同时检测先天性肾上腺皮质增生症相关9个基因多种突变的引物组和试剂盒
阅读说明：本技术 同时检测先天性肾上腺皮质增生症相关9个基因多种突变的引物组和试剂盒 (Primer group and kit for simultaneously detecting multiple mutations of 9 genes related to congenital adrenal cortical hyperplasia ) 是由 李佳琪 蒋敏捷 卢玉林 毛爱平 任志林 于 2021-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种同时检测先天性肾上腺皮质增生症相关9个基因多种突变的引物组、试剂盒和方法。其中所述试剂盒包括以下试剂：(1)用于多重PCR扩增的试剂；和(2)用于构建三代测序文库的试剂。其中所述方法包括以下步骤：(1)制备受试者样本；(2)多重PCR扩增所述样本中9个基因(CYP21A2、CYP21A1P、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、HSD3B2、StAR、POR和CYP11A1)；(3)构建三代测序文库；(4)测序并分析基因突变类型。(The invention relates to a primer group, a kit and a method for simultaneously detecting multiple mutations of 9 genes related to congenital adrenal cortical hyperplasia. Wherein the kit comprises the following reagents: (1) reagents for multiplex PCR amplification; and (2) reagents for constructing a three-generation sequencing library. Wherein the method comprises the steps of: (1) preparing a sample of a subject; (2) multiplex PCR amplification of 9 genes in the sample: ( CYP21A2 、 CYP21A1P 、 CYP11B1 、 CYP11B2 、 CYP17A1 、 HSD3B2 、 StAR 、 POR And CYP11A1 ) (ii) a (3) Constructing a third generation sequencing library; (4) sequencing and analyzing the gene mutation types.)
技术领域
本发明涉及一种利用三代长读长测序平台同时检测先天性肾上腺皮质增生症相关的9个基因多种突变的引物组和试剂盒，以及相关的方法。
背景技术
先天性肾上腺皮质增生症（Congenital Adrenal Hyperplasia, CAH）是一组由肾上腺皮质激素合成过程中酶的缺陷引起的常染色体隐性遗传病。根据酶缺陷类型的不同，CAH可分为21-羟化酶缺乏症（21-Hydroxylase deficiency，21-OHD）、11β-羟化酶缺乏症（11β-Hydroxylase deficiency，11β-OHD）、17α-羟化酶缺乏症（17α-Hydroxylasedeficiency, 17α-OHD）、3β-羟类固醇脱氢酶缺乏症（3β-Hydroxysteroid dehydrogenasetype 2 deficiency, 3β-HSD）、先天性肾上腺脂质增生症（Lipoid CAH）、细胞色素P450氧化还原酶缺陷症（Cytochrome P450 oxidoreductase deficiency，POR deficiency）、胆固醇侧链裂解酶缺乏症（Cholesterol Side-Chain Cleavage Enzyme Deficiency，SCCdeficiency），分别由CYP21A2、CYP11B1、CYP17A1、HSD3B2、StAR、POR和CYP11A1这7种基因的突变引起1。其中21-OHD最常见，约占CAH的90-95%，11β-OHD约占5-8%，17α-OHD和3β-HSD各约占1%或低于1%，其他三种类型较为罕见1, 2。
