阅读说明：本技术 一种基于Cas9切口酶偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方法及试剂盒 (Cas9 nickase-coupled DNA polymerase-based constant-temperature nucleic acid detection and analysis method and kit ) 是由 叶邦策 尹斌成 王婷 于 2019-02-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于Cas9切口酶偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方法,是在恒温条件下特异性检测靶标核酸；包括以下步骤：以两条分别与靶DNA序列互补的sgRNA序列,两组Cas9n-sgRNA复合物分别与前间区序列邻近基序毗邻的匹配靶DNA序列结合后,通过Cas9n单口切割酶活性和恒温DNA聚合酶链置换活性,获得一条单链靶DNA序列,该序列在引物1和引物2,DNA聚合酶及Cas9n-sgRNA复合物的共同作用下,在恒温条件下反复进行引物杂交,延伸,切割,链置换反应,扩增获得大量靶DNA序列,荧光染料与双链DNA产物结合产生荧光信号,实时测定反应体系中的荧光信号强度,与标准工作曲线对比,计算出靶标基因组或DNA序列的浓度。本发明尤其适用于核酸即时检测。(The invention discloses a constant-temperature nucleic acid detection and analysis method based on Cas9 nickase coupled DNA polymerase, which is used for specifically detecting target nucleic acid under the constant-temperature condition; the method comprises the following steps: after two sgRNA sequences which are respectively complementary with a target DNA sequence and two groups of Cas9n-sgRNA compounds are respectively combined with a matched target DNA sequence adjacent to a motif adjacent to a front interval sequence, a single-stranded target DNA sequence is obtained through Cas9n single-port cleavage enzyme activity and constant-temperature DNA polymerase chain displacement activity, under the combined action of a primer 1, a primer 2, DNA polymerase and a Cas9n-sgRNA compound, primer hybridization, extension, cutting and chain displacement reaction are repeatedly carried out under constant-temperature conditions, a large number of target DNA sequences are obtained through amplification, fluorescent dye is combined with a double-stranded DNA product to generate a fluorescent signal, the intensity of the fluorescent signal in a reaction system is measured in real time, and the fluorescent dye is compared with a standard working curve to calculate the concentration of a target genome or the DNA sequence. The invention is particularly suitable for the real-time detection of nucleic acids.)

一种基于Cas9切口酶偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方 法及试剂盒

技术领域

本发明属于核酸恒温扩增技术领域，具体涉及一种基于Cas9切口酶介导的定量核酸检测方法及试剂盒，适合对基因组或双链DNA的恒温定量检测。

背景技术

核酸扩增反应不仅在分子生物学和医学，而且在法医学、流行病学和古生物学中都是一种非常重要而有价值的技术。其中应用最为广泛的是聚合酶链式反应(PCR)，一类核酸体外扩增技术，几乎应用于所有的生物及临床诊断实验室。然而PCR方法需要依赖控温精确的热循环仪，使得以PCR为基础的核酸扩增检测技术不适用于现场快速检测或是偏远、贫穷、没有相关仪器的环境进行检测。核酸等温扩增技术由于不需要温度变化操作，摆脱了对热循环仪器的依赖，在临床和现场快速诊断中展示了良好的应用前景。目前，常用的核酸恒温检测方法包括自主序列复制系统(3SR)、核酸序列依赖扩增技术(NASBA)、恒温指数扩增技术(EXPAR)、链置换扩增技术(SDA)、滚环核酸扩增(RCA)、解旋酶扩增技术(HAD)、环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等。3SR 和NASBA通过采用逆转录酶、RNaseH和T7RNA聚合酶共同介导的逆转录、消化和转录的级联反应扩增单链RNA，避免了热变性反应。同样地，EXPAR和RCA也更适用于短单链DNA或ssRNA的直接扩增反应。对于长双链DNA或基因组DNA扩增，SDA需要初始加热反应使双链DNA模板变性，用于引物退火反应。LAMP同样也需要初始热变性步骤，而且引物设计要求高。HAD受DNA解旋酶限制，只适用于扩增小片段的DNA 序列。RPA需要多种酶参与，包括重组酶(gp32，uxsX，uvsY)，单链结合蛋白，肌酸激酶和DNA聚合酶，无疑增加了检测成本。现有的核酸恒温扩增技术虽然解决了PCR方法依赖的热循环反应，但它们有些仍需要初始热变性操作来分离核酸双链结构，或多种酶蛋白、特殊反应试剂参与反应，或复杂的引物设计。因此，开发扩增机制高效、操作简便、灵敏度高、特异性强、检测成本低的通用等温核酸扩增方法仍然是一个挑战。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的提出一种基于Cas9切口酶(Cas9n)偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方法，在恒温条件下特异性检测靶标核酸，包括以下步骤：

以两条分别与靶DNA序列(20个碱基)互补的sgRNA序列，两组Cas9n-sgRNA复合物分别与前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif，PAM，5′-NGG-3′)毗邻的匹配靶DNA序列结合后，通过Cas9n单口切割酶活性和恒温DNA聚合酶链置换活性，获得一条单链靶DNA序列，该序列在引物1和引物2，DNA聚合酶及Cas9n-sgRNA复合物的共同作用下，在恒温条件下反复进行引物杂交，延伸，切割，链置换反应，扩增获得大量靶DNA序列，荧光染料与双链DNA产物结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出靶标基因组或DNA序列的浓度。

