阅读说明：本技术 一种致病性霍乱弧菌的快速检测方法 (Rapid detection method of pathogenic vibrio cholerae ) 是由 卢瑛 方微微 蔡杨杨 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种致病性霍乱弧菌的快速检测方法。本发明首先提供了一种检测致病性霍乱弧菌的引物和探针。所述引物和探针具有高灵敏性和特异性。本发明还提供一种致病性霍乱弧菌的快速检测方法,采用特异性引物和探针,利用重组酶介导等温核酸扩增结合侧向层析技术,实现了致病性霍乱弧菌的快速、灵敏、特异性检测,且操作简便、耗时短,解决了传统检测技术耗时长、步骤繁琐等问题。本发明技术不需要特殊的仪器设备,降低了检测成本,扩大了该技术的应用范围,可应用于野外现场等特殊环境,对霍乱弧菌的早期检测与诊断具有重大意义。(The invention provides a method for quickly detecting pathogenic vibrio cholerae. The invention firstly provides a primer and a probe for detecting pathogenic vibrio cholerae. The primers and probes have high sensitivity and specificity. The invention also provides a method for rapidly detecting pathogenic vibrio cholerae, which adopts specific primers and probes and utilizes recombinase-mediated isothermal nucleic acid amplification combined with a lateral chromatography technology to realize rapid, sensitive and specific detection of the pathogenic vibrio cholerae, has simple and convenient operation and short time consumption, and solves the problems of long time consumption, complicated steps and the like of the traditional detection technology. The technology of the invention does not need special instruments and equipment, reduces the detection cost, enlarges the application range of the technology, can be applied to special environments such as field sites and the like, and has great significance for the early detection and diagnosis of vibrio cholerae.)

一种致病性霍乱弧菌的快速检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种致病性霍乱弧菌的快速检测方法。

背景技术

霍乱弧菌属于弧菌科，革兰氏阴性菌。O1和O139是霍乱弧菌两个最主要的致病血清型，同霍乱的大规模暴发流行密切相关，其主要的毒力因子包括ctxAB基因编码的霍乱毒素(CT)和tcpA基因编码的毒力协同调节菌毛(TCP)。人们通过摄入受霍乱弧菌污染的水或食物而被感染，导致患急性水样腹泻病。尽管现在水质、卫生以及霍乱临床治疗已经有所改善，但该疾病每年仍然会导致全球约10万人死亡。一项分析表明，在霍乱流行国家，每年约有2900万例病例和95000例死亡病例发生，其中非洲分别占60％和68％，几乎所有死亡事件都发生在发展中国家有关。

霍乱弧菌检测已经公开的专利技术有多重荧光PCR检测试剂盒(CN 105603091B)，针对霍乱弧菌溶血素基因设计PCR引物，检测限为10³copy/ml，特异性高，但存在需要专用仪器设备、专业人员，耗时长等问题。环介导等温扩增结合侧向层析技术(CN 106957917A)，实现了10⁰拷贝的霍乱弧菌目的基因的检测，该技术特异性和灵敏度高，但引物设计和筛选较复杂。胶体金法检测试剂盒(CN 106290842 A)，采用以胶体金为标记物的试纸条实现了霍乱弧菌O139血清型的特异性检测，但是灵敏度较低，以定性和半定量为主。

我国出入境行业标准采用微生物学方法进行鉴定、检测，通过增菌、分离培养、生化反应、溶血试验等进行分离鉴定。该方法检验周期长，步骤繁琐，不能满足快速检测要求。因此，研究简便、快速的霍乱弧菌检测方法非常有必要，第一时间检测到致病菌，能及时采取措施来去除和减少以降低消费者食用被霍乱弧菌污染产品的风险，为最前线的食品安全提供坚固的保障，同时为检测部门提供技术支撑。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种致病性霍乱弧菌的快速检测方法，采用重组酶介导等温核酸扩增结合侧向层析技术实现快速检测致病性霍乱弧菌，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种检测致病性霍乱弧菌的引物，所述引物序列信息如下：

正向引物F-RAA：5′-AGTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGACAGAG-3′；

反向引物R-RAA：5′-TGGAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAA-3′；

其中反向引物R的5′端进行生物素Biotin标记。

本发明还提供一种检测致病性霍乱弧菌的探针，所述探针序列信息如下：

探针P：5′-GTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGACAGAGGAGACTTTGACCGAGGTA-3′