根据临床表型的由重到轻，21-OHD可以分为失盐型（salt wasting，SW）、单纯男性化型（simple virilizing，SV）和非典型性CAH（nonclassic CAH，NCCAH），其中失盐型和单纯男性化型统称为典型CAH。引起21-OHD的人源CYP21A2基因位于6p21.3的HLAIII类基因区，长度约3.2kb，具有10个外显子和9个内含子。CYP21A2基因和对应的假基因CYP21A1P的外显子和内含子的同源性分别为98%和96%。CYP21A1P与CYP21A2对比，有10个位置突变会导致基因功能的缺失，包括c.92C>T (p.P30L)、c.293-13C/A>G (In2G)、c.332_339del(p.G110Efs)、c.518T>A (p.I172N)、E6 Cluster（c.710T>A （p.I236N）、c.713T>A(p.V237E)、c.719T>A (p.M239K)）、c.845T>G (p.V281L)、c.923dup (p.L307fs)、c.955C>T(p.Q318X)、c.1069C>T (p.R356W)、c.1360C>T (p.453S)3。如图1所示，端粒侧基因串RP1-C4A-CYP21A1P-TNXA和着丝粒侧同源基因串RP2-C4B-CYP21A2-TNXB串联形成双RCCX模式。RCCX模式的高同源性使得在有丝分裂或减数分裂期间可能发生不平等互换或重组。约70%的CYP21A2基因突变是由于与假基因CYP21A1P发生了基因转换引起致病性点突变。20-25%的CYP21A2基因突变是由于不平等交换导致30kb的大片段缺失，包括由CYP21A1P和CYP21A2之间的基因重组导致的9种CYP21A1P/CYP21A2嵌合体CH1-CH9大片段缺失，和由TNXA和TNXB之间的基因重组导致的3种TNXA/TNXB嵌合体CH1-CH3大片段缺失3。TNXA/TNXB嵌合体会导致CYP21A2整个基因缺失，以及TNXB基因部分外显子与TNXA交换从而失去功能，引起CAH-X。约10%的CAH人群患有CAH-X，这是一种结缔组织发育异常，与活动过度型Ehlers-Danlos综合征（EDS）表型一致。同源重组导致的不同等交换还会产生三个甚至更多的RCCX模式，可能和p.Q318X点突变相关4。目前分子检测21-OHD最常用的方法是通过MLPA检测大片段缺失或拷贝数增加，结合Sanger测序特异性检测真基因CYP21A2上的点突变5。但是CYP21A2和CYP21A1P之间存在复杂的重组关系，即真基因CYP21A2上会存在假基因CYP21A1P上特征性碱基序列，而假基因CYP21A1P上也会存在真基因CYP21A2上特征性序列，这些会干扰MLPA探针的特异性，也会干扰Sanger测序时PCR扩增引物和测序引物的特异性，在实际检测中会导致漏诊和误诊5, 6, 7。扩增引物设计在CYP21A1P和CYP21A2同源区域两端的长片段PCR有利于特异性扩增CYP21A2片段，或CYP21A1P-CYP21A2嵌合体，结合二代测序（Next-generationsequencing, NGS），可以特异性检测真基因的点突变。但是这种方法每个片段都需要构建一个NGS测序文库，不能与其他基因检测兼容，流程比较繁琐，而且不能够检测多RCCX模式8, 9, 10。
11β-OHD的致病基因CYP11B1位于染色体8q24.3，由9个外显子和8个内含子组成。导致CYP11B1功能缺失的突变主要为无义突变和错义突变，主要分布在编码区域。CYP11B1与相距约40kb的同源基因CYP11B2会形成嵌合基因CYP11B2/CYP11B1，导致糖皮质类固醇可抑制性醛固酮增多症；罕见的CYP11B2/CYP11B1嵌合基因类型也可能导致CAH1, 11。17α-OHD、3β-HSD、Lipoid CAH、POR deficiency 和SCC deficiency相对比较罕见，目前研究发现其致病基因CYP17A1、HSD3B2、StAR、POR和CYP11A1的突变类型主要为点突变1。
目前基于qPCR、MLPA、Sanger测序或二代测序的方法，可以实现CYP21A2基因拷贝数和大部分CAH相关基因的点突变检测，但检测主要有以下几方面局限性：
1、无法实现在同一体系内同时检测CAH相关的所有基因所有突变类型检测；
2、由于假基因CYP21A1P和真基因CYP21A2之间存在多次重组的可能性，影响MLPA探针的结合和Sanger测序引物的设计，会导致一定程度的漏检和误检；
3、无法深入分析多重RCCX模式的重组方式和单体型；
4、当同一个基因位点上同时存在两个或多个突变时，现有的方法无法区分顺式还是反式突变。
发明内容
鉴于此，本发明基于多重PCR扩增和三代测序来同时检测CAH相关9个基因多种突变。多重PCR扩增可在单反应管中实现同时扩增CAH相关9个基因（CYP21A2、CYP21A1P、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、HSD3B2、StAR、POR和CYP11A1）的点突变、结构变异和拷贝数突变，结合读长测长的三代测序平台读长测长等特点，可以实现准确、快速并高通量地检测CAH相关基因突变。本发明涉及的方法操作简便，多重PCR和三代文库质量可靠且重复性强，有利于三代测序技术在临床检测上的应用。
本发明的目的在于解决现阶段CAH致病基因覆盖不全、CYP21A2和CYP21A1P真假基因区分困难、RCCX模块的拷贝数检测困难、无法确定突变是否连锁等会导致临床上存在漏检和误检的问题。通过多重PCR同时扩增CAH相关的9个致病基因的12个片段及制备三代测序文库，实现全面、精确和快速检测多个样品CAH基因多种突变的目标。