进一步的，所述靶DNA序列包括DNA基因组、质粒或双链DNA片段。

进一步的，所述DNA基因组为微生物、组织、血液或细胞等生物样本的基因组。

进一步的，所述Cas9切口酶(Cas9n)是失活了Cas9双链核酸酶的一个结构域，Cas9具有HNH和RuvC两个催化结构域，HNH结构域切割互补的DNA序列，RuvC切割非互补的DNA序列，而Cas9切口酶仅包含一个具有活性的催化结构域，HNH或RuvC。

进一步的，所述sgRNA是单向导RNA(single guide RNA)，含有与靶DNA序列(前间区序列)互补的20个碱基的种子序列。

进一步的，所述PAM是前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif)，位于紧随着与sgRNA互补配对的20个碱基对的靶序列，通常为5′-NGG-3′序列。

进一步的，所述Cas9n-sgRNA复合物通过sgRNA的种子序列特异性地识别PAM相邻区域的靶DNA序列的一条链，互补结合后，形成Cas9n-sgRNA-靶DNA二元复合结构，引导Cas9n切口酶特异性切割靶PAM毗邻的前间区序列中第三和第四个核苷酸之间的磷酸二酯键。

进一步的，所述具有链置换活性的恒温DNA聚合酶为exo^-Klenow fragment， (exo-)DNA聚合酶或phi29DNA聚合酶。

进一步的，所述引物1和引物2分别设计含有5'-CCN-3'序列和毗邻与两条sgRNA种子序列互补的序列。

进一步的，所述荧光染料为SYBR Green I或EvaGreen。

进一步的，所述恒温反应的温度为25～45℃，反应时间为30～200分钟。

本发明还提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括50～400nM Cas9n，100～800nMsgRNA， 50～500μM dNTPs，200～800nM引物1，200～800nM引物2，0.1～0.6U/μL DNA聚合酶，荧光染料(0.1～1.0×SYBR Green I或0.1～1.0×EvaGreen)，0.1～1.0U RNase抑制剂，50～200 mM Tris-HCl，100～600mM NaCl，50～400mM MgCl₂，50～200μg/mL BSA，5～20mM二硫苏糖醇，pH 7.6～8.3，靶核酸和DEPC水。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明恒温核酸检测分析方法的具体操作步骤如下：在冰上制备反应液A和B。反应液A包括1.9μL Cas9n-sgRNA复合物，0.8μL exo-Klenow聚合酶(0.2U/μL)，2.5μL RNase抑制剂(0.1U)，1μL反应缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM 二硫苏糖醇，pH 7.9)，0.4μL荧光染料(0.4×SYBR Green I或0.4×EvaGreen)，3.4μL DEPC 水组成。其中Cas9n-sgRNA复合物的制备：0.5μL Cas9n(200nM)和0.4μL sgRNA(例如：sgRNA1和sgRNA2，200nM)溶解于1μL缓冲液(10mM NaCl，5mM Tris-HCl， 1mM MgCl₂，10μg/mL BSA，pH7.9)，37℃下孵育20分钟。反应液B包括2μL DNA 模板(DNA基因组、质粒或双链DNA片段)，0.5μL dNTP溶液(250μM)，0.8μL引物 1(400nM)，0.8μL引物2(400nM)和1μL缓冲液(10mMTris-HCl，50mM NaCl， 10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9)和4.9μL DEPC水组成。将反应液A和B在冰上混合，混合后的反应液总体积为20μL，将上述反应液置于荧光定量PCR仪，于37℃反应60分钟，每隔2.5分钟检测荧光信号，获得扩增曲线。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和良好效果：

1、扩增机制简单而高效：利用Cas9n-sgRNA复合物特异性序列靶向性和单链切割特性及恒温DNA聚合酶的链置换活性特异性获得待检测靶标核酸，通过引物1和引物2诱导进行引物杂交，延伸，切割，链置换反应的反应发生，指数扩增待测靶标。

2、灵敏度高：可实现单拷贝靶基因组核酸分子的检测。

3、特异性强：可实现靶标单碱基突变检测(如单核苷酸多态性检测)，例如人基因组中结肠癌相关的KRAS G13D点突变检测，最低可以检测出0.5％KRAS G13D点突变。

4、普适性广：靶标核酸待测序列长度没有限制，引物设计简单，可迅速应用于不同核酸序列特异性检测。

5、高通量分析：通过采用八联管或96孔PCR板，可以实现同时制作标准工作曲线和待测样本的检测，减少检测误差。

6、操作简便：整个操作过程只有简单的试剂添加过程。

7、检测成本低：反应组分简单、Cas9n-sgRNA复合物、恒温DNA聚合酶、普通引物和荧光染料。

8、无污染：整个检测过程不需要用到有机溶剂或有毒试剂。

本发明方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强、适用范围广、成本低等优点，是一种简便实用的核酸检测技术。

