一种液相芯片检测新型冠状病毒及其他呼吸道病毒的方法
阅读说明：本技术 一种液相芯片检测新型冠状病毒及其他呼吸道病毒的方法 (Method for detecting novel coronavirus and other respiratory viruses by liquid-phase chip ) 是由 阎岩 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于呼吸道传染病病毒检测技术领域,公开了一种液相芯片检测新型冠状病毒及其他呼吸道病毒的方法,所述基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法包括：进行Tag探针的荧光编码微球的制备；设计PCR引物、Tag探针序列和双结合探针序列,在与所述探针互补的链的PCR引物的5’端进行生物素修饰；将带有所述Tag探针的荧光编码微球及所述双结合探针偶联,得到液相芯片；采用所述PCR引物对目的基因进行扩增,得到扩增产物；将所述扩增产物与荧光报告分子及液相芯片进行杂交检测。本发明使用特异性微球探针捕获PCR产物,检测结果可靠和稳定更好,检测特异性更强,具有很高的灵活性。(The invention belongs to the technical field of respiratory infectious disease virus detection, and discloses a method for detecting novel coronavirus and other respiratory viruses by a liquid-phase chip, which comprises the following steps: preparing the fluorescent coding microspheres of the Tag probe; designing a PCR primer, a Tag probe sequence and a double-combination probe sequence, and performing biotin modification on the 5' end of the PCR primer of a strand complementary to the probe; coupling the fluorescent coding microspheres with the Tag probes and the double-combination probes to obtain a liquid-phase chip; amplifying the target gene by using the PCR primer to obtain an amplification product; and carrying out hybridization detection on the amplification product, a fluorescent reporter molecule and a liquid phase chip. The invention uses the specific microsphere probe to capture the PCR product, has reliable and stable detection result, stronger detection specificity and higher flexibility.)
技术领域
本发明属于新型冠状病毒及其他呼吸道传染病病毒检测技术领域，尤其涉及一种液相芯片检测新型冠状病毒及其他呼吸道病毒的方法。
背景技术
目前，临床病毒检测的常规方法主要有：病原体培养分离、免疫学检测和核酸PCR(或RT-PCR)检测。病原体培养分离检测方法是传统检测技术，检测结果准确可靠，但灵敏度低，检测周期长，不利于病毒感染的早期诊断；免疫学检测灵敏度和特异性强，但检测需要的材料较多，测定结果与抗体来源和亲和力有关；核酸PCR检测法是目前灵敏度较高的检测方法，检出率高于病原分离法，但当PCR的靶序列发生突变时，容易造成假阴性结果。对于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的PCR检测发现，当病毒拷贝数低时常出现假阴性，流行早期科学家进行了一些了方法学摸索。其他的一些呼吸道病毒也存在保存要求高，有些需要培养后再定性。