首先，根据本发明的第一方面，本发明涉及一种用于同时扩增肾上腺皮质增生症相关9个基因多种突变的引物组，所述引物组包含如下的一对或多对引物：CYP21A2-F和CYP21A2-R，CYP21A1P-F和CYP21A1P-R，CYP11B1-F和CYP11B1-R，CYP11B1-F和CYP11B2-R，CYP17A1-F和CYP17A1-R，HSD3B2-F和HSD3B2-R，StAR-F和StAR-R，POR-F1和POR-R1，POR-F2和POR-R2，POR-F3和POR-R3，CYP11A1-F1和CYP11A1-R1，以及CYP11A1-F2和CYP11A1-R2（引物位置如图1所示）。
其中，所述的CYP21A2-F和CYP21A2-R分别位于基因组hg38 chr6:32,038,415-32,046,127的上下游；CYP21A1P-F和CYP21A1P-R分别位于基因组hg38 chr6:32,005,630-32,013,273的上下游；CYP11B1-F和CYP11B1-R分别位于基因组hg38 chr8:142,872,357-142,879,825的上下游，CYP11B1-F和CYP11B2-R分别位于基因组hg38 chr8:142,872,357-142,917,843的上下游；CYP17A1-F和CYP17A1-R分别位于基因组hg38 chr10:102,830,531-102,837,472的上下游；HSD3B2-F和HSD3B2-R分别位于基因组hg38 chr1:119,414,931-119,422,620的上下游；POR-F1和POR-R1分别位于基因组hg38 chr7:75,953,989-75,954,180的上下游；POR-F2和POR-R2分别位于基因组hg38 chr7:75,972,413-75,972,461的上下游；POR-F3和POR-R3分别位于基因组hg38 chr7:75,979,451-75,986,481的上下游；CYP11A1-F1和CYP11A1-R1分别位于基因组hg38chr15:74,337,972-74,348,055的上下游，以及CYP11A1-F2和CYP11A1-R2分别位于基因组hg38 chr15: 74,367,317-74,365,752的上下游。
所述引物可以扩增基因组上引物范围内的完整全部序列，包括引物范围内任何类型的突变序列。优选地，每个引物的扩增产物小于15Kb。优选地，如果引物位置有SNP，则使用简并碱基引物。
在一个具体的实施方案中，其中所述引物序列如表1中SEQ ID NO: 1-23所示。
在一个优选的实施方案中，其中所述的可以同时扩增9个基因突变的引物组，其至少可以同时检测：CYP21A1P与CYP21A2基因重组导致的大片段缺失，TNXA与TNXB基因重组导致的大片段缺失，以及与这些缺失对应的基因拷贝数增加；CYP11B1与CYP11B2基因重组导致的大片段缺失；如表2所示的CYP21A2基因上的951种点突变；如表3所示的CYP11B1基因上的138种点突变；如表4所示的HSD3B2基因上的114种点突变；如表5所示的CYP17A1基因上的128种点突变；如表6所示的StAR基因上的136种点突变；如表7所示的POR基因上的248种点突变；如表8所示的CYP11A1基因上的62种点突变。
其中，本文所述的基因位点上的点突变和结构变异，可在LOVD、ClinVar和参考文献中查询；详细突变信息参见表2-8。
在一个优选的实施方案中，本发明的引物组可以同时检测检测假基因CYP21A1P-TNXA、真基因CYP21A2-TNXB以及真假基因重组产物CYP21A1P-CYP21A2-TNXB、CYP21A2-CYP21A1P-TNXA及CYP21A2-TNXA的拷贝数；还可以检测CYP11B1和CYP11B2基因之间重组导致的突变。
在一个实施方案中，可以在所述引物的5’端加入5-50nt不同序列的DNA，即DNA条形码（Barcode），用于区分不同的样本；优选地，F和R引物的5’端Barcode可以相同或者不同，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个优选的实验方案中，其中所述引物组用于多重PCR扩增9个基因的12个片段；还可用于检测单个扩增基因片段内的不同突变是否连锁。
本发明的引物组可以用于多重引物PCR扩增包括所有引物范围内突变类型的CAH相关致病基因片段。再结合后续的PacBio或Nanopore测序平台，可以检测引物范围内所有基因片段的突变类型。
根据本发明第二方面，提供了可同时检测CAH相关9个基因多种突变的试剂盒，包括以下试剂：
（1）用于多重PCR扩增的试剂；
（2）用于构建三代测序文库的试剂。
在一个实施方案中，其中所述用于多重PCR扩增的试剂包括DNA聚合酶、反应缓冲液和引物组。