附图说明

图1是采用HNH结构域活性的Cas9n检测DNA模板(DNA基因组、质粒或双链 DNA片段)分析方法的原理示意图。

图2是检测沙门氏菌基因组中不同长度invA靶基因扩增曲线及柱状图比较。

图3是检测沙门氏菌基因组中88bp invA靶基因灵敏度扩增曲线及线性关系。

图4是检测沙门氏菌基因组中329bp invA靶基因灵敏度扩增曲线及线性关系。

图5是检测沙门氏菌基因组中859bp invA靶基因灵敏度扩增曲线及线性关系。

图6是检测沙门氏菌基因组中1188bp invA靶基因灵敏度扩增曲线及线性关系。

图7是检测沙门氏菌基因组中1849bp invA靶基因灵敏度扩增曲线及线性关系。

图8是检测大肠杆菌基因组中uidA靶基因灵敏度扩增曲线及线性关系。

图9是检测结核分枝杆菌基因组中katG靶基因灵敏度扩增曲线及线性关系。

图10是检测红霉菌基因组中indA靶基因灵敏度扩增曲线及线性关系。

图11是方法特异性考察。

图12是检测人基因组中KRAS基因的G13D点突变。

图13是待检测靶基因invA序列，图中：PAM互补序列由方框标出，sgRNA识别序列为下划线部分，Cas9n-sgRNA复合物切割位点采用黑色三角符号标出。

图14是待检测靶基因uidA序列，PAM互补序列由方框标出，sgRNA识别序列为下划线部分，Cas9n-sgRNA复合物切割位点采用黑色三角符号标出。

图15是待检测靶基因katG序列，PAM互补序列由方框标出，sgRNA识别序列为下划线部分，Cas9n-sgRNA复合物切割位点采用黑色三角符号标出。

图16是靶基因序列，PAM互补序列由方框标出，sgRNA识别序列为下划线部分，Cas9n-sgRNA复合物切割位点采用黑色三角符号标出。

图17是待检测靶基因KRAS G13D点突变序列，PAM序列由方框标出，sgRNA识别序列为下划线部分，Cas9n-sgRNA复合物切割位点采用黑色三角符号标出，G13D单碱基突变位点为大写加粗碱基A。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。其中DNA扩增模板来自试剂盒提取的基因组或质粒，引物委托生物技术公司合成，sgRNA来自T7转录试剂盒体外转录DNA 模板，sgRNA的5′端20个碱基为与前间隔区互补的种子序列。

符号说明：

图1中，采用具有HNH活性的Cas9n，第一个循环(步骤1-3)，步骤1为两条分别与靶DNA序列(20个碱基)互补的sgRNA序列与Cas9n组成两组Cas9n-sgRNA复合物分别与前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif，PAM，5′-NGG-3′)毗邻的匹配靶 DNA的序列b和序列e结合后，通过步骤2，Cas9n单口切割酶活性和恒温DNA聚合酶链置换活性，获得一条单链靶DNA序列，该序列在引物1和引物2，DNA聚合酶及 Cas9n-sgRNA复合物的共同作用下，进入第二个循环(步骤4-11)，在恒温条件下反复进行引物杂交，延伸，切割，链置换反应，扩增获得大量靶DNA序列，荧光染料与双链DNA 产物结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出待测靶标基因组或DNA序列的浓度。

图2中，扩增模板序列为沙门氏菌基因组中invA靶基因序列，88bp扩增模板采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCTCGATTTATTAAGAAAATGACGACGGACATCGACAGA-3′，引物2序列为：

5′-GACTAGTACTCCCCTAATTTGATGGATCTCATT-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CUAAUUUGAUGGAUCUCAUUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-UCGAUUUAUUAAGAAAAUGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

329bp扩增模板采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCTCAGTATTGAGGAAAAAGAGAGCGGCTGCTCGCCTT-3′，

引物2序列为：5′-GACTAGTTATCCCCCCTGTCTACTTATACCATG-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CCCUGUCUACUUAUACCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-CUCAGUAUUGAGGAAAAAGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

859bp扩增模板采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCTAATTTGATGGATCTCATTTAGCGGAGGCTTCCGGG-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCTCAGTATTGAGGAAAAAGA-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CUCAGUAUUGAGGAAAAAGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-CUAAUUUGAUGGAUCUCAUUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

1188bp扩增模板采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCTAATTTGATGGATCTCATTTAGCGGAGGCTTCCGGG-3′，

引物2序列为：5′-GACTAGTTATCCCCCCTGTCTACTTATACCATG-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CCCUGUCUACUUAUACCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-CUAAUUUGAUGGAUCUCAUUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

1849bp扩增模板采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCTCGATTTATTAAGAAAATGACGACGGACATCGACAGA-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCATCTGGTTGATTTCCTGATC-3′，

sgRNA1序列为：

5′-AUCUGGUUGAUUUCCUGAUCUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-UCGAUUUAUUAAGAAAAUGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

图3中，扩增模板序列为沙门氏菌基因组中invA靶基因序列，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCTCGATTTATTAAGAAAATGACGACGGACATCGACAGA-3′，

引物2序列为：5′-GACTAGTACTCCCCTAATTTGATGGATCTCATT-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CUAAUUUGAUGGAUCUCAUUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-UCGAUUUAUUAAGAAAAUGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

图4中，扩增模板序列为沙门氏菌基因组中invA靶基因序列，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCTCAGTATTGAGGAAAAAGAGAGCGGCTGCTCGCCTT-3′，引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCCCTGTCTACTTATACCATG-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CCCUGUCUACUUAUACCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-CUCAGUAUUGAGGAAAAAGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

图5中，扩增模板序列为沙门氏菌基因组中invA靶基因序列，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCTAATTTGATGGATCTCATTTAGCGGAGGCTTCCGGG-3′，

引物2序列为：5′-GACTAGTTATCCCCTCAGTATTGAGGAAAAAGA-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CUCAGUAUUGAGGAAAAAGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-CUAAUUUGAUGGAUCUCAUUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

