阅读说明：本技术 miR-431作为靶点在制备促进SP表达的药物中的应用 (Application of miR-431 as target point in preparation of medicine for promoting SP expression ) 是由 杨洋 沈艳青 程锐 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了miR-431作为靶点在制备促进SP表达的药物中的应用。MicroRNA-431作为治疗靶点在制备由肺表面活性蛋白不足所致疾病的药物中的应用。抑制miR-431表达的物质通过直接靶向SMAD4抑制BMP4/活化素/TGF-β信号通路来促进肺表面活性蛋白的表达,从而在制备由肺表面活性蛋白不足所致疾病的药物中的应用。本发明探索了miR-431及其靶基因-SMAD4的功能。数据表明抑制miR-431可通过直接靶向SMAD4抑制BMP4/活化素/TGF-β信号通路来促进SP的表达。该研究提供了miR-431的重要分子和细胞基础,作为胎儿肺发育的潜在标志物和肺发育疾病的潜在治疗靶标之一。(The invention discloses application of miR-431 as a target point in preparation of a medicament for promoting SP expression. Application of MicroRNA-431 as a therapeutic target in preparation of medicines for treating diseases caused by deficiency of lung surfactant protein. The substance for inhibiting miR-431 expression can be used for inhibiting BMP 4/activin/TGF-beta signal pathway by directly targeting SMAD4 to promote the expression of lung surfactant protein, so that the substance can be applied to the preparation of medicines for treating diseases caused by lung surfactant protein deficiency. The invention explores the functions of miR-431 and a target gene SMAD4 thereof. The data indicate that inhibition of miR-431 can promote expression of SP by inhibiting the BMP4/activin/TGF- β signaling pathway by directly targeting SMAD 4. The research provides important molecules and cellular basis of miR-431, and the miR-431 is used as a potential marker of fetal lung development and one of potential therapeutic targets of lung development diseases.)

miR-431作为靶点在制备促进SP表达的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域,涉及miR-431作为靶点在制备促进SP表达的药物中的应用。

背景技术

在过去的25年中，早产率一般增加了约三分之一(1)。大多数早产儿出生于肺发育的囊状期(26至36孕周)，而肺结构不成熟，表面活性蛋白(SPs)效率低，肺内液体吸收延迟和气体交换效率低。近年来积累的证据表明，出生时间少于37周的婴儿的呼吸系统发病率一直很高。肺部发育是一个复杂的过程，伴随着一系列精心策划的事件。早产会中断正常的肺部发育，从而导致一系列呼吸系统疾病。新生儿呼吸窘迫综合征(RDS)是一种肺功能不全的病症，其在自然过程中在出生时或出生后不久开始并且在出生后的最初48小时内严重程度增加，是早产儿的常见疾病。早期/中度早产儿(妊娠23-33周)RDS发生率约为45％，而早产儿(妊娠34-36周)约占4％，新生儿期约占1％(妊娠≥37周))。RDS的主要原因是表面活性蛋白缺乏以及结构不成熟。因此，提高对肺发育的理解可能会为将来更好地预防和治疗呼吸系统疾病带来希望。

作为SMAD家族的共同SMAD，SMAD4是TGF-β信号传导途径的共同介质。以前的研究报道，在经典信号通路中，活化的Smad2和Smad3与SMAD4形成复合物，SMAD4是所有TGF-β家族成员共有的成分，并且这种复合物反式定位于细胞核以调节靶基因的转录。值得注意的是，越来越多的证据表明，SMAD4依赖的TGF-β信号通路在内胚层细胞的分化和抑制上皮-间质转化(EMT)过程中发挥重要作用，这对肺分支形态发生至关重要。骨形态发生蛋白4属于TGF-β超家族，是一种多功能肽，在正常肺发育中起重要作用。

微小RNA(miRNA)是一类小的，约22个核苷酸长的非编码RNA，其抑制靶mRNA的翻译，在细胞增殖，细胞分化和器官发育中起重要作用。一些研究已经证明，超过100种miRNA在肺发育过程中表现出显着的表达变化。然而，关于它们是否或如何调节肺发育知之甚少。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述空白，提供、MicroRNA-431作为治疗靶点在制备由肺表面活性蛋白不足所致疾病的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供抑制miR-431表达的物质在制备促进肺表面活性蛋白表达的药物中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