在一个优选的实施方案中，所述试剂盒中的引物组选自以下的23条引物中的一个或多个引物对：
CYP21A2-F和CYP21A2-R，CYP21A1P-F和CYP21A1P-R，CYP11B1-F和CYP11B1-R，CYP11B1-F和CYP11B2-R，CYP17A1-F和CYP17A1-R，HSD3B2-F和HSD3B2-R，StAR-F和StAR-R，POR-F1和POR-R1，POR-F2和POR-R2，POR-F3和POR-R3，CYP11A1-F1和CYP11A1-R1，以及CYP11A1-F2和CYP11A1-R2（引物位置如图1所示）。
其中，所述的CYP21A2-F和CYP21A2-R分别位于基因组hg38 chr6:32,038,415-32,046,127的上下游；CYP21A1P-F和CYP21A1P-R分别位于基因组hg38 chr6:32,005,630-32,013,273的上下游；CYP11B1-F和CYP11B1-R分别位于基因组hg38 chr8:142,872,357-142,879,825的上下游，CYP11B1-F和CYP11B2-R分别位于基因组hg38 chr8:142,872,357-142,917,843的上下游；CYP17A1-F和CYP17A1-R分别位于基因组hg38 chr10:102,830,531-102,837,472的上下游；HSD3B2-F和HSD3B2-R分别位于基因组hg38 chr1:119,414,931-119,422,620的上下游；POR-F1和POR-R1分别位于基因组hg38 chr7:75,953,989-75,954,180的上下游；POR-F2和POR-R2分别位于基因组hg38 chr7:75,972,413-75,972,461的上下游；POR-F3和POR-R3分别位于基因组hg38 chr7:75,979,451-75,986,481的上下游；CYP11A1-F1和CYP11A1-R1分别位于基因组hg38chr15:74,337,972-74,348,055的上下游，以及CYP11A1-F2和CYP11A1-R2分别位于基因组hg38 chr15: 74,367,317-74,365,752的上下游。所述引物可以扩增引物范围内的完整全部序列，包括引物范围内任何类型的突变序列。
优选地，每个引物的扩增产物小于15Kb。优选地，如果引物位置有SNP，则使用简并碱基引物。
在一个优选的实施方案中，其中所述引物序列如表1中SEQ ID NO: 1-23所示。
在一个优选的实施方案中，可以在所述试剂盒中的引物的5’端加入5-50nt不同序列的DNA（Barcode），用于区分不同的样本；优选地，F和R引物的5’端Barcode可以一样或者不一样，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个实施方案中，对于所述试剂盒，PCR扩增产物在进行下一步反应前，可以纯化或者不纯化，本领域技术人员可以根据需要选择。
在另一个实施方案中，其中所述试剂盒中，用于构建三代测序文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、反应缓冲液和外切酶。
在一个优选的实施方案中，其中所述的试剂盒其至少可以同时检测：CYP21A1P与CYP21A2基因重组导致的大片段缺失，TNXA与TNXB基因重组导致的大片段缺失，以及与这些缺失对应的基因拷贝数增加；CYP11B1与CYP11B2基因重组导致的大片段缺失；如表2所示的CYP21A2基因上的951种点突变；如表3所示的CYP11B1基因上的138种点突变；如表4所示的HSD3B2基因上的114种点突变；如表5所示的CYP17A1基因上的128种点突变；如表6所示的StAR基因上的136种点突变；如表7所示的POR基因上的248种点突变；如表8所示的CYP11A1基因上的62种点突变。
其中，本文所述的基因位点上的点突变和结构变异，可在LOVD、ClinVar和参考文献中查询；详细突变信息参见表2-8。
在一个优选的实施方案中，其中所述的试剂盒可以同时检测检测假基因CYP21A1P-TNXA、真基因CYP21A2-TNXB以及真假基因重组产物CYP21A1P-CYP21A2-TNXB、CYP21A2-CYP21A1P-TNXA及CYP21A2-TNXA的拷贝数；还可以检测CYP11B1和CYP11B2基因之间重组导致的突变。
在一个优选的实验方案中，其中所述引物组用于多重PCR扩增9个基因的12个片段；还可用于检测单个扩增基因片段内的不同突变是否连锁。
在一个具体的实施方案中，其中对于所述试剂盒，多重PCR扩增在单反应管中完成。
在一个优选的实施方案中，三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或ONT公司的Nanopore测序。
在一个具体的实施方案中，PacBio文库接头连接可以使用平末端连接或TA连接的方式。