图6中，扩增模板序列为沙门氏菌基因组中invA靶基因序列，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCTAATTTGATGGATCTCATTTAGCGGAGGCTTCCGGG-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCCCTGTCTACTTATACCATG-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CCCUGUCUACUUAUACCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-CUAAUUUGAUGGAUCUCAUUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

图7中，扩增模板序列为沙门氏菌基因组中invA靶基因序列，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCTCGATTTATTAAGAAAATGACGACGGACATCGACAGA-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCATCTGGTTGATTTCCTGATC-3′，

sgRNA1序列为：

5′-AUCUGGUUGAUUUCCUGAUCUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-UCGAUUUAUUAAGAAAAUGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

图8中，扩增模板序列为大肠杆菌基因组中uidA靶基因序列，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCGGTGAAGGTTATCTCTATGAACCCGGTTGCCAGAGGT-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCCGGGAATGGTGATTACCGA-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CCGGGAAUGGUGAUUACCGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-GGUGAAGGUUAUCUCUAUGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

图9中，扩增模板序列为结核分枝杆菌基因组中katG靶基因序列，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCGTGGACCTGGTCTTCGGGTACGCGGCTGCCGGTCCA-3′，引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCACGGATGCGTCGCAGGAAC-3′，

sgRNA1序列为：

5′-GUUCCUGCGACGCAUCCGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-ACCCGAAGACCAGGUCCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

图10中，扩增模板序列为红霉菌基因组中indA靶基因序列，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCCGGGATGTTCAGCGTCTCCCGGTGGTCGGCTACCGG-3′，引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCGCGCGATCGACGCCCCCAGC-3′，

sgRNA1序列为：

5′-GGAGACGCUGAACAUCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-GCUGGGGGCGUCGAUCGCGCUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

图11中，方法的特异性考察，扩增模板序列为构建带有单碱基突变的红霉菌基因组中indA靶基因序列的质粒，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCCGGGATGTTCAGCGTCTCCCGGTGGTCGGCTACCGG-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCGCGCGATCGACGCCCCCAGC-3′，

sgRNA1序列为：

5′-GGAGACGCUGAACAUCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-GCUGGGGGCGUCGAUCGCGCUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

图12中，扩增模板序列为野生型KRAS基因与突变型KRAS G13D基因序列，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCACGTCACCAGCTCCAACTACCGTAGGCAAGAGTGCCT-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCTGTCTTGTCTTTGCTGATGT-3′，

sgRNA1序列为：

5′-GUAGUUGGAGCUGGUGACGUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-ACAUCAGCAAAGACAAGACAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

通过下述实施例将有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。

实施例1

利用Cas9切口酶偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方法，在恒温条件下特异性检测沙门氏菌基因组中不同长度invA靶基因，检测原理如图1所示。采用HNH结构域活性的Cas9n，exo^-Klenow fragment DNA聚合酶和双链DNA结合染料SYBR Green I。待检测靶基因invA序列如图12所示，PAM互补序列由方框标出，sgRNA识别序列为下划线部分，Cas9n-sgRNA复合物切割位点采用黑色三角符号标出：

检测沙门氏菌基因组中不同长度invA靶基因扩增曲线及柱状图比较如图2所示，分别制备已知浓度的沙门氏菌基因组标准溶液，加入反应液中靶基因终含量依次为20拷贝， 100拷贝，200拷贝，2×10³拷贝，2×10⁴拷贝，2×10⁵拷贝和2×10⁶拷贝以及空白样本(不含沙门氏菌基因组，即沙门氏菌基因组含量为0)，对88bp扩增模板进行灵敏度检测，获得扩增曲线，如附图3(A)所示，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCTCGATTTATTAAGAAAATGACGACGGACATCGACAGA-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTACTCCCCTAATTTGATGGATCTCATT-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CUAAUUUGAUGGAUCUCAUUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-UCGAUUUAUUAAGAAAAUGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列为与靶标互补序列；

分别制备已知浓度的沙门氏菌基因组标准溶液，加入反应液中靶基因终含量依次为2 拷贝，10拷贝，20拷贝，200拷贝，2×10³拷贝，2×10⁴拷贝，2×10⁵拷贝和2×10⁶拷贝以及空白样本(不含沙门氏菌基因组，即沙门氏菌基因组含量为0)，对329bp扩增模板进行灵敏度检测，获得扩增曲线，如附图4(A)所示，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCTCAGTATTGAGGAAAAAGAGAGCGGCTGCTCGCCTT-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCCCTGTCTACTTATACCATG-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CCCUGUCUACUUAUACCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-CUCAGUAUUGAGGAAAAAGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列为与靶标互补序列；

分别制备已知浓度的沙门氏菌基因组标准溶液，加入反应液中靶基因终含量依次为2 拷贝，10拷贝，20拷贝，200拷贝，2×10³拷贝，2×10⁴拷贝，2×10⁵拷贝和2×10⁶拷贝以及空白样本(不含沙门氏菌基因组，即沙门氏菌基因组含量为0)，对859bp扩增模板进行灵敏度检测，获得扩增曲线，如附图5(A)所示，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCTAATTTGATGGATCTCATTTAGCGGAGGCTTCCGGG-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCTCAGTATTGAGGAAAAAGA-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CUCAGUAUUGAGGAAAAAGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-CUAAUUUGAUGGAUCUCAUUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列为与靶标互补序列；