MicroRNA-431作为治疗靶点在制备由肺表面活性蛋白不足所致疾病的药物中的应用。

所述的应用优选，抑制miR-431表达的物质通过直接靶向SMAD4抑制BMP4/活化素/TGF-β信号通路来促进肺表面活性蛋白的表达，从而在制备治疗由肺表面活性蛋白不足所致疾病的药物中的应用。

所述的由肺表面活性蛋白不足所致疾病为肺部发育疾病，优选新生儿呼吸窘迫综合征。

抑制miR-431表达的物质在制备促进肺表面活性蛋白表达的药物中的应用。

所述的应用优选，抑制miR-431表达的物质通过直接靶向SMAD4抑制BMP4/活化素/TGF-β信号通路来促进肺表面活性蛋白的表达。

有益效果：

本发明探索了miR-431及其靶基因-SMAD4的功能。我们的数据表明抑制miR-431可通过直接靶向SMAD4抑制BMP4/活化素/TGF-β信号通路来促进SP的表达。此外，该研究提供了miR-431的重要分子和细胞基础，作为胎儿肺发育的潜在标志物和肺发育疾病的潜在治疗靶标之一。

附图说明

图1光学显微镜和荧光显微镜下放大100倍的细胞状态.图A显示了不同浓度嘌呤霉素的A549细胞，我们发现当细胞被完全杀死时，最佳嘌呤霉素浓度为1.2μg/ml。图B显示了72小时和96小时后感染A549细胞系的四种类型的慢病毒(LV-SMAD4+，LV-SMAD4+-NC，LV-SMAD4-和LV-SMAD4--NC)的代表性图片。

图2通过RT-PCR验证慢病毒在四种类型的稳定细胞系(LV-SMAD4⁺,LV-SMAD4⁺-NC,LV-SMAD4^-和LV-SMAD4^--NC)中SMAD4，BMP4，SP和miR-431的表达。(A)慢病毒细胞株中SMAD4mRNA的表达；(B)慢病毒细胞株中BMP4mRNA的表达；(C)慢病毒细胞株中SP-A mRNA的表达；(D)慢病毒细胞株中SP-B mRNA的表达；(E)慢病毒细胞株中SP-C mRNA的表达；(F)慢病毒细胞系中miR-431mRNA的表达。通过t检验(^*P<0.05，^**P<0.001，^***P<0.0005，****P<0.0001)测试所有实时PCR的统计显著性。

图3使用蛋白质印迹法检测慢病毒在四种类型的稳定细胞系(LV-SMAD4⁺,LV-SMAD4⁺-NC,LV-SMAD4^-和LV-SMAD4^--NC)中SMAD4，BMP4和SP的蛋白表达。(A)对SMAD4，BMP4和SP(SP-A，SP-B和SP-C)的Western印迹结果进行了检测，并将β-肌动蛋白用作内部对照。(B)SMAD4蛋白的相对表达。数据证实了慢病毒对四种类型稳定细胞系(LV-SMAD4⁺,LV-SMAD4⁺-NC,LV-SMAD4^-和LV-SMAD4^--NC)的转染效率。(C)BMP4蛋白的相对表达。(D)SP-A蛋白的相对表达。(E)SP-B蛋白的相对表达。(F)。SP-C蛋白的相对表达。通过t检验检验了所有显示出的Western印迹测定的统计学显著性(^*P<0.05，^**P<0.001，^****P<0.0001)。

图4通过RT-PCR测定转染了miR-431模拟物，抑制剂和相应对照(mimic-nc和inhibitor-nc)的LV-SMAD4-稳定细胞系中miR-431，BMP4，SPs和SMAD4的相对表达量。(A)LV-SMAD4-细胞中miR-431mRNA的表达，证实了模拟物，抑制剂和相应对照的转染效率。(B)miR-431模拟物，抑制剂和相应对照转染的LV-SMAD4-细胞中BMP4mRNA表达。(C)SP-A mRNA表达。(D)SP-B mRNA表达。(E)SP-C mRNA表达。(F)SMAD4mRNA表达。通过t检验(^*P<0.05，^**P<0.001，^***P<0.0005，^****P<0.0001)测试所有实时PCR的统计显著性。

图5在转染miR-431模拟物，抑制剂和相应的对照(mimic-nc和抑制剂-nc)的LV-SMAD4^-稳定细胞系中验证BMP4和SPs(SP-A，SP-B和SP-C)蛋白水平的表达。(A)。BMP4和SP(SP-A，SP-B和SP-C)的Western印迹结果，β-肌动蛋白用作内部对照。(B)BMP4蛋白的相对表达。(C)SP-A蛋白的相对表达。(D)SP-B蛋白的相对表达。(E)SP-C蛋白的相对表达。通过t检验测试了所有显示出的Western印迹分析的统计学意义(^*P<0.05，^**P<0.001，^***P<0.0005)。