MASA液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array)技术是1990年代后期发展起来的一种新型芯片技术。该技术将流量检测技术与芯片技术有机结合，具有高灵敏度、高异质性、高通量、操作简单等特点。液相芯片系统由许多大小均匀的圆形微球组成。不同的探针分子固定在每种类型的微球上。不同类型的微球条带用不同的荧光染料编码，分子杂交在悬浮液中进行。在检测过程中，目标分子可以与偶联微球的探针特异性结合，从而使交联探针的微球携带报告分子藻红蛋白。使用流式点阵仪(NovaHT)检测微球时，仪器上的红色和绿色激光分别检测单个微球上的编码荧光和报告藻红蛋白，检测结果直接由荧光值解释。由于液相芯片具有准确度高、灵活性好、操作简单、通量大等特点，已广泛应用于细胞因子的检测、激酶的检测、抗原决定簇的筛选、疾病病原体，以及与各种抗原抗体反应相关的试验。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有呼吸道传染病病毒的检测方法，检测通量较低，检测不太准确，且灵敏度不足。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种液相芯片检测新型冠状病毒及其他呼吸道病毒的方法。
本发明是这样实现的，一种液相芯片检测新型冠状病毒及其他呼吸道病毒的方法，所述液相芯片检测新型冠状病毒及其他呼吸道病毒的方法包括以下步骤：
步骤一，进行Tag探针的荧光编码微球的制备；设计PCR引物、Tag探针序列和双结合探针序列，在与所述探针互补的链的PCR引物的5’端进行生物素修饰；其中，所述PCR引物用于扩增八种目的基因片段，所述Tag探针为5’末端进行了Aminolinker C12修饰的针对八种目的基因设计的用于标识荧光微球的探针，所述双结合探针序列用于与采用所述PCR引物扩增目的基因片段的扩增产物及Tag荧光微球进行特异性杂交；
步骤二，将带有步骤一所述Tag探针的荧光编码微球及步骤一中所述双结合探针偶联，得到液相芯片：将待偶联的所述Tag探针的荧光编码微球加入到偶联反应罐中；打开所述偶联反应罐的搅拌装置，搅动使所述Tag探针的荧光编码微球旋转，将所述双结合探针直接喷洒在所述Tag探针的荧光编码微球上，得混合物；控制所述偶联反应罐搅拌装置的旋转速度，使所述混合物的温度达到130，继续加快搅拌装置的旋转速度，待偶联反应12～20min后，即可得到液相芯片；
步骤三，采用步骤一中所述PCR引物对目的基因进行扩增，得到扩增产物：将所述PCR引物对目的基因待扩增产物片段化，得到片段化产物；将所述片段化产物进行末端修复，得到末端修复产物；将所述末端修复产物进行3'端加A，得到3'端加A产物；将所述3'端加A产物进行加接头，得到加接头产物；以及将所述加接头产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤四，将步骤三得到的所述扩增产物与荧光报告分子及步骤二得到的液相芯片进行杂交检测：取混合的Tag荧光微球分散于检测缓冲液中，得杂交反应体系；取步骤三得到的所述PCR扩增产物、荧光报告分子以及步骤二得到的液相芯片，混匀于杂交反应体系中，将用于盛放反应体系的容器口封闭后置于59℃环境中，孵育15～20min；孵育后，再加入3～55μL的SA-PE再次对容器口封闭，于59℃条件下孵育5～10min后放置于NovaHT加样盘中上机检测，通过液相芯片检测仪读出检测结果。
进一步，步骤一中，所述Tag探针的荧光编码微球的制备，包括：
将荧光编码的微球与0.1M，pH值4.5的2-(N-吗琳代)乙磺酸溶液，混匀，得到偶联体系；在偶联体系中加入Tag探针和二氯乙烷，避光反应，即可得到Tag荧光编码微球。
进一步，步骤二中，所述偶联反应罐搅拌装置的旋转速度为4500～5500r/min。
进一步，步骤三中，所述扩增反应是等温扩增。
进一步，步骤三中，所述引物为具有随机核苷酸的核苷酸序列。
进一步，步骤四中，所述检测缓冲液按体积份计，由31份氯化四甲铵缓冲液，10份TE溶液，以及4份10％(w/v)PEG8000水溶液组成。
进一步，所述氯化四甲铵缓冲液的配制组分比例及配制方法如下：
将体积份为225份的5mol/L氯化四甲铵水溶液，体积份为1.88份20％(w/v)十二烷基肌氨酸钠双蒸水溶液，体积份为18.75份的pH 8.0、1mol/L Tris-HCl溶液，体积份为3.0份的0.5mol/L EDTA溶液，及体积份为1.37份的双蒸水，于68℃水浴混合溶解，室温保存。
进一步，所述TE溶液的配制组分比例及配制方法如下：
将体积份为1份pH 8.0、1mol/L Tris-HCl溶液，体积份为0.2份pH 8.0、0.5mol/LEDTA溶液，及体积份为100份的双蒸水混合而成。
进一步，步骤四中，所述杂交反应体系中，所述Tag荧光微球与所述双结合探针的分子比例为1：(1～1.5)。
进一步，步骤四中，所述杂交反应在避光条件下进行。