分别制备已知浓度的沙门氏菌基因组标准溶液，加入反应液中靶基因终含量依次为2 拷贝，10拷贝，20拷贝，200拷贝，2×10³拷贝，2×10⁴拷贝，2×10⁵拷贝和2×10⁶拷贝以及空白样本(不含沙门氏菌基因组，即沙门氏菌基因组含量为0)，对1188bp扩增模板进行灵敏度检测，获得扩增曲线，如附图6(A)所示，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCTAATTTGATGGATCTCATTTAGCGGAGGCTTCCGGG-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCCCTGTCTACTTATACCATG-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CCCUGUCUACUUAUACCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-CUAAUUUGAUGGAUCUCAUUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列为与靶标互补序列；

分别制备已知浓度的沙门氏菌基因组标准溶液，加入反应液中靶基因终含量依次为2 拷贝，10拷贝，20拷贝，200拷贝，2×10³拷贝，2×10⁴拷贝，2×10⁵拷贝和2×10⁶拷贝以及空白样本(不含沙门氏菌基因组，即沙门氏菌基因组含量为0)，对1849bp扩增模板进行灵敏度检测，获得扩增曲线，如附图7(A)所示，采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCTCGATTTATTAAGAAAATGACGACGGACATCGACAGA-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCATCTGGTTGATTTCCTGATC-3′，

sgRNA1序列为：

5′-AUCUGGUUGAUUUCCUGAUCUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-UCGAUUUAUUAAGAAAAUGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

下面对沙门氏菌基因组中不同长度invA靶基因检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。具体操作步骤如下：在冰上制备反应液A和B。反应液A包括1.9μL Cas9n-sgRNA复合物，0.8μLexo-Klenow聚合酶(0.2U/μL)，2.5μL RNase抑制剂(0.1U)，1μL反应缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9)，0.4μL荧光染料 (0.4×SYBR GreenI或0.4×EvaGreen)，3.4μL DEPC水组成。其中Cas9n-sgRNA复合物的制备：0.5μL Cas9n(200nM)和0.4μL sgRNA(例如：sgRNA1和sgRNA2，200nM) 溶解于1μL缓冲液(10mM NaCl，5mMTris-HCl，1mM MgCl₂，10μg/mL BSA，pH 7.9)， 37℃下孵育20分钟。反应液B包括2μL沙门氏菌基因组样本或水(作为空白样本)，0.5 μL dNTP溶液(250μM)，0.8μL引物1(400nM)，0.8μL引物2(400nM)和1μL缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH7.9)和4.9 μL DEPC水组成。将反应液A和B在冰上混合，混合后的反应液总体积为20μL，将上述反应液置于荧光定量PCR仪，于37℃孵育60分钟，每隔2.5分钟检测荧光信号，获得扩增曲线。

工作曲线的制作：分别制备已知浓度的沙门氏菌基因组标准溶液和空白样本，按照上述步骤进行操作，测定各个反应液的扩增曲线，得出靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)。然后根据沙门氏菌基因组标准溶液含量的负对数值和靶基因终态荧光值(F)与空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)制作标准工作曲线，如附图3(B)所示为沙门氏菌基因组88bp扩增模板标准溶液的含量负对数值与靶基因终态荧光值(F) 和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)在20拷贝～2×10⁶拷贝范围内呈线性关系，线性方程为F/F₀＝0.69×lg[S.typhimurium]-0.05。如附图4(B)所示为沙门氏菌基因组329bp 扩增模板标准溶液的含量负对数值与靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀) 比值(F/F₀)在2拷贝～2×10⁶拷贝范围内呈线性关系，线性方程为F/F₀＝1.08×lg[S. typhimurium]+0.05。如附图5(B)所示为沙门氏菌基因组859bp扩增模板标准溶液的含量负对数值与靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)在2拷贝～2×10⁶拷贝范围内呈线性关系，线性方程为F/F₀＝1.49×lg[S.typhimurium]+0.49。如附图6(B)所示为沙门氏菌基因组1188bp扩增模板标准溶液的含量负对数值与靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)在2拷贝～2×10⁶拷贝范围内呈线性关系，线性方程为F/F₀＝3.11×lg[S.typhimurium]+2.24。如附图7(B)所示为沙门氏菌基因组1849bp扩增模板标准溶液的含量负对数值与靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)在2拷贝～2×10⁶拷贝范围内呈线性关系，线性方程为 F/F₀＝2.88×lg[S.typhimurium]+0.83。

实施例2

利用Cas9切口酶偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方法，在恒温条件下特异性检测大肠杆菌基因组中uidA靶基因，检测原理如图1所示。采用HNH结构域活性的Cas9n，exo^-Klenow fragment DNA聚合酶和双链DNA结合染料SYBR Green I。待检测靶基因 uidA序列如图14所示，PAM互补序列由方框标出，sgRNA识别序列为下划线部分， Cas9n-sgRNA复合物切割位点采用黑色三角符号标出。

分别制备已知浓度的大肠杆菌基因组标准溶液，加入反应液中靶基因终含量依次为2 拷贝，10拷贝，20拷贝，200拷贝，2×10³拷贝，2×10⁴拷贝，2×10⁵拷贝和2×10⁶拷贝以及空白样本(不含大肠杆菌基因组，即大肠杆菌基因组含量为0)，对大肠杆菌基因组中uidA靶基因进行灵敏度检测(图8)。

采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCGGTGAAGGTTATCTCTATGAACCCGGTTGCCAGAGGT-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCCGGGAATGGTGATTACCGA-3′，

sgRNA1序列为：

5′-CCGGGAAUGGUGAUUACCGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-GGUGAAGGUUAUCUCUAUGAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

