具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。

本文中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。

本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固相-液相混合和固相- 固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。

本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。

本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。

下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量体积百分比。

第一方面，本发明提供一种青枯菌提取组合物，以质量份计，所述组合物包含7.5份-8.3份氯化钠和8份-12份蛋白胨。

第二方面，本发明提供一种青枯菌提取液，所述提取液包含水以及如上所述的青枯菌提取组合物。

在其中一个示例中，每1L所述提取液包含7.5g-8.3g所述氯化钠和8g-12g 所述蛋白胨，例如包含7.5g所述氯化钠和12g所述蛋白胨，包含8.3g所述氯化钠和8g所述蛋白胨，包含8所述氯化钠和10所述蛋白胨。优选地，每1L所述提取液包含7.8g-8.3g所述氯化钠和8g-12g所述蛋白胨。

第三方面，本发明提供如上所述的青枯菌提取液的制备方法，所述制备方法包括：混合所述水、所述氯化钠和所述蛋白胨。

在其中一个示例中，所述制备方法还包括对混合所得产物进行灭菌的步骤。

第四方面，本发明提供一种木麻黄中青枯菌的鉴别方法，所述鉴别方法包括从待测木麻黄的植物组织中提取青枯菌并进行鉴别的步骤，提取采用如上所述的青枯菌提取液。

本发明对提取的方式不做特别的限定，包括但不限于采用浸提的方式，浸提的时长为15min-25min，例如包括但不限于如下时长或者这些时长之间的范围： 15min、16min、17min、18min、19min、20min。提取在野外条件下即可进行，提取青枯菌浓度可达10⁵cfu/mL以上，能够达到市售青枯菌试纸条的检测限。

本发明对植物组织的用量以及所述青枯菌提取液的用量不做特别限定，提取效果足以满足鉴别需求即可，包括但不限于每0.1g-0.2g所述待测木麻黄的植物组织对应所述青枯菌提取液的用量为1.5mL-2mL。例如每0.15g所述待测木麻黄的植物组织对应所述青枯菌提取液的用量为2mL。

本发明对鉴别的方式不做特别限定，可以采用但不限于采用青枯菌试纸条进行鉴别。例如美国Agdia公司生产的青枯菌试纸条，货号可以为STX 33900，也可以为ISK 33900的试纸条。采用试纸条快速便捷，适用于野外快速鉴别，鉴别的耗时一般需25s-35s，例如25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33 s、34s、35s。

本发明对木麻黄具体种类不做特别限定，包括但不限于短枝木麻黄、细枝木麻黄、粗枝木麻黄、山地木麻黄。

本发明对植物组织不做特别限定，考虑到青枯菌侵染需要一定的过程，选择根和树干相对于选择新枝新叶新芽等作为待测植物组织，检测会更加准确，避免出现假阴性。因此，优选地，所述植物组织选用根和/或树干，例如可以选取树干上的树皮进行检测。本发明对树皮的大小不做特别限定，例如可以控制在 1.5cm²-2.5cm²，以不对植株造成严重破坏为基准，从上向下刮出两片薄木片。切割木片太大、刀口太深不会影响结果观测，而会造成植株折断。在取样的过程中，考虑到可能存在交叉污染，所用工具例如刀片等可采用酒精等消毒。在取样后，为便于提取，可以将对取得的植物组织样本进行粉碎，并对所得碎屑进行提取。本发明在取样的过程中，可以优选针对植株为2年生或以上且胸径或地径在1.5cm以上的木麻黄植株，切削小部分植株树干不会对植株生长造成毁灭性伤害

实施例1

本实施例提供一种野外快速鉴定短枝木麻黄(Casuarina equisetifolia)青枯病的方法，包括以下步骤：

(1)配置青枯菌提取液

在实验室内准确称量8gNaCl，10g蛋白胨，先加入50mL蒸馏水中充分溶解，定量至1000mL。利用高压灭菌锅120℃下灭菌30min，备用。

(2)染病植株及健康植株选择

在青枯病疫区选择出现枝条中大部分枯萎变黄的植株(记作“处理1”)和目测完全健康生长的植株(记作“处理2”)，该林区已造林4年，林木树高均值 7m，胸径均值6.21cm。