进一步，所述液相芯片检测仪对荧光图像处理的具体过程为：
对荧光图像进行去噪增强、平滑和复原处理；预处理完成后，对荧光图像进行分割，并提取荧光图像中的特征；
根据提取的荧光图像特征进行图像匹配和识别。
进一步，所述荧光图像进行去噪增强的具体过程为：
在含有噪声的荧光图像中确定以某一个像素为中心点的方形邻域，
将邻域中各像素的灰度值排序，取其中间值作为中心像素灰度的新值；同时在含有噪声的荧光图像中移动方形邻域，利用中值滤波可以对图像进行平滑处理。
进一步，所述荧光图像特征提取的具体过程为：
搜索所有尺度上的荧光图像位置，通过高斯微分函数来识别潜在的对于尺度和旋转不变的候选关键点；
在每个候选的位置上，通过一个拟合精细的模型来确定位置和尺度；
基于图像局部的梯度方向，分配给每个关键点位置一个或多个方向；并对关键点的方向、尺度和位置进行变换；
在每个关键点周围的邻域内，在选定的尺度上测量图像局部的梯度；对测量得到的图像局部梯度变换成一种向量表示。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法，将多重PCR技术与流式点阵(NovaHT)技术相结合，使用设计出的引物组进行多重PCR得到目标扩增产物，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交，通过流式点阵仪读取MFI值，以区分不同类型的病毒。该方法具有快速、高效、特异性强、灵敏度高、重复性好的有益效果，可用于实验小鼠的质量监测、流行病学调查和预警。与传统的检测方法相比，本发明的方法实现了对同一样品中多种不同目标分子的同时检测，实现了高通量检测，并可根据病原体的增加灵活增加检测项目；同时，样品体积小，操作简单，检测效率高，可大大降低检测成本。
本发明使用特异性微球探针捕获PCR产物比传统的用PCR产物片段长度判断结果的多重检测方法更好，检测特异性更强。流式点阵分析仪(NovaHT)采用生物素-亲和素系统对信号进行放大，其亲和力高达1015L/mol，比单纯抗体高104倍以上，使检测结果更加灵敏，受环境干扰小，性能稳定；本发明方法的检测灵敏度比普通PCR高1-2个数量级。流格仪利用微球在溶液中反应，克服了大分子检测过程中表面张力和位阻效应对膜片反应动力学的影响，大大提高了样品检测的重复性，检测结果可靠和稳定。检测的重复性往往可以达到90％以上，线性范围也很宽。本发明具有很高的灵活性，可以根据需要在此基础上增加或减少病毒的种类。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的液相芯片检测新型冠状病毒及其他呼吸道病毒的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的进行Tag探针的荧光编码微球的制备方法流程图。
图3是本发明实施例提供的带有Tag探针的荧光编码微球及双结合探针偶联，得到液相芯片的方法流程图。
图4是本发明实施例提供的采用PCR引物对目的基因进行扩增，得到扩增产物的方法流程图。
图5是本发明实施例提供的扩增产物与荧光报告分子及液相芯片进行杂交检测的方法流程图。
图6是本发明实施例提供的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于液相芯片检测新型冠状病毒及其他呼吸道传染病病毒的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的基于液相芯片检测新型冠状病毒及其他呼吸道传染病病毒的方法包括以下步骤：
S101，进行Tag探针的荧光编码微球的制备；设计PCR引物、Tag探针序列和双结合探针序列，在与所述探针互补的链的PCR引物的5’端进行生物素修饰；
S102，将带有S101所述Tag探针的荧光编码微球及S101中所述双结合探针偶联，得到液相芯片；
S103，采用S101中所述PCR引物对目的基因进行扩增，得到扩增产物；
S104，将S103得到的所述扩增产物与荧光报告分子及S102得到的液相芯片进行杂交检测。
本发明实施例提供的步骤S101中，所述PCR引物用于扩增八种目的基因片段，所述Tag探针为5’末端进行了Aminolinker C12修饰的针对八种目的基因设计的用于标识荧光微球的探针，所述双结合探针序列用于与采用所述PCR引物扩增目的基因片段的扩增产物及Tag荧光微球进行特异性杂交。
如图2所示，本发明实施例提供的步骤S101中，所述Tag探针的荧光编码微球的制备，包括：
S201，将荧光编码的微球与0.1M，pH值4.5的2-(N-吗琳代)乙磺酸溶液，混匀，得到偶联体系；
S202，在偶联体系中加入Tag探针和二氯乙烷，避光反应，即可得到Tag荧光编码微球。