下面对大肠杆菌基因组中uidA靶基因检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。具体操作步骤如下：在冰上制备反应液A和B。反应液A包括1.9μL Cas9n-sgRNA复合物，0.8μL exo-Klenow聚合酶(0.2U/μL)，2.5μL RNase抑制剂(0.1U)，1μL反应缓冲液(10mM Tris-HCl，50mMNaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9)，0.4μL荧光染料 (0.4×SYBR Green I或0.4×EvaGreen)，3.4μL DEPC水组成。其中Cas9n-sgRNA复合物的制备：0.5μL Cas9n(200nM)和0.4μL sgRNA(例如：sgRNA1和sgRNA2，200nM) 溶解于1μL缓冲液(10mM NaCl，5mM Tris-HCl，1mM MgCl₂，10μg/mL BSA，pH 7.9)， 37℃下孵育20分钟。反应液B包括2μL大肠杆菌基因组样本或水(作为空白样本)，0.5 μL dNTP溶液(250μM)，0.8μL引物1(400nM)，0.8μL引物2(400nM)和1μL缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9)和4.9 μL DEPC水组成。将反应液A和B在冰上混合，混合后的反应液总体积为20μL，将上述反应液置于荧光定量PCR仪，于37℃孵育60分钟，每隔2.5分钟检测荧光信号，获得扩增曲线，如附图8(A)所示。

工作曲线的制作：分别制备已知浓度的大肠杆菌基因组标准溶液和空白样本，按照上述步骤进行操作，测定各个反应体系的扩增曲线，得出靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)。然后根据大肠杆菌基因组标准溶液含量的负对数值与靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)制作标准工作曲线，如附图8(B) 所示，大肠杆菌基因组标准溶液的含量负对数值与靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)在2拷贝～2×10⁶拷贝范围内呈线性关系，线性方程为 F/F₀＝1.13×lg[E.coli]-0.04。

实施例3

利用Cas9切口酶偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方法，在恒温条件下特异性检测结核分枝杆菌基因组中katG靶基因，检测原理如图1所示。采用HNH结构域活性的Cas9n，exo^-Klenow fragment DNA聚合酶和双链DNA结合染料SYBR Green I。待检测靶基因katG序列如图15所示，PAM互补序列由方框标出，sgRNA识别序列为下划线部分， Cas9n-sgRNA复合物切割位点采用黑色三角符号标出。

分别制备已知浓度的结核分枝杆菌基因组标准溶液，加入反应液中靶基因终含量依次为2拷贝，10拷贝，20拷贝，200拷贝，2×10³拷贝，2×10⁴拷贝，2×10⁵拷贝和2×10⁶拷贝以及空白样本(不含结核分枝杆菌基因组，即结核分枝杆菌基因组含量为0)，对结核分枝杆菌基因组中katG靶基因进行灵敏度检测(图9)。

采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCGTGGACCTGGTCTTCGGGTACGCGGCTGCCGGTCCA-3′，

引物2序列为：5′-GACTAGTTATCCCCACGGATGCGTCGCAGGAAC-3′，

sgRNA1序列为：

5′-GUUCCUGCGACGCAUCCGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-ACCCGAAGACCAGGUCCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

下面对结核分枝杆菌基因组中katG靶基因检测的具体实施来进一步说明本发明。具体操作步骤如下：在冰上制备反应液A和B。反应液A包括1.9μL Cas9n-sgRNA复合物， 0.8μL exo-Klenow聚合酶(0.2U/μL)，2.5μL RNase抑制剂(0.1U)，1μL反应缓冲液 (10mMTris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9)，0.4μL荧光染料(0.4×SYBRGreen I或0.4×EvaGreen)，3.4μL DEPC水组成。其中Cas9n-sgRNA 复合物的制备：0.5μLCas9n(200nM)和0.4μL sgRNA(例如：sgRNA1和sgRNA2，200 nM)溶解于1μL缓冲液(10mMNaCl，5mM Tris-HCl，1mM MgCl₂，10μg/mL BSA， pH 7.9)，37℃下孵育20分钟。反应液B包括2μL结核分枝杆菌基因组样本或水(作为空白样本)，0.5μL dNTP溶液(250μM)，0.8μL引物1(400nM)，0.8μL引物2(400nM) 和1μL缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9) 和4.9μL DEPC水组成。将反应液A和B在冰上混合，混合后的反应液总体积为20μL，将上述反应液置于荧光定量PCR仪，于37℃孵育60分钟，每隔2.5分钟检测荧光信号，获得扩增曲线，如附图9(A)所示。

工作曲线的制作：分别制备已知浓度的结核分枝杆菌基因组标准溶液和空白样本，按照上述步骤进行操作，测定各个反应体系的扩增曲线，得出靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)。然后根据结核分枝杆菌基因组标准溶液含量的负对数值与靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)制作标准工作曲线，如附图9(B)所示，结核分枝杆菌基因组标准溶液的含量负对数值与靶基因终态荧光值(F) 和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)在2拷贝～2×10⁶拷贝范围内呈线性关系，线性方程为F/F₀＝1.64×lg[M.tuberculosis]+0.25。

