疾病防控是比较困难的，而且在临床生产实践中乳腺炎症后的疾病防控也是被人们一直忽略的，这就导致了针对奶牛乳腺纤维化疾病防控的药物几乎为零。抗炎症的药物往往有不具有有效缓解纤维化的功能。在临床生产实践中一头奶牛的正常服役年限大约为3-5年，那么再换乳腺疾病后其有效产奶年限大大缩短，造成了巨大的经济损失。目前关于奶牛乳腺纤维化的研究相对较少，也同样缺乏一些基础实验数据的支持来证明其严重性。但是在临床中奶牛乳腺纤维化现象非常常见，并且受制于成本价格的考虑和匮乏的基础研究作为指导，因此奶牛乳腺纤维化疾病的防控十分重要且有很大的难度。因此抗乳腺纤维化倾向药物的研发具有重要意义。那么如何缓解乳腺纤维化倾向延长奶牛的泌乳年限是研究的难点，而本发明中应用烟酸作为一种新型抗奶牛乳腺纤维化倾向的药物，具有无残留和价格低廉的特点，在一定程度上有证据支持烟酸可有效的通过GPR109A来缓解乳腺纤维化倾向，延长泌乳年限。
GPR109A属于G蛋白偶联受体家族，在以往的研究中被证实它能够通过激活下游相关信号通路来抑制炎症的发生和发展，从而达到抗炎的效果。更重要的是在最新的文献报道中发现GPR109A具有缓解肾脏纤维化的倾向。那么GPR109A是否具有缓解奶牛乳腺纤维化倾向的功能呢。因此在本研究中烟酸作为GPR109A的配体，探究其通过激活GPR109A对乳腺纤维化的影响，并在奶牛乳腺上皮细胞实验中予以应用。
烟酸又称尼克酸，属于B族维生素，是GPR109A的特异性配体。有研究表明传统抗炎药往往不具有缓解纤维化的功效，传统的缓解纤维化的药物价格昂贵，且长期应用很容易产生肾毒性和肝毒性等其他副作用，因此传统的抗炎药和传统缓解纤维化的药物在缓解奶牛乳腺纤维化疾病的应用上用很大的难度。近年来又有研究报道指出烟酸具有一定程度的缓解肝脏纤维化的功效。此外烟酸本身不会产生药物残留，且廉价易得。因此烟酸作为一种新型的抗乳腺纤维化倾向药物具有传统药物不具备的优势，但是目前烟酸对于乳腺纤维化倾向的作用还不清楚，因此本发明拟应用烟酸缓解和预防奶牛乳腺纤维化倾向。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种烟酸通过GPR109A受体应用于缓解奶牛乳腺纤维化倾向的实验方法，在Western blot试验中证实了烟酸通过激活GPR109A显著抑制乳腺纤维化倾向过程中TGF-β1、Vimentin、Collagen(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种烟酸通过GPR109A受体应用于缓解奶牛乳腺纤维化倾向的实验方法，包括以下步骤：
S1、收集正常和具有乳腺纤维化倾向的奶牛乳腺组织，纤维化的乳腺其牛奶体细胞数约为200万/mL，纤维化表型升高。
S2、体内实验：奶牛乳腺组织中GPR109A基因和蛋白水平的检测。收集正常和纤维化倾向的奶牛乳腺组织被提取总蛋白和总RNA，用于分析GPR109A在正常和纤维化组织中的表达差异情况。
S3、体外实验：奶牛乳腺上皮细胞中GPR109A基因和蛋白水平的检测。无处理组乳腺上皮细胞和TGF-β1刺激后的乳腺上皮细胞被提取总蛋白和总RNA，用于分析GPR109A在正常和TGF-β1刺激后的表达差异情况。
S4、烟酸对原代奶牛乳腺上皮细胞纤维化表型的抑制作用试验
将原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分为4组：无处里组、烟酸组、TGF-β1(5ng/mL)组、TGF-β1+烟酸组，当细胞数达到培养皿的50％时，用无血清培养基代替培养基培养3h后加入烟酸，再过1h后加入TGF-β1，72h后收集培养皿中的原代奶牛乳腺上皮细胞，收集好的细胞用提取细胞中的总蛋白并应用BCA蛋白浓度测定法将细胞中的总蛋白含量统一用于后续试验。在接下来的实验中采用Western blot实验技术检测原代乳腺上皮细胞中TGF-β1、Vimentin、Collagen 2、E-cadherin和α-SMA的蛋白表达情况。
优选的，收集正常和具有乳腺纤维化倾向的奶牛乳腺组织，纤维化的乳腺其牛奶体细胞数约为200万/mL，纤维化表型升高。