如图3所示，本发明实施例提供的步骤S102中，所述将带有S101所述Tag探针的荧光编码微球及S101中所述双结合探针偶联，得到液相芯片，包括：
S301，将待偶联的所述Tag探针的荧光编码微球加入到偶联反应罐中；
S302，打开所述偶联反应罐的搅拌装置，搅动使所述Tag探针的荧光编码微球旋转，将所述双结合探针直接喷洒在所述Tag探针的荧光编码微球上，得混合物；
S303，控制所述偶联反应罐搅拌装置的旋转速度，使所述混合物的温度达到130℃，继续加快搅拌装置的旋转速度，待偶联反应12～20min后，即可得到液相芯片。
本发明实施例提供的偶联反应罐搅拌装置的旋转速度为4500～5500r/min。
如图4所示，本发明实施例提供的步骤S103中，所述采用S101中所述PCR引物对目的基因进行扩增，得到扩增产物，包括：
S401，将所述PCR引物对目的基因待扩增产物片段化，得到片段化产物；
S402，将所述片段化产物进行末端修复，得到末端修复产物；将所述末端修复产物进行3'端加A，得到3'端加A产物；
S403，将所述3'端加A产物进行加接头，得到加接头产物；以及将所述加接头产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
本发明实施例提供的扩增反应是等温扩增。
本发明实施例提供的引物为具有随机核苷酸的核苷酸序列。
如图5所示，本发明实施例提供的步骤S104中，所述将S103得到的所述扩增产物与荧光报告分子及S102得到的液相芯片进行杂交检测，包括：
S501，取混合的Tag荧光微球分散于检测缓冲液中，得杂交反应体系；
S502，取S103得到的所述PCR扩增产物、荧光报告分子以及S102得到的液相芯片，混匀于杂交反应体系中，将用于盛放反应体系的容器口封闭后置于59℃环境中，孵育15～20min；
S503，孵育后，再加入3～55μL的SA-PE再次对容器口封闭，于59℃条件下孵育5～10min后放置于NovaHT加样盘中上机检测，通过液相芯片检测仪读出检测结果。
本发明实施例提供的液相芯片检测仪对荧光图像处理的具体过程为：
对荧光图像进行去噪增强、平滑和复原处理；预处理完成后，对荧光图像进行分割，并提取荧光图像中的特征；
根据提取的荧光图像特征进行图像匹配和识别。
本发明实施例提供的荧光图像进行去噪增强的具体过程为：
在含有噪声的荧光图像中确定以某一个像素为中心点的方形邻域，
将邻域中各像素的灰度值排序，取其中间值作为中心像素灰度的新值；同时在含有噪声的荧光图像中移动方形邻域，利用中值滤波可以对图像进行平滑处理。
本发明实施例提供的荧光图像特征提取的具体过程为：
搜索所有尺度上的荧光图像位置，通过高斯微分函数来识别潜在的对于尺度和旋转不变的候选关键点；
在每个候选的位置上，通过一个拟合精细的模型来确定位置和尺度；
基于图像局部的梯度方向，分配给每个关键点位置一个或多个方向；并对关键点的方向、尺度和位置进行变换；
在每个关键点周围的邻域内，在选定的尺度上测量图像局部的梯度；对测量得到的图像局部梯度变换成一种向量表示。
下面结合实验对本发明的技术方案作详细的描述。
本发明实施例提供的检测缓冲液按体积份计，由31份氯化四甲铵缓冲液，10份TE溶液，以及4份10％(w/v)PEG8000水溶液组成。
本发明实施例提供的氯化四甲铵缓冲液的配制组分比例及配制方法如下：
将体积份为225份的5mol/L氯化四甲铵水溶液，体积份为1.88份20％(w/v)十二烷基肌氨酸钠双蒸水溶液，体积份为18.75份的pH 8.0、1mol/L Tris-HCl溶液，体积份为3.0份的0.5mol/L EDTA溶液，及体积份为1.37份的双蒸水，于68℃水浴混合溶解，室温保存。
本发明实施例提供的TE溶液的配制组分比例及配制方法如下：
将体积份为1份pH 8.0、1mol/L Tris-HCl溶液，体积份为0.2份pH 8.0、0.5mol/LEDTA溶液，及体积份为100份的双蒸水混合而成。
本发明实施例提供的杂交反应体系中，所述Tag荧光微球与所述双结合探针的分子比例为1：(1～1.5)。
本发明实施例提供的杂交反应在避光条件下进行。
本发明实施例提供的基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法的PCR循环条件见表1，具体检测结果见表2。
表1 PCR循环条件
表2检测结果
注：副流感病毒1型(PIV1)，副流感病毒2型(PIV2)，副流感病毒1型(PIV3)，新型冠状病毒(2019-nCoV的N基因和Rd基因)，甲型流行感冒病毒(INFA)，乙型流行感冒病毒(INFB)和GAPDH为人源内参基因。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。