实施例4

利用Cas9切口酶偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方法，在恒温条件下特异性检测红霉菌基因组中indA靶基因，检测原理如图1所示。采用HNH结构域活性的Cas9n， exo^-Klenow fragment DNA聚合酶和双链DNA结合染料SYBR Green I。靶基因序列如图 16所示，PAM互补序列由方框标出，sgRNA识别序列为下划线部分，Cas9n-sgRNA复合物切割位点采用黑色三角符号标出。

分别制备已知浓度的红霉菌基因组标准溶液，加入反应液中靶基因终含量依次为2拷贝，10拷贝，20拷贝，200拷贝，2×10³拷贝，2×10⁴拷贝，2×10⁵拷贝和2×10⁶拷贝以及空白样本(不含红霉菌基因组，即红霉菌基因组含量为0)，对红霉菌基因组中indA 靶基因进行灵敏度检测(图10)。

采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCCGGGATGTTCAGCGTCTCCCGGTGGTCGGCTACCGG-3′，

引物2序列为：5′-GACTAGTTATCCCGCGCGATCGACGCCCCCAGC-3′，

sgRNA1序列为：

5′-GGAGACGCUGAACAUCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-GCUGGGGGCGUCGAUCGCGCUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

下面对红霉菌基因组中indA靶基因检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。具体操作步骤如下：在冰上制备反应液A和B。反应液A包括1.9μL Cas9n-sgRNA复合物，0.8μL exo-Klenow聚合酶(0.2U/μL)，2.5μL RNase抑制剂(0.1U)，1μL反应缓冲液(10mM Tris-HCl， 50mMNaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9)，0.4μL荧光染料(0.4×SYBR Green I或0.4×EvaGreen)，3.4μL DEPC水组成。其中Cas9n-sgRNA复合物的制备：0.5μL Cas9n(200nM)和0.4μL sgRNA(例如：sgRNA1和sgRNA2，200nM)溶解于1μL缓冲液(10mM NaCl，5mM Tris-HCl，1mM MgCl₂，10μg/mL BSA，pH 7.9)，37℃下孵育20分钟。反应液B包括2μL红霉菌基因组样本或水(作为空白样本)，0.5μL dNTP 溶液(250μM)，0.8μL引物1(400nM)，0.8μL引物2(400nM)和1μL缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9)和4.9μLDEPC水组成。将反应液A和B在冰上混合，混合后的反应液总体积为20μL，将上述反应液置于荧光定量PCR仪，于37℃孵育60分钟，每隔2.5分钟检测荧光信号，获得扩增曲线，如附图10(A)所示。

工作曲线的制作：分别制备已知浓度的红霉菌基因组标准溶液和空白样本(不含有红霉菌基因组，即红霉菌基因组浓度为0)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应体系的扩增曲线，得出靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)。根据红霉菌基因组标准溶液含量的负对数值与靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/ F₀)制作标准工作曲线，如附图10(B)所示，红霉菌基因组标准溶液的含量负对数值与靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)在2拷贝～2×10⁶拷贝范围内呈线性关系，线性方程为F/F₀＝1.33×lg[S.erythraea]+1.41。

实施例5

附图11所示为本发明方法的特异性实验，扩增模板序列为构建带有单碱基突变的红霉菌indA靶基因序列的质粒，如附图11(A)所示，质粒模板的前间区序列单碱基突变：Mb1-Mb20，Me1-Me20(其中数字1-20代表突变位点的位置)，WTb和WTe是无单碱基突变的野生型，PAM1，PAM2为靶DNA的序列b和序列e前间区序列邻近基序突变型， Md为序列e前间区序列邻近基序PAM毗邻的单碱基突变序列，所有单碱基突变由大写加粗标出。利用Cas9切口酶偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方法，在恒温条件下进行该发明的特异性考察，检测原理如图1所示。采用HNH结构域活性的Cas9n，exo^-Klenow fragment DNA聚合酶和双链DNA结合染料SYBR Green I。

从带有单碱基突变的红霉菌indA靶基因序列的质粒上扩增得到带有单碱基突变的红霉菌基因组indA靶基因序列，分别制备已知浓度的单碱基突变的indA靶基因标准溶液和空白样本(不含单碱基突变indA靶基因，即单碱基突变indA靶基因含量为0)，对红霉菌indA靶基因单碱基突变进行检测(图11)。

采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCCCGGGATGTTCAGCGTCTCCCGGTGGTCGGCTACCGG-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCGCGCGATCGACGCCCCCAGC-3′，

sgRNA1序列为：

5′-GGAGACGCUGAACAUCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-GCUGGGGGCGUCGAUCGCGCUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

下面对红霉菌基因组中单碱基突变的indA靶基因检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。具体操作步骤如下：在冰上制备反应液A和B。反应液A包括1.9μL Cas9n-sgRNA复合物， 0.8μLexo-Klenow聚合酶(0.2U/μL)，2.5μL RNase抑制剂(0.1U)，1μL反应缓冲液 (10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9)，0.4μL荧光染料(0.4×SYBR GreenI或0.4×EvaGreen)，3.4μL DEPC水组成。其中Cas9n-sgRNA 复合物的制备：0.5μL Cas9n(200nM)和0.4μL sgRNA(例如：sgRNA1和sgRNA2，200 nM)溶解于1μL缓冲液(10mM NaCl，5mMTris-HCl，1mM MgCl₂，10μg/mL BSA， pH 7.9)，37℃下孵育20分钟。反应液B包括2μL单碱基突变的indA靶基因样本或水(作为空白样本)，0.5μL dNTP溶液(250μM)，0.8μL引物1(400nM)，0.8μL引物2(400 nM)和1μL缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇， pH 7.9)和4.9μL DEPC水组成。将反应液A和B在冰上混合，混合后的反应液总体积为 20μL，将上述反应液置于荧光定量PCR仪，于37℃孵育60分钟，每隔2.5分钟检测荧光信号，获得扩增曲线，得出靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)。

