分子标志物在缺血性脑卒中诊治中的应用
阅读说明：本技术 分子标志物在缺血性脑卒中诊治中的应用 (Application of molecular marker in diagnosis and treatment of ischemic stroke ) 是由 蔡学礼 兰卫明 孙景萍 舒小桓 谢慧蓉 詹艳丽 吴新校 吴骏 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术、生物医药领域,具体涉及分子标志物在缺血性脑卒中诊治中的应用。本发明提供的标志物或标志物组合在临床诊断中有重要的意义；所述标志物包括ZNF22、RPS27、ZNF416,标志物的组合在诊断时AUC值会显著提高。(The invention relates to the fields of biotechnology and biomedicine, in particular to application of a molecular marker in diagnosis and treatment of ischemic stroke. The marker or the marker combination provided by the invention has important significance in clinical diagnosis; the markers comprise ZNF22, RPS27 and ZNF416, and the AUC value of the combination of the markers is obviously improved in diagnosis.)
技术领域
本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及分子标志物在缺血性脑卒中诊治中的应用。
背景技术
缺血性卒中又称脑梗死，中医称之为卒中或中风。本病是由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现。脑梗死依据发病机制的不同分为脑血栓形成、脑栓塞和腔隙性脑梗死等主要类型。其中脑血栓形成是脑梗死最常见的类型，约占全部脑梗死的60％，因而通常所说的‘脑梗死’实际上指的是脑血栓形成。
由于脑血栓形成的病因基础主要为动脉粥样硬化，因而产生动脉粥样硬化的因素是发生脑梗死最常见的病因。近期在全球范围内进行的研究结果显示：脑梗死风险中的90％可归咎于10个简单的危险因素，它们依次是高血压病、吸烟、腰臀比过大、饮食不当、缺乏体育锻炼、糖尿病、过量饮酒、过度的精神压力及抑郁、有基础心脏疾病和高脂血症，以上大多数危险因素都是可控的。
本病好发于50～60岁以上的中、老年人，男性稍多于女性。其常合并有动脉硬化、高血压、高脂血症或糖尿病等危险因素或对应的全身性非特异性症状。脑梗死的前驱症状无特殊性，部分患者可能有头昏、一时性肢体麻木、无力等短暂性脑缺血发作的表现。而这些症状往往由于持续时间较短和程度轻微而被患者及家属忽略。脑梗死发病起病急，多在休息或睡眠中发病，其临床症状在发病后数小时或1～2天达到高峰。
脑梗死属于急症，也是一个高致残率及高致死率的疾病。本病的治疗原则是：争取超早期治疗，在发病4.5小时内尽可能静脉溶栓治疗，在发病6-8小时内有条件的医院可进行适当的急性期血管内干预；确定个体化和整体化治疗方案，依据患者自身的危险因素、病情程度等采用对应针对性治疗，结合神经外科、康复科及护理部分等多个科室的努力实现一体化治疗，以最大程度提高治疗效果和改善预后。
发明内容
发明人通过对收集的病患样本及数据库信息进行生物信息学分析，筛选到了可以诊断缺血性脑卒中的标志物，进一步对标志物进行组合得到了更高效的诊断标志物组合，所述标志物或标志物组合在临床应用中有重要的意义。
标志物组合
一方面，本发明提供了一种诊断脑卒中的标志物组合，所述标志物包括RPS27、ZNF22、ZNF416中至少两个。
优选地，所述脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中。
优选地，所述脑卒中是缺血性脑卒中。
优选地，所述RPS27在患者中低表达。
优选地，所述ZNF22在患者中低表达。
优选地，所述ZNF416在患者中低表达。
优选地，所述高表达指所述标志物在患者体内的表达水平大于健康对照群体体内的表达水平，相对于对照表达水平高至少1.1倍，具体地，至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多。
优选地，所述低表达指所述标志物在患者体内的表达水平小于健康对照群体体内的表达水平，例如是对照表达量的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
诊断疾病的应用
一方面本发明提供了检测前述标志物组合或前述标志物组合中任意一个标志物的表达量的试剂在制备诊断受试者是否患有脑卒中的产品中的应用。
优选地，所述检测表达量的试剂包括检测mRNA表达量和/或蛋白表达量的试剂。
优选地，所述检测包括定量或定性的检测。
优选地，所述检测mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。
优选地，所述基于PCR的检测方法包括以下至少任意一种：将提取RNA的步骤、mRNA逆转录为cDNA的步骤、测量cDNA的含量的步骤。
优选地，所述测量cDNA的含量的方法包括但不限于PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM。
优选地，所述检测mRNA表达量的试剂包括特异性引物和/或探针。
优选地，所述探针包括杂交型探针和水解型探针(Taqman探针)。
优选地，所述探针的两端连接有淬灭基团和/或荧光基团。
优选地，所述荧光基团包括但不限于FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LC RED460。
优选地，所述淬灭基团包括但不限于DABCYL、TAMRA、MGB、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3。
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：蛋白质印迹(Western Blot法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片法。