另外，在远离青枯病疫区的试验林中，选择有枯萎枝条的植株(记作“处理3”)和生长健壮的植株(记作“处理4”)作为对照。

每个处理选择10株，每株重复测定3次，共计10株×4个处理×3次重复＝120次检测。

(3)材料切割

用锋利的小刀刮掉约2cm²面积树皮，从上向下沿树干轻轻削下两片薄木片，重约0.15g即可。

将木片用剪刀剪碎成木屑。所用的小刀和剪刀要及时用75％酒精消毒，酒精干后才能再次使用。

(4)青枯菌检测

将木屑置于配制好的2mL青枯菌提取液里，使木屑样品充分接触浸泡于青枯菌提取液中，静置20min后，将试纸条(货号为ISK 33900)插入青枯菌提取液，蓝色标记浸入青枯菌提取液中，静置30s左右。

试纸条上会出现三种情况：

对照线(control line)和检测线(test line)两条线变红，说明该植株已感染青枯病；

仅对照线(control line)一条线变红，说明该植株体内不含青枯菌；

如果对照线(control line)不变红，属于无效检测，如图1所示。

表1是对2个林区的枯萎植株和健康植株分别检测所获得的结果，其中青枯病疫区中，不论枯萎植株还是健康植株均出现了两条红线，即二者均已受青枯菌侵袭，确认已经感染了青枯病。而非疫区的植株均只出现了一条对照线 (control line)红线，表明植株中均未出现青枯菌，植株枯萎是其他原因造成的。

表1、短枝木麻黄感染青枯病检测结果

(5)菌株分子鉴定

将试纸条确认的染病植株材料带回实验室，分离出菌株，扩增16s RNA基因序列(许秀玉等，2017)。

结果表明，分离出的菌株可以扩增出280bp左右的目标条带(图2)，与青枯菌16sRNA分子量相同，可以确认该植株感染了青枯病。图2中，自左向右依次是1-1-1，1-1-2，1-1-3，1-2-1，1-2-2，1-2-3，2-1-1，2-1-2，2-1-3，2-2-1， 2-2-2，2-2-3(数字编号含义：处理-株数-重复)。

实施例2

本实施例提供一种野外快速鉴定短枝木麻黄(Casuarina equisetifolia)青枯病的方法，除了步骤(1)中青枯菌提取液设置5个氯化钠浓度(0.7％、0.75％、 0.8％、0.85％和0.9％)，且步骤(2)中只选择具有枯萎枝条(实施例1“处理1”) 的植株3株，每株重复测定3次，共计3株×5个浓度×3次重复＝45次检测，其他操作均与实施例1相同。

采用实施例1的条件，即参考其步骤(3)和步骤(4)，利用不同配比的提取液对染病植株进行了检测。

结果表明，氯化钠浓度为0.9％、0.85％和0.7％的青枯菌提取液处理的材料中未检测出青枯菌(图3)，推测可能原因是氯化钠浓度过高过低均不利于青枯菌。其余2个浓度下检测结果均呈阳性，但氯化钠浓度为0.75％的青枯菌提取液中青枯菌扩增活化后细菌浓度偏低(表2)，可判定氯化钠浓度为0.8％的青枯菌提取液为最适提取浓度。

表2、不同浓度氯化钠青枯菌提取液中细菌浓度(cfu/mL)

表中，“-”表示菌浓度低于10⁵cfu/mL。

实施例3

本实施例提供一种野外快速鉴定短枝木麻黄(Casuarina equisetifolia)青枯病的方法，除了步骤(2)中每个处理(“处理1”、“处理2”、“处理3”和“处理4”)选择3株标准木，步骤(3)中切割的材料为根、树干、嫩枝(其中根部需要严格消毒，并去除根部树皮)，每个组织部位重复测定3次，共计3株×4 个处理×3个组织×3次重复＝108次检测，其他操作均与实施例1相同。

表3、短枝木麻黄不同组织部位检测结果

采用实施例1的条件，即参考其步骤(3)和步骤(4)，对短枝木麻黄的根、树干、嫩枝分别进行了检测。其中疫区内枯萎植株中3个组织均携带青枯菌(表 3，图4)，健康植株体内根和树干中携带青枯菌，但还未波及到嫩枝。非疫区植株体内均未检测到青枯菌。