特异性分析：分别制备已知浓度的单碱基突变indA靶基因标准溶液以及空白样本(不含单碱基突变indA靶基因，即单碱基突变indA靶基因含量为0)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应体系的扩增曲线，得出靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)。采取靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)进行特异性分析，如附图11(B)所示，单碱基突变indA靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀) 比值(F/F₀)与野生型indA靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/ F₀)具有很大差异，实验结果表明该分析方法具有很好的单碱基识别能力。

实施例6

利用Cas9切口酶偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方法，在恒温条件下特异性检测人基因组中KRAS基因的G13D点突变(G→A)，检测原理如图1所示。采用HNH结构域活性的Cas9n，exo^-Klenow fragment DNA聚合酶和双链DNA结合染料SYBR Green I。待检测靶基因KRAS G13D点突变序列，PAM序列由方框标出，sgRNA识别序列为下划线部分，Cas9n-sgRNA复合物切割位点采用黑色三角符号标出，G13D单碱基突变位点为大写加粗碱基A。

制备人基因组中野生型KRAS基因与突变型KRAS G13D基因的混合样本及空白样本(不含人基因组，即人基因组含量为0)，突变型KRAS G13D基因添加比例分别为0％， 0.5％，1％，5％，10％，50％，100％，对人基因组中KRAS基因的G13D点突变进行检测 (图12)。

采用的引物1序列为：

5′-GACTAGTTATCCCACGTCACCAGCTCCAACTACCGTAGGCAAGAGTGCCT-3′，

引物2序列为：

5′-GACTAGTTATCCCTGTCTTGTCTTTGCTGATGT-3′，

sgRNA1序列为：

5′-GUAGUUGGAGCUGGUGACGUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补，

sgRNA2序列为：

5′-ACAUCAGCAAAGACAAGACAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG-3′，其中下划线序列与靶标的前间区序列互补。

下面对人基因组中KRAS基因的G13D点突变检测的具体实施来进一步说明本发明。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。具体操作步骤如下：在冰上制备反应液A和B。反应液A包括1.9μL Cas9n-sgRNA复合物，0.8μL exo-Klenow聚合酶(0.2U/μL)，2.5μL RNase抑制剂(0.1U)，1μL反应缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9)，0.4μL荧光染料 (0.4×SYBR Green I或0.4×EvaGreen)，3.4μL DEPC水组成。其中Cas9n-sgRNA复合物的制备：0.5μL Cas9n(200nM)和0.4μL sgRNA(例如：sgRNA1和sgRNA2，200nM) 溶解于1μL缓冲液(10mM NaCl，5mMTris-HCl，1mM MgCl₂，10μg/mL BSA，pH 7.9)， 37℃下孵育20分钟。反应液B包括2μL人基因组组样本或水(作为空白样本)，0.5μL dNTP溶液(250μM)，0.8μL引物1(400nM)，0.8μL引物2(400nM)和1μL缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫苏糖醇，pH 7.9)和4.9μL DEPC 水组成。将反应液A和B在冰上混合，混合后的反应液总体积为20μL，将上述反应液置于荧光定量PCR仪，于37℃孵育60分钟，每隔2.5分钟检测荧光信号，获得扩增曲线，如附图12(A)所示。

对人基因组中KRAS基因的G13D点突变检测结果进行t检验分析，分别制备已知浓度的野生型KRAS基因与突变型KRAS G13D基因的混合样本及空白样本(不含人基因组，即人基因组含量为0)，按照上述步骤进行操作，测定各个反应体系的扩增曲线，得出靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)，采取靶基因终态荧光值(F)和空白样本终态荧光值(F₀)比值(F/F₀)进行t检验分析，如附图12(B)所示，MT(％)表示突变型KRAS G13D基因比例，WT(％)表示野生型KRAS基因比例，将0.5％，1％， 5％，10％，50％，100％的MT(％)测试样本分别与100％的WT(％)进行t检验分析，得出P值结果，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，误差分析为3次平行实验的平均值分析，实验结果表明该试剂盒具有很强的特异性，可在混合样本中检测出 0.5％的突变样本。

本发明利用Cas9n-sgRNA复合物特异性序列靶向性和单链切割特性及恒温DNA聚合酶的链置换活性，从靶标核酸中特异性切割获取特异性的一段单链核酸序列，然后通过引入含有Cas9n-sgRNA复合物识别和切割序列的引物1和引物2对单链核酸序列在恒温条件下，反复进行引物杂交，延伸，切割，链置换反应，实现对靶核酸分子的指数扩增；采用荧光染料与双链DNA产物结合产生荧光信号，实时测定反应体系中的荧光信号强度，与标准工作曲线对比，计算出靶标核酸的浓度。

本发明试剂盒中包含Cas9n，两条分别与靶标核酸20个碱基互补的sgRNA序列，恒温DNA聚合酶，与两条sgRNA序列互补的引物对，dNTP溶液，嵌入式荧光染料。

本发明方法具有高效的扩增机制、灵敏度高、特异性强、操作简便、检测成本低等优点，可应用于微生物、组织、血液和细胞等生物样本中基因组检测，尤其适用于核酸即时检测。