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括的抗体或其片段，所述的抗体或其片段能特异性的与蛋白结合。
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂还包括二抗，所述二抗能与前述的抗体或其片段结合并且显色。
优选地，所述显色通过显色剂体现，所述显色剂包括但不限于荧光染料(包括荧光分子)、化学发光标记物、荧光素酶、金属离子、生物素、放射性同位素、在UV光谱中进行吸收的分子、在近红外辐射中能够进行吸收的分子或远红外辐射中能够进行吸收的分子。
优选地，所述荧光染料包括但不限于罗丹明、对甲氨基酚、荧光素、硫代荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯代荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基对甲氨基酚、羧基对甲氨基酚、氯代对甲氨基酚、甲基对甲氨基酚、磺基对甲氨基酚、氨基罗丹明、羧基罗丹明、氯代罗丹明、甲基罗丹明、磺基罗丹明、以及硫代罗丹明、菁、吲哚碳菁、氧杂碳菁、噻碳菁、部花青、菁染料、噁二唑衍生物、吡啶基噁唑、硝基苯噁二唑、苯并硝基苯、芘衍生物、瀑布蓝、噁嗪衍生物、尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170、吖淀衍生物、前黄素、吖啶橙、吖啶黄、芳基甲川衍生物、金胺、噻吨染料、磺化噻吨染料、亚历克萨荧光(AlexaFluor)、结晶紫、孔雀绿、四吡咯衍生物、卟啉、酞菁、胆红素、Cy5.5、吲哚菁绿(ICG)、DyLight750或IRdye800。
优选地，所述化学发光标记物包括但不限于过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、水母发光蛋白、官能化的铁-卟啉衍生物、鲁米那、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、磺酰胺等。
优选地，所述荧光素酶包括但不限于长腹水蚤(Gaussia)荧光素酶、海肾(Renilla)荧光素酶、腰鞭毛虫荧光素酶、萤火虫荧光素酶、真菌荧光素酶、细菌荧光素酶和弯喉萤(vargula)荧光素酶。
优选地，所述的抗体或其片段还可以直接与显色剂结合，检测到所述显色剂显示就表示蛋白有表达。
优选地，所述检测需要采集来自患者的样品。
优选地，所述样品包括：血液、鼻上皮细胞、组织、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
优选地，所述样品是血液。
产品
另一方面本发明提供了一种诊断受试者是否患有脑卒中的试剂盒，所述试剂盒包括检测前述标志物组合或前述标志物组合中任意一个标志物的试剂。
优选地，所述试剂盒还包括前述检测受试者的表达量所使用的仪器。
优选地，所述试剂盒还包括检测其他疾病标志物的试剂和/或仪器。
另一方面本发明还提供了前述试剂盒在制备诊断脑卒中的产品中的应用。
方法
另一方面本发明提供诊断受试者是否患有脑卒中的方法，所述方法包括检测受试者的前述标志物组合或前述标志物组合中任意一个标志物的表达量。
附图说明
图1为差异基因的差异箱线图，A是RPS27，B是ZNF22，C是ZNF416。
图2为标志物RPS27在诊断缺血性脑卒中时的ROC曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
图3为标志物ZNF22在诊断缺血性脑卒中时的ROC曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
图4为标志物ZNF416在诊断缺血性脑卒中时的ROC曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
图5为标志物RPS27_ZNF22在诊断缺血性脑卒中时的ROC曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
图6为标志物ZNF22_ZNF416在诊断缺血性脑卒中时的ROC曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
图7为标志物RPS27_ZNF416在诊断缺血性脑卒中时的ROC曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
图8为标志物RPS27_ZNF22_ZNF416在诊断缺血性脑卒中时的ROC曲线图；纵坐标是敏感度，横坐标是特异性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、筛选并验证标志物组合的诊断效果
收集病患的血液样品，患者信息如表1所示，进行测序，筛选在健康者和患者间差异表达的基因；差异表达分析使用软件：Ballgown(http://cole-trapnell-lab.github.io/cuffl inks/cuffdiff/index.html)。用差异表达筛选标准进行筛选，得到差异基因479个，其中表达上调基因346个，表达下调的基因有133个。
表1.样本信息
下载网络数据库GSE22255，其是缺血性中风的血液基因组表达谱，在数据库的基因表达谱中进行同样的差异分析；筛选在患者样本和数据库中检测的变化一致的标志物，筛选得到的部分标志物的差异表达箱线图如图1所，其在患者体内的表达变化如表2所示，Ture表示在两次分析中结果一致。
表2.差异表达基因
前期研究
GSE22255
ZNF22
down
down
Ture
RPS27
down
down
Ture
ZNF416
down
down
Ture
利用数据库的数据，对表2所示的标志物进行排列组合，进一步筛选准确度更高的标志物组合，每个标志物或标志物的组合在诊断时的AUC值如表3所示，ROC曲线依次如图2-8所示，附图和标志物或标志物组合的关系如最后一列所示。
表3.诊断的AUC值
标志物/标志物组合
AUC
附图
RPS27
0.703
2
ZNF22
0.733
3
ZNF416
0.74
4
RPS27_ZNF22
0.765
5
ZNF22_ZNF416
0.7775
6
RPS27_ZNF416
0.795
7
RPS27_ZNF22_ZNF416
0.818
8
注：表中_代表标志物联合使用
由AUC结果可知RPS27、ZNF22、ZNF416每个标志物单独都可以作为诊断脑卒中的标志物，并且其组合后AUC值会进一步升高，获得更高的诊断准确性。