实施例4

本实施例提供一种野外快速鉴定短枝木麻黄(Casuarina equisetifolia)青枯病的方法，除了步骤(2)中选择的木麻黄为细枝木麻黄(Casuarina cunninghamiana)、粗枝木麻黄(Casuarina glauca)和山地木麻黄(Casuarina junghuhniana)(此三种为我国木麻黄常见引种造林树种，但面积远小于短枝木麻黄)，每个处理中每个种5株，重复测定3次(5株×3个种×4个处理×3次重复-15＝165次检测)外，其他操作均与实施例1相同。

表4、三种木麻黄感染青枯病检测结果

采用实施例1的条件，即参考其步骤(3)和步骤(4)，对另外三种木麻黄植物进行了检测，其中细枝木麻黄和山地木麻黄与短枝木麻黄情况类似，在青枯病疫区无论枯萎植株还是健康植株均携带青枯菌，非疫区植株均未发现青枯菌(表4，图5)。粗枝木麻黄在青枯病疫区并未出现枯萎现象，生长正常的植株中未发现青枯菌，推测青枯菌可能无法浸入粗枝木麻黄。

实施例5

本实施例提供一种野外快速鉴定短枝木麻黄(Casuarina equisetifolia)青枯病的方法，除了步骤(2)选择的木麻黄为20株短枝木麻黄无性系A8(每株测定1次)，分布在实施例1青枯病疫区试验地的周围外，其他操作均与实施例1 相同。

采用实施例1的条件，即参考其步骤(3)和步骤(4)，对青枯病疫区内短枝木麻黄无性系A8进行了检测。

该青枯病疫区内短枝木麻黄无性系A8所有植株均枯萎变黄甚至死亡，目测没有生长健康的植株，所取样的20株植株均表现为阳性(对照线和检测线两条线变红)，表明感染了青枯病(图6)。

实施例6

本实施例提供一种野外快速鉴定短枝木麻黄(Casuarina equisetifolia)青枯病的方法，除了步骤(2)选择的木麻黄为疫区内混交林(木麻黄与中国台湾相思、大叶相思、湿地松等混交)中22株短枝木麻黄，每株测定1次外，其他操作均与实施例1相同。

采用实施例1的条件，即参考其步骤(3)和步骤(4)，对青枯病疫区内混交林中短枝木麻黄进行了检测，包括4株枯萎植株(混交林中枯萎植株极少) 和18株健康植株。

结果表明，4株枯萎植株中有3株为阳性，1株为阴性，18株健康植株中有 1株为阳性，17株为阴性。说明混交可以有效阻碍青枯病的传播。

实施例7

本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处主要包括步骤 (1)中的提取液配方，具体地：

配方1：在实验室内准确称量7.5gNaCl，12g蛋白胨，先加入50mL蒸馏水中充分溶解，定量至1000mL。利用高压灭菌锅120℃下灭菌30min，备用。

配方2：在实验室内准确称量8.3gNaCl，8g蛋白胨，先加入50mL蒸馏水中充分溶解，定量至1000mL。利用高压灭菌锅120℃下灭菌30min，备用。

配方3：在实验室内准确称量8gNaCl，15g蛋白胨，先加入50mL蒸馏水中充分溶解，定量至1000mL。利用高压灭菌锅120℃下灭菌30min，备用。

采用实施例1的方法，对实施例1中的“处理1”进行检测，结果表明，利用配方1、配方2的青枯菌提取液也能检测到青枯菌，但细菌浓度相对较低。而配方3则无法检测到青枯菌。

表5、不同配方检测结果(cfu/mL)

表中，“-”表示菌浓度低于10⁵cfu/mL。

综上所述，本发明将合适比例的氯化钠和琼脂搭配组合，含有该组合的提取液能快速从少量木麻黄植物组织中提取青枯菌，并且提取的青枯菌足以用于鉴别，特别是足以用于青枯菌试纸鉴别，为野外就地快速检测青枯菌提供了可靠手段。具体地：(1)避免破坏检测植株，保护抗病植株。本发明可通过切取少量植物组织(例如木质部材料)检测青枯菌，避免了常规野外鉴定需砍断整株植株，有效避免了对植株的损伤，可以大大提高抗病植株的保存率。(2)利于更早发现木麻黄青枯病。本发明提取到的青枯菌足以用于青枯菌试纸鉴别，实现木麻黄青枯菌的微量检测，对难以通过砍树目测诊断是否存在的青枯病害或病症初期的木麻黄植株也能做检测，对砍树不会出现浓状分泌物之前的植株仍能够检测出木麻黄青枯菌。青枯菌试纸检测，耗时短，检测效率高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。