在一个具体的实施方案中，PacBio通用平末端接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT-3’（SEQ ID NO: 24），通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的DNA（Barcode）形成不同带Barcode的接头适配子。带有不同Barcode的PacBio文库可以混合在一起测序。
在一个具体的实施方案中，PacBio通用TA接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGATT-3’（SEQ ID NO: 25），通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的DNA（Barcode）形成不同带Barcode的接头适配子。带有不同Barcode的PacBio文库可以混合在一起测序。
在一个实施方案中，PacBio接头可以带或者不带Barcode。优选地，PacBio接头带PacBio公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个优选的实施方案中，所述PacBio文库与Pacific Biosciences公司测序平台匹配。
在一个优选的实施方案，其中所述用于构建三代Nanopore文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、80%乙醇和反应缓冲液。
在一个实施方案中，Nanopore文库接头连接可以使用平末端连接或TA连接的方式。
在一个实施方案中，Nanopore接头可以带或者不带Barcode。优选地，Nanopore接头带ONT公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个优选的实施方案中，所述Nanopore文库与ONT公司测序平台匹配。
本发明第三方面提供一种同时检测先天性肾上腺皮质增生症相关9个基因多种突变的系统，包括以下部分：
（1）采集模块：能够获得受试者样本；
（2）扩增模块：多重PCR扩增所述样本中9个基因，所述基因为CYP21A2、CYP21A1P、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、HSD3B2、StAR、POR和CYP11A1；
（3）文库构建模块：构建三代测序文库；
（4）测序模块：测序并分析基因突变类型；
其中所述用于多重PCR扩增的引物组为本发明上文所述的引物组。
在一些实施方案中，所述系统中扩增模块中，所述多重PCR扩增在单反应管中完成。
在一些实施方案中，所述三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或Oxford Nanopore Technologies（ONT）的Nanopore测序。
另一方面，本发明提供了一种同时检测先天性肾上腺皮质增生症相关9个基因多种突变的方法，包括以下步骤：
（1）制备受试者样本；
（2）多重PCR扩增所述样本中9个基因，所述基因为CYP21A2、CYP21A1P、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、HSD3B2、StAR、POR和CYP11A1；
（3）构建三代测序文库；
（4）测序并分析基因突变类型。
在一个实施方案中，本发明方法使用的多重PCR引物组，选自如上文所述的引物组。优选地，可以在上文所述的引物的5’端加入5-50nt不同序列的DNA（Barcode），用于区分不同的样本。
在一个优选的实施方案中，F和R引物的5’端Barcode可以一样或者不一样，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个优选的实施方案中，其中所述的方法其至少可以同时检测：CYP21A1P与CYP21A2基因重组导致的大片段缺失，TNXA与TNXB基因重组导致的大片段缺失，以及与这些缺失对应的基因拷贝数增加；CYP11B1与CYP11B2基因重组导致的大片段缺失；如表2所示的CYP21A2基因上的951种点突变；如表3所示的CYP11B1基因上的138种点突变；如表4所示的HSD3B2基因上的114种点突变；如表5所示的CYP17A1基因上的128种点突变；如表6所示的StAR基因上的136种点突变；如表7所示的POR基因上的248种点突变；如表8所示的CYP11A1基因上的62种点突变。
其中，本文所述的基因位点上的点突变和结构变异，可在LOVD、ClinVar和参考文献中查询；详细突变信息参见表2-8。
在一个优选的实施方案中，其中所述的方法可以同时检测检测假基因CYP21A1P-TNXA、真基因CYP21A2-TNXB以及真假基因重组产物CYP21A1P-CYP21A2-TNXB、CYP21A2-CYP21A1P-TNXA及CYP21A2-TNXA的拷贝数；还可以检测CYP11B1和CYP11B2基因之间重组导致的突变。