优选的，体内实验和体外实验分别检测奶牛乳腺组织中和乳腺上皮细胞中GPR109A基因和蛋白水平的变化。收集正常和纤维化倾向的奶牛乳腺组织被提取总蛋白和总RNA。
优选的，乳腺上皮细胞的来源：体外实验所用的奶牛乳腺上皮细胞来源于正常奶牛的健康乳腺组织，具体方法为乳腺组织块培养法。获取新鲜的乳腺组织块无菌PBS涮洗3次，75％酒精涮洗一次，取乳腺组织内部的小块乳腺组织，在无菌的小瓶子内部剪成小块，，小块乳腺组织被均匀放置在细胞培养瓶中，随后添加完全培养基，大约5天左右组织块周围爬出奶牛乳腺上皮细胞，并用于后续实验。
优选的，乳腺上皮细胞总蛋白的提取方法：利用蛋白提取试剂收集原代乳腺上皮细胞并提取总蛋白，应用western blot的方法检测奶牛乳腺上皮细胞中TGF-β1、Vimentin、Collagen 2、E-cadherin和α-SMA的表达情况，进而评价烟酸缓解乳腺纤维化的功效。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种烟酸通过GPR109A受体应用于缓解奶牛乳腺纤维化倾向的实验方法，具备以下有益效果：
1、本发明通过制定全新的奶牛乳腺纤维化倾向缓解策略，通过体内实验和体外实验从基因和蛋白层面证实GPR109A在纤维化的过程中发挥重要生物学功能，并且在细胞实验上添加GPR109A特异性激动剂烟酸来探究其对纤维化表型的影响。利用分子生物学方法全面的评估了烟酸对奶牛乳腺纤维化倾向的缓解效果。烟酸能够有效抑制TGF-β1诱导的乳腺上皮细胞纤维化表型的升高，从而达到保护乳腺缓解乳腺纤维化的功效。
2、本发明可以通过口服或者针剂的方式缓解奶牛乳腺纤维化倾向，方便了乳腺纤维化倾向的缓解，只需要在喂食期间将将烟酸放入饲料上层，或者静脉注射，方便快捷，给药形式多元化，不易产生耐药性和其他抗生素污染，而且不会对奶牛产生应激反应，有利于奶牛乳腺纤维化倾向的缓解和预防。
附图说明
图1为纤维化倾向乳腺组织中GPR109A蛋白表达情况；
图2为纤维化倾向乳腺组织中GPR109A基因表达情况；
图3为TGF-β1诱导的奶牛乳腺上皮细胞中GPR109A蛋白表达情况；
图4为TGF-β1诱导的奶牛乳腺上皮细胞中GPR109A基因表达情况；
图5为烟酸对TGF-β1诱导的乳腺上皮细胞中TGF-β1蛋白水平的影响；
图6为烟酸对TGF-β1诱导的乳腺上皮细胞中Vimentin蛋白水平的影响；
图7为烟酸对TGF-β1诱导的乳腺上皮细胞中Collagen 2蛋白水平的影响；
图8为烟酸对TGF-β1诱导的乳腺上皮细胞中E-cadherin蛋白水平的影响；
图9为烟酸对TGF-β1诱导的乳腺上皮细胞中α-SMA蛋白水平的影响；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种烟酸通过GPR109A受体应用于缓解奶牛乳腺纤维化倾向的实验方法，包括以下步骤：
S1、收集正常和具有乳腺纤维化倾向的奶牛乳腺组织，纤维化的乳腺其牛奶体细胞数约为200万/mL，纤维化表型升高。
S2、体内实验：奶牛乳腺组织中GPR109A基因和蛋白水平的检测。收集正常和纤维化倾向的奶牛乳腺组织被提取总蛋白和总RNA，用于分析GPR109A在正常和纤维化组织中的表达差异情况。
S3、体外实验：奶牛乳腺上皮细胞中GPR109A基因和蛋白水平的检测。无处理组乳腺上皮细胞和TGF-β1刺激后的乳腺上皮细胞被提取总蛋白和总RNA，用于分析GPR109A在正常和TGF-β1刺激后的表达差异情况。
S4、烟酸对原代奶牛乳腺上皮细胞纤维化表型抑制作用的试验
将原代奶牛乳腺上皮细胞接种到细胞培养皿中，分为4组：无处里组、烟酸组、TGF-β1(5ng/mL)组、TGF-β1+烟酸组，当细胞数达到培养皿的50％时，用无血清培养基代替培养基培养3h后加入烟酸，再过1h后加入TGF-β1，72h后收集培养皿中的原代奶牛乳腺上皮细胞，收集好的细胞用提取细胞中的总蛋白并应用BCA蛋白浓度测定法将细胞中的总蛋白含量统一用于后续试验。在接下来的实验中采用Western blot实验技术检测原代乳腺上皮细胞中TGF-β1、Vimentin、Collagen 2、E-cadherin和α-SMA的蛋白表达情况。