探针P的5′端起第30位碱基标记FITC发光基团，第30位碱基后***四氢呋喃(tetrahydrofuran,THF)作为脱碱基位点，其后***荧光猝灭基团BHQ，探针P的3′端进行C3-Spacer标记。修饰后的探针信息如下：

探针P：5′-GTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGACAGAG(FITC-dt)G(THF)AG(BHQ-dt)ACTTTGACCGAGGTA(C3-spacer)-3′。

所述的引物和探针用于检测致病性霍乱弧菌。

本发明还提供一种致病性霍乱弧菌的快速检测方法，具体包括以下步骤：

a.RAA扩增

准备好待检测的DNA溶液，按照市售RAA试剂盒(试纸条法)配制反应体系，反应体系中包含所述检测致病性霍乱弧菌的引物和探针，将上述配制好的基础反应单元在39-42℃下扩增反应25-30分钟。RAA试剂盒优先选用江苏奇天基因生物科技有限公司生产的试剂盒，型号为T00001A。

b.利用侧向层析试纸条，检测RAA扩增产物

取8-10μL核酸扩增产物加入到缓冲液中与3-5μL磁珠-链霉亲和素偶联物及与核酸扩增产物等体积的抗FITC兔抗混匀，后滴加到侧向层析试纸条样品垫区域。

优选地，步骤(b)所述抗FITC兔抗浓度为0.02-0.04mg/L。

优选地，所述侧向层析试纸条包括从加样端开始依次排列的样品垫、结合垫、NC膜、背板和标记垫，所述NC膜上包被有T线和C线，T线包被有可以和抗FITC抗体结合的羊抗兔二抗，C线包被有和磁珠-链霉亲和素结合的生物素-BSA，T线和C线构成判读区。

优选地，磁珠-链霉亲和素偶联物的制备方法包括以下步骤：

(1)活化磁珠：在离心管中用MEST缓冲液洗涤磁珠2-5次，再向离心管中加入活化剂，混合均匀后，旋转反应25-35min；

(2)偶联抗体：磁珠活化完成后，用MEST缓冲液洗涤磁珠1-3次，再用BST缓冲液洗涤磁珠，洗涤完成后依次加入链霉亲和素和BST缓冲液，混合均匀后，旋转反应2-4h，偶联完成后，置于磁力架4-6min，去上清液，得到偶联抗体后的磁珠；

(3)封闭免疫磁珠：将偶联抗体后的磁珠用BST缓冲液洗涤，洗涤完成后加入封闭液，充分混匀，反应25-35min；

(4)保存：将封闭后的免疫磁珠用BST缓冲液洗涤，得到磁珠-链霉亲和素偶联物，保存在保存液中，3-5℃保存备用。

优选地，所述活化剂包括下述重量百分比的组分：97％的MEST缓冲液、1％l0.5 g/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2％0.25g/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

优选地，步骤(1)中所述磁珠和活化剂的固液比为1mg：(15-20)μL。

优选地，步骤(1)或(2)中所述MEST缓冲液洗涤磁珠包括以下步骤：将磁珠和MEST缓冲液按固液比为1mg：(400-600)μL混合均匀，放入磁力架静置，待磁珠完全被吸附于离心管壁且溶液澄清时，弃上清，即为洗涤一次。

优选地，步骤(2)中所述链霉亲和素和BST缓冲液的体积比为(1-5)：(1-5)，所述磁珠和链霉亲和素与BST缓冲液总体积的固液比为1：(400-600)μL。

优选地，所述封闭液为将BSA溶于BST缓冲液，即得，其中BSA的质量分数为0.8-1.2％。

所述磁珠和封闭液的固液比为1mg：(400-600)μL。

所述磁珠和保存液的固液比为1mg：(400-600)μL。

优选地，所述保存液为将NaN₃和BSA溶于BST缓冲液，即得，其中NaN₃和BSA的质量分数均为0.8-1.2％。

所述磁珠直径为150-200nm。

本发明还提供一种用于检测致病性霍乱弧菌的侧向层析试纸条，包括从加样端开始依次排列的样品垫、结合垫、NC膜、背板和标记垫，所述NC膜上包被有T线和C线，T线包被有可以和抗FITC抗体结合的羊抗兔二抗，C线包被有和磁珠-链霉亲和素结合的生物素-BSA，T线和C线构成判读区。