在一个优选的实验方案中，其中所述引物组用于多重PCR扩增9个基因的12个片段；还可用于检测单个扩增基因片段内的不同突变是否连锁。
在一个优选的实施方案中，其中所述方法中，多重PCR扩增在单反应管中完成。
在一个实施方案中，其中所述样本选自生物样本或样本提取的gDNA。其中生物样本选自培养的细胞系、血液、羊水、绒毛、配子、囊胚细胞、关节液、尿液、汗液、唾液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁或胰腺液等。
在一个具体的实施方案中，其中所述方法的三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或ONT公司的Nanopore测序。
在一个实施方案中，PacBio文库接头连接可以使用平末端连接或TA连接的方式。
在一个实施方案中，PacBio通用平末端接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT-3’（SEQ ID NO: 24），通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的DNA（Barcode）形成不同带Barcode的接头适配子。带有不同Barcode的PacBio文库可以混合在一起测序。
在一个实施方案中，PacBio通用TA接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGATT-3’（SEQ ID NO: 25），通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的DNA（Barcode）形成不同带Barcode的接头适配子，带有不同Barcode的PacBio文库可以混合在一起测序。
在一个实施方案中，PacBio接头可以带或者不带Barcode。在优选的实施方案中，PacBio接头带PacBio公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode。本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个优选的实施方案中，所述PacBio文库与Pacific Biosciences公司测序平台匹配。
在一个优选的实施方案中，其中所述用于构建三代Nanopore文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、80%乙醇和反应缓冲液。
在一个实施方案中，Nanopore文库接头连接可以使用平末端连接或TA连接的方式。
在一个实施方案中，Nanopore接头可以带或者不带Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。优选地，Nanopore接头带ONT公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个优选的实施方案中，所述Nanopore文库与ONT公司测序平台匹配。
基于长片段多重PCR扩增和第三代高通量测序特定组合的本发明所述的方法可高特异性地、准确和快速地实现同时检测多个样品CAH相关9个致病基因的多种突变。
本发明所述方法和试剂盒的优异技术效果主要在于以下几个方面：
（1）检测范围广。本发明可以同时检测目前已研究发现的CAH相关所有基因的突变。包括CYP21A1P与CYP21A2基因重组导致的大片段缺失，TNXA与TNXB基因重组导致的大片段缺失，以及与这些缺失对应的基因拷贝数增加；CYP11B1与CYP11B2基因重组导致的大片段缺失；951种CYP21A2基因上的点突变；138种CYP11B1基因上的点突变；114种HSD3B2基因上的点突变；128种CYP17A1基因上的点突变；136种StAR基因上的点突变；248种POR基因上的点突变；62种CYP11A1基因上的点突变。同时，由于三代测序读长测长的特性，本发明还可以检测不同突变是否连锁。
（2）多种突变类型单管检测。传统的方法针对每种突变类型都需要设置一种检测体系，而本发明在一个反应引物体系里同时检测多种突变，包括SNV、Indel、基因重组和拷贝数变异。
（3）检测误检和漏检率低。目前通用的检测CAH最常见的致病基因CYP21A2的方法是MLPA结合Sanger测序。由于真基因CYP21A2和假基因CYP21A1P的同源性超过96%，且基因之间会发生多次重组，真假基因之间的特征性位点并不特异，所以会干扰Sanger测序结果。而本发明直接扩增CYP21A1、CYP21A1P和重组基因的全长片段，不存在误检和漏检的风险。
（4）样本多样化。用于PCR的模板可以是外周血、干血斑或经提取的基因组DNA，也可以是人源细胞系或其他特定的组织。
（5）高通量检测。三代测序可实现384种Barcode接头，实际还可以根据需要设计更多种Barcode接头。或者利用引物带Barcode和接头带Barcode的双Barcode实现更多种Barcode组合。三代测序平台的高通量特性决定可以实现高通量样品检测。