筛选出的奶牛的特性为乳腺组织存在炎症反应，有乳腺炎患病病史，乳汁体细胞数约为200万/mL，乳腺组织存在硬化，触碰有坚实感。
乳汁中体细胞数的检测方法为：首先配制染色液，取80mL四氯乙烷和108mL乙醇，均匀混合。接下来染色液被放置在65℃温水溶液中加热5min，加入0.6g甲基蓝。接下来移到4℃的冰箱中2h，然后加入6mL冰醋酸，放于常温保存。取出载玻片，滴入10μL的新鲜牛奶样品，恒温箱中干燥，再浸入染色液中，最后形成均匀的玻片样品；将制备好的样品放在计数板中进行染色细胞计数。
体外实验所用的奶牛乳腺上皮细胞来源于正常奶牛的健康乳腺组织，具体方法为乳腺组织块培养法。获取新鲜的乳腺组织块无菌PBS涮洗3次，75％酒精涮洗一次，取乳腺组织内部的小块乳腺组织，在无菌的小瓶子内部剪成小块，，小块乳腺组织被均匀放置在细胞培养瓶中，随后添加完全培养基，大约5天左右组织块周围爬出奶牛乳腺上皮细胞，并用于后续实验。
乳腺上皮细胞总蛋白的提取方法：利用蛋白提取试剂收集原代乳腺上皮细胞并提取总蛋白，应用western blot的方法检测奶牛乳腺上皮细胞中TGF-β1、Vimentin、Collagen2、E-cadherin和α-SMA的蛋白表达情况.
观察烟酸通过GPR109A受体应用于缓解奶牛乳腺纤维化倾向的效果统计如下：
从图1中可以看出与正常奶牛乳腺组织相比纤维化的乳腺组织中GPR109A的蛋白水平显著升高，而GPR109A可能在纤维化疾病过程中发挥积极缓解作用。
从图2中可以看出与正常奶牛乳腺组织相比纤维化的乳腺组织中GPR109A的基因表达水平显著升高，这一结果与组织内蛋白结果保持一致。
从图3中可以看出在经过TGF-β1刺激后奶牛乳腺上皮细胞中GPR109A的蛋白水平显著升高，这一结果与在体蛋白结果保持一致。
从图4中可以看出在经过TGF-β1刺激后奶牛乳腺上皮细胞中GPR109A的基因水平显著升高，这一结果上述体内外结果保持一致。
从图5中可以看出GPR109A的特异性激动剂烟酸预处理后有效的降低了奶牛乳腺上皮细胞中TGF-β1的蛋白水平。TGF-β1是促进纤维化进程的最主要致病因子之一，因此烟酸能够有效的减少细胞中TGF-β1的蛋白含量，从而缓解奶牛乳腺纤维化倾向。
从图6中可以看出GPR109A的特异性激动剂烟酸预处理后有效的降低了奶牛乳腺上皮细胞中波形蛋白Vimentin的蛋白水平。Vimentin是成纤维细胞被激活的主要标志之一，Vimentin的大量表达代表纤维化进程正在进行，因此烟酸能够有效的减少细胞中Vimentin的蛋白含量，从而缓解奶牛乳腺纤维化倾向。
从图7中可以看出GPR109A的特异性激动剂烟酸预处理后有效的降低了奶牛乳腺上皮细胞中胶原蛋白Collagen 2的蛋白水平。Collagen 2是细胞外基质的主要成分。细胞外基质的大量堆积是纤维化形成的主要原因，因此烟酸能够有效的减少细胞中Collagen 2的蛋白含量，从而缓解奶牛乳腺纤维化倾向。
从图8中可以看出GPR109A的特异性激动剂烟酸预处理后有效的增加了了奶牛乳腺上皮细胞中E-钙粘蛋白E-cadherin的蛋白水平。E-cadherin蛋白含量降低代表细胞极性被破坏，纤维化过程加剧。因此烟酸能够有效的促进细胞中E-cadherin的蛋白含量，从而缓解奶牛乳腺纤维化倾向。
从图9中可以看出GPR109A的特异性激动剂烟酸预处理后有效的降低了奶牛乳腺上皮细胞中α-SMA的蛋白水平。α-SMA是成纤维细胞被激活的主要标志之一，α-SMA的大量表达代表纤维化进程正在进行，因此烟酸能够有效的减少细胞中α-SMA的蛋白含量，从而缓解奶牛乳腺纤维化倾向。
综上所述，该实验证明了烟酸能够对奶牛乳腺纤维化倾向起到缓解作用，其能够有效的降低TGF-β1、Vimentin、Collagen 2、α-SMA水平增加E-cadherin含量，这说明烟酸能够很好的缓解奶牛乳腺纤维化倾向。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。