本发明还提供一种用于快速检测致病性霍乱弧菌的试剂盒，包括所述的检测致病性霍乱弧菌引物和探针。

下面对本发明的技术方案作进一步的解释和说明：重组酶介导等温核酸扩增试剂盒能够在39-42℃下将霍乱弧菌的DNA进行扩增，在扩增的同时，由于反向引物和探针分别标记有生物素基团和FITC基团，因此在DNA扩增产物上同时含有生物素基团和FITC基团，产物结构示意图见图2。上述扩增产物与抗FITC兔抗和磁珠-链霉亲和素偶联物孵育，充分反应后，产物上的生物素基团与FITC基团会分别与抗FITC兔抗和磁珠-链霉亲和素偶联物结合形成核酸抗体复合物，滴加在侧向层析试纸条的样品垫上，在层析作用下，核酸抗体复合物在硝酸纤维素膜上层析，经过检测线时该复合物由于带有抗FITC兔抗，因此能够和检测线上的羊抗兔二抗结合，由于该复合物携带有有色的标记物(磁性纳米颗粒呈褐色)，此时检测线呈现褐色；当核酸抗体复合物或者单独的标记链霉亲和素的磁珠经过质控线时，由于质控线上含有能够结合链霉亲和素的生物素，所以只要有标记的链霉亲和素的磁珠层析至质控线，无论该抗体是否结合有标记的核酸，均能够形成复合物，该复合物由于携带有有色的标记物(磁性纳米颗粒呈褐色)，此时质控线呈现褐色。本发明的有益技术效果：

本发明提供了一种致病性霍乱弧菌的快速检测方法，该方法采用重组酶介导等温核酸扩增结合侧向层析技术检测霍乱弧菌，与PCR试剂盒相比，大大缩短了检测时间，可在1h内完成检测，不需要专用仪器设备，成本较低。该技术采用的侧向层析技术以磁性纳米微球作为标记物，通过设计霍乱弧菌ctxA基因的RAA引物和探针解决了特异性问题，利用磁性纳米材料的三维磁信号获取在快速定性的同时实现了准确定量，通过单纯的肉眼观察可检测10²CFU/mL霍乱弧菌，大大低于目前行业标准的10⁸-10³CFU/mL致病范围(SN/T 1022-2010)，且检测信号很稳定。综上所述，本发明技术实现了致病性霍乱弧菌的快速、灵敏、特异性快速检测，弥补了现有传统检测技术的不足，不需要特殊的仪器设备，降低了检测成本，扩大了该技术的应用范围，可应用于野外现场等特殊环境，操作简单、时间短，提升了病原菌的检测技术水平。

附图说明

图1为侧向层析试纸条结构示意图；

图2为重组酶介导等温核酸扩增(RAA)产物结构示意图；

图3为灵敏度检测图(DNA浓度表示)，其中：N为阴性对照，以双蒸水替代DNA模板；其他分别为不同浓度的霍乱弧菌DNA，反应体系中DNA含量分别为40fg/μL，400fg/μL，4pg/μL,40pg/μL，400pg/μL，4ng/μL，40ng/μL；

图4为灵敏度检测图(菌液浓度表示)，分别为10⁹CFU/mL，10⁸CFU/mL，10⁷CFU/mL，10⁶CFU/mL，10⁵CFU/mL，10⁴CFU/mL，10³CFU/mL，10²CFU/mL，10¹CFU/mL；

图5为特异性检测结果图，分别为：1-VPF，2-VPF54，3-VP1201，4-VP1203，5-VP1204，6-VP1205，7-VP1206，8-VP6，9-VCMY45，10-VCMY5311-沙门氏菌，12-肺炎克雷伯菌，13-哈维ATCC33842，14-大肠杆菌，15-VC13Y3，16-金黄色葡萄球菌，17-单增李斯特菌，18-产酸克雷伯菌，19-ATCC33847，20-哈维ATCCBA1117，21-ATCC17802，22-VP1215，23-VP1209，24-VP1207，25-霍乱LK，26-阳性对照。

具体实施方式

本发明在对霍乱弧菌的毒力基因ctxA进行充分分析的基础上，设计了高灵敏性和特异性的引物和探针，并结合重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase AidedAmplification RAA)与横向流动试纸条(Lateral flow dipstick)技术来检测致病性霍乱弧菌。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：引物和探针的设计及优化

步骤(1)根据霍乱弧菌编码主要毒力基因ctxA进行引物与探针设计：

设计6组引物对进行最佳引物筛选，引物组及序列如下：

第1组:

正向引物F1-RAA：5′-GGTCTTATGCCAAGAGGACAGAGTGAGTAC-3′

反向引物R1-RAA：5′-AAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAATC-3′

第2组:

正向引物F2-RAA：TCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGACAGAGT

反向引物R2-RAA：GGAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAA

第3组:

正向引物F3-RAA：5′-GGTCTTATGCCAAGAGGACAGAGTGAGTAC-3′

反向引物R3-RAA：5′-GGAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAA-3′

第4组：

正向引物F4-RAA：5′-AGTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGACAGAG-3′

反向引物R4-RAA：5′-TGGAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAA-3′

第5组：

正向引物F5-RAA：5′-ACCTCCTGATGAAATAAAGCAGTCAGGTGGTC-3′

反向引物R5-RAA：5′-GGAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAATC-3′

第6组：

正向引物F6-RAA：5′-AGTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGACAGAGTG-3′

反向引物R6-RAA：5′-TGGAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAATC-3′

探针设计：以ctxA基因序列为模板设计探针，探针的序列信息如下：

探针P：

5′-GTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGACAGAGGAGACTTTGACCGAGGTA-3′。

探针P的5′端起第30位碱基标记FITC发光基团，第30位碱基后***四氢呋喃(tetrahydrofuran,THF)作为脱碱基位点，其后***荧光猝灭基团BHQ，探针P的3′端进行C3-Spacer标记。修饰后探针信息如下：

探针P：5′-GTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGACAGAG(FITC-dT)G(THF)AG(BHQ-dt)ACTTTGACCGAGGTA(C3-spacer)-3′。

步骤(2)引物筛选：采用RAA核酸扩增(荧光法)，分别对设计的6组引物对进行配制反应体系。将反应管放入荧光基因检测仪在39℃反应20min，并实时观察结果。实验结果表明，相同反应条件，第4组引物的扩增效率优于其他5组引物，因此将第4组引物作为优选，并对反向引物R4-RAA的5′端进行生物素Biotin标记。RAA引物的序列如下：

正向引物F-RAA：5′-AGTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGACAGAG-3′

反向引物R-RAA：5′-biotin-TGGAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAA-3′

实施例2：致病性霍乱弧菌的检测

一种致病性霍乱弧菌的快速检测方法，采用重组酶介导等温扩增(荧光法)，包括以下步骤：

S1.制备侧向层析试纸条：侧向层析试纸条包括从加样端开始依次排列的样品垫、结合垫、NC膜、背板和标记垫。所述NC膜上包被有T线和C线，T线包被有可以和抗FITC抗体结合的羊抗兔二抗，C线包被有和磁珠-链霉亲和素结合的生物素-BSA，T线和C线构成判读区。具体结构见图1。

S2.制备免疫磁珠，具体包括以下步骤：

(1)活化磁珠：取1mg磁珠(直径180nm)，在离心管中用500μLMEST缓冲液洗涤磁珠3次，再向离心管中加入18μL活化剂，混合均匀后，放置于垂直混合仪上，在室温旋转反应30min；

(2)偶联抗体：磁珠活化完成后，用500μLMEST缓冲液洗涤磁珠2次，以清除剩余活化剂，用500μLBST缓冲液洗涤磁珠2次，加入链霉亲和素后加入BST缓冲液，混合均匀后，放置于垂直混合仪上，室温旋转反应3h，偶联完成后，将其置于磁力架5min，去上清液，得到偶联抗体后的磁珠；

(3)封闭免疫磁珠：将偶联抗体后的磁珠用500μLBST缓冲液洗涤2次，加入500μL封闭液(将BSA溶于BST缓冲液，即得，其中BSA的质量分数为1％)，在漩涡混匀器上充分混匀，置于垂直混合仪上，室温反应30min；

(4)保存：将封闭后的免疫磁珠用500μLBST缓冲液洗涤3次，将免疫磁珠保存在500μL保存液(将NaN₃和BSA溶于BST缓冲液，即得，其中NaN₃和BSA的质量分数均为1％)中，4℃保存备用，得到磁珠-链霉亲和素偶联物。