（6）精确度高。PacBio的哑铃状文库在测序时可进行多轮解读，矫正后测序结果碱基精确度大于99%。而且PacBio测序错误是随机的，再通过测序深度矫正碱基精确度大于99.9%。因此可以精确解读引物检测范围内的基因突变。
（7）检测时间灵活。Nanopore平台可在数分钟内产生数据，可根据实际数据量需求在数分钟或数小时内开启数据分析。当对检测时效要求比较高时，Nanopore平台具有时间优势。
附图说明
图1：多重PCR引物设计示意图。
图2：根据实施例1中的多重PCR方法扩增不同样本的DNA凝胶电泳图。
图3A至图3E：代表性的CAH相关基因突变样本PacBio测序结果图，其中图3A为CYP21A2点突变样本；图3B为CYP21A2大片段缺失样本；图3C为CYP21A2多拷贝样本；图3D为HSB3D点突变样本；图3E为CYP17A1点突变样本。
具体实施方式
实施例1：利用本发明的多重PCR方法扩增CAH相关基因突变
按照下表9制备反应体系，扩增外周血、干血斑和基因组DNA样本。
在PCR仪上，按如下表10所示条件进行预扩增：
扩增完成后，每个样本取5 ul，在1%的DNA凝胶上检测，结果如图2所示，以不同样本为模板，CAH相关的基因均能得到有效地扩增。
实施例2：利用本发明涉及的多重PCR方法构建PacBio测序文库
步骤1：多重PCR扩增
按照下表11制备反应体系，扩增不同类型CAH相关基因突变的外周血样本：
在PCR仪上，按如下表12所示条件进行预扩增：
扩增完成后，将扩增产物放入离心机中，10000rpm，离心20min。离心结束后水平静置放置，取4μL上清加入新的管内。
步骤2：构建PacBio测序文库
按照下表13制备反应体系：
在PCR仪上，按如下条件进行反应：37ºC 20 min；25ºC 15 min；65ºC 10 min。反应完成后，加入0.5 μL Exonuclease III (NEB, Cat#M0206L)和0.5 μL Exonuclease VII(NEB, Cat#M0379L)，继续在37ºC反应1小时。用0.6 x Ampure PB磁珠（PacBio, Cat#100-265-900）依照制造商的说明书纯化两次，最后用10uL Elution Buffer洗脱DNA。所得DNA洗脱液即是目标DNAPacBio测序文库。用Qubit dsDNA HS试剂 (ThermoFisher, Cat#Q32851)在Qubit 3 Fluoromter (ThermoFisher, Cat#Q33216)上测定DNA浓度。当有多个样本PacBio测序文库时，可以取等量的文库混合在一起，制备成混合文库。
步骤3：PacBio上机测序和分析
根据文库的总浓度与摩尔浓度，将适当体积的文库与结合试剂(PacBio，Cat#101-820-200)和引物（PacBio, Cat#100-970-100）反应，制备成最终可上机文库。代表性测序结果如图3所示，图3A CYP21A2点突变样本，图3B CYP21A2大片段缺失样本，图3C CYP21A2多拷贝样本，图3D HSB3D点突变样本，图3E CYP17A1点突变样本。
实施例3：CAH相关基因突变的检测和验证
从湖南家辉遗传专科医院收集14个受试者的足跟血和11个受试者的外周血基因组DNA作为验证样品25例，参照实施例2，利用本发明引物组（和试剂盒）同时检测CAH相关9个基因位点多种突变。同时用MLPA方法检测CYP21A2基因拷贝数，结合Sanger测序检测相关基因的点突变。利用本发明得到的结果和对照结果相对比，结果如表14所示，25例样本结果完全一致。
因此，利用本发明方法检测的结果，经过与MLPA结合PCR-Sanger测序方法对比，特异性和灵敏度均达到100%。而且25例样本中，有10例样本通过本发明的方法确定了大片段缺失的范围，或明确了不同突变点间的顺反式关系。
需要说明的是，虽然已通过以上实施例阐明了本发明的一些特征，但不能用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。多重PCR反应和三代测序文库构建中所涉及的反应试剂、反应条件等等可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。因此对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的构思和原则之内，还可做出若干简单替换，这些均应包含在本发明的保护范围之内。
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序列表
<110> 北京贝瑞和康生物技术有限公司
<120> 同时检测先天性肾上腺皮质增生症相关9个基因多种突变的引物组和试剂盒
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