S3.检测样品的制备及检测，具体包括以下步骤：

a.RAA扩增

准备好待检测的DNA溶液，按照市售RAA试剂盒(试纸条法)配制反应体系，反应体系中包含所述检测致病性霍乱弧菌的引物和探针，RAA试剂盒具体采用江苏奇天基因生物科技有限公司生产的试剂盒，型号为T00001A。将上述配制好的基础反应单元在39℃扩增反应30分钟。

b.利用侧向层析试纸条，检测RAA扩增产物

取10μL核酸扩增产物加入到缓冲液中与3μL磁珠-链霉亲和素偶联物及与核酸扩增产物等体积的抗FITC兔抗混匀，后滴加到试纸条样品垫区域。通过试纸条判断扩增结果。试纸条的检测线和控制线都呈褐色，说明结果阳性；只有控制线呈现褐色，检测线位置无颜色，说明结果阴性；控制线未显色，结果无效。

步骤b所述抗FITC兔抗浓度为0.03mg/L。

步骤(1)或(2)中所述MEST缓冲液洗涤磁珠包括以下步骤：将磁珠和MEST缓冲液混合均匀，放入磁力架静置，待磁珠完全被吸附于离心管壁且溶液澄清时，弃上清，即为洗涤一次。

步骤(2)中所述链霉亲和素和BST缓冲液的体积比为1：5，所述链霉亲和素和BST缓冲液总体积为500μL。

所述活化剂包括下述重量百分比的组分：97％的MEST缓冲液、1％l0.5 g/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2％0.25g/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

检测灵敏度

设置不同浓度的霍乱弧菌DNA(DNA浓度为40ng/μL、4ng/μL、400pg/μL、40pg/μL、4pg/μL、400fg/μL、40fg/μL)及以不同浓度菌液(分别为10⁹CFU/mL，10⁸CFU/mL，10⁷CFU/mL，10⁶CFU/mL，10⁵CFU/mL，10⁴CFU/mL，10³CFU/mL，10²CFU/mL，10¹CFU/mL)提取的DNA作为模板按照前述加样方法进行RAA核酸扩增，扩增产物用LFD进行检测：结果见图3和图4。

结果表明，RAA扩增后，LFD最低可检测到40pg DNA及10²CFU/mL菌液提取的DNA为模板得到的核酸扩增产物，上述结果表明本发明的引物组能够保证检测时的灵敏性。

检测特异性

选择多株副溶血性弧菌、哈维氏弧菌、不含ctxA基因的霍乱弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌等作为特异性判定实验菌株。按照前述加样方法，各种实验菌的DNA模板量为40ng。核酸扩增产物用LFD进行检测。

结果如图5，只有DNA模板为含ctxA的霍乱弧菌阳性组的检测线和控制线都显示条带，而其它组的检测线空白，只有控制线处出现了条带。结果表明，此方法可以实现对致病性霍乱弧菌的特异性检测，不与其他相关致病菌发生交叉反应。

综上，本发明所提供的一种致病性霍乱弧菌的快速检测方法，即RAA-LFD检测方法具有如下优点：

一、高灵敏度，对致病性霍乱弧菌的检测最低线可至40pg/μL，其检测灵敏度比传统的琼脂糖凝胶电泳检测核酸扩增产物的灵敏度高1000倍。

二、强特异性，与其他食源性致病菌无交叉反应，检测特异性强。

三、检测时间较短，1h以内可获得检测结果，与常规检测方法相比具有相当大的优势。

四、仪器设备要求低，不需要温度循环器、PCR仪、电泳仪或凝胶成像系统，只需一个恒温加热器即可完成检测，甚至可以进行利用体温进行人工加热。

五、操作简便、结果呈现明显，整个检测过程不涉及复杂昂贵仪器和设备，样品前处理简单，无需进行DNA纯化，只需加无菌双蒸水进行裂解，稍具有分子生物学基础的人员即可完成整个操作；检测结果清晰明显，直接通过肉眼观察即可判别。

六、对实验人员和环境更安全，检测过程不需要进行凝胶电泳故不使用EB等有毒试剂。本方法具有比现有传统技术PCR检测等具有较强仪器依赖性的分子生物学检测方法，致病性霍乱弧菌的方法更高的特异性、灵敏度、实用性及便捷性，可以在实际野外现场应用，有利防止和控制霍乱弧菌疫情的发生，提前做好预防。运用本方法对致病性菌霍乱弧菌的现场检测，可以在及时阻止致病菌危害食品及人体健康，保障食品安全，建立更加完备的食品***体系。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> 一种致病性霍乱弧菌的快速检测方法

<141> 2019-10-29

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agtcaggtgg tcttatgcca agaggacaga g 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tggaaacata tccatcatcg tgcctaacaa a 31

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtcaggtggt cttatgccaa gaggacagag gagactttga ccgaggta 48