图6通过RT-PCR测定转染了miR-431模拟物，抑制剂和相应对照(mimic-nc和inhibitor-nc)的LV-SMAD4⁺稳定细胞系中miR-431，BMP4，SPs和SMAD4的相对表达量。(A)LV-SMAD4+细胞中miR-431mRNA的表达，证实了模拟物，抑制剂和相应对照的转染效率。(B)BMP4mRNA表达。(C)SP-A mRNA表达。(D)SP-B mRNA表达。(E)SP-C mRNA表达。(F)SMAD4mRNA表达。通过t检验检验所有显示的实时PCR的统计学显著性(^*P<0.05，^**P<0.001，^***P<0.0005)。

图7通过western blot测定转染了miR-431模拟物，抑制剂和相应对照(模拟物-nc和抑制剂-nc)的LV-SMAD4⁺的稳定细胞系中蛋白质水平中BMP4，SMAD4和SP的测定。(A)对SMAD4，BMP4和SP(SP-A，SP-B和SP-C)的Western印迹结果进行了检测，并将β-肌动蛋白用作内部对照。(B)BMP4蛋白的相对表达。(C)SP-A蛋白的相对表达。(D)SP-B蛋白的相对表达。(E)SP-C蛋白的相对表达。(F)SMAD4蛋白的相对表达。通过t检验测试了所有显示出的Western印迹分析的统计学意义(^*P<0.05，^**P<0.001，^***P<0.0005)。

具体实施方式

实施例1

1.材料和方法

1.1细胞培养

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的人非鳞状细胞肺癌细胞系接种并在补充有10％胎牛血清的Fulbecco改良Eagle培养基(DMEM；Gibco)中生长(FBS；Gibco，GrandIsland，NY，USA)和抗体(Gibco，Grand Island，NY，USA)在37℃的条件下在含有5％CO 2的加湿培养箱中。

1.2用慢病毒产生稳定的细胞系过表达SMAD4(LV-SMAD4+)的慢病毒

抑制SMAD4(LV-SMAD4-)的慢病毒和相应的对照(LV-SMAD4+-NC和LV-SMAD4-NC)获自GenePharma公司(苏州，江苏，中国)。将A549细胞系在96孔板中以5×10 ⁴个细胞/孔的浓度培养，混合并在37℃的条件下在含有5％CO₂的加湿培养箱中培养24小时。然后，取10μl慢病毒原液，用1:10在含有10％FBS的DMEM培养基中稀释，并加入浓度为5μg/ml的Polybrene。接下来，在96孔板中吸出培养基，并向每个孔中加入上述100μl稀释的病毒溶液，并建立空白对照组，在上述条件下孵育24小时。最后，从96孔板中吸出稀释的病毒溶液，每孔加入100μl含10％FBS的DMEM培养基培养72h或96h，在光学显微镜下观察慢病毒感染效率(x100放大倍数；DM2500；Leica，Wetzlar，Germany)和荧光显微镜(BX51；Olympus Corporation，Tokyo，Japan)。然后，我们建立了嘌呤霉素的浓度梯度(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0μg/ml；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)筛选完全杀死细胞的最佳嘌呤霉素浓度。最后，通过RT-PCR和Western Blotting验证稳定的细胞系。使用的SMAD4基因序列是GENE ID：NM_005359.5。

1.3MiR-431模拟物、抑制剂和相应的对照转染细胞

miR-431抑制剂和MiR-431模拟物，miR-431抑制剂和相应的对照(模拟-nc和抑制剂-nc)由RiboBio公司(广东，广州，中国)合成。根据制造商的说明，用miR-431模拟物、miR-431抑制剂和相应的阴性对照Lipofectamine 3000(Invitrogen，Thermo FisherScientific)分别转染稳定的细胞系(LV-SMAD4+，LV-SMAD4-)。混合物A含有125μlDMEM和5μlLipofectamine3000.混合物B含有125μlDMEM和10μl模拟物或抑制剂或相应的对照。首先将两种混合物在室温下静置10分钟，然后混合并再放置10分钟。然后将复合物加入6孔板的每个孔中，培养24小时。最后，吸出Lipofectamine 3000混合物，并加入补充有10％FBS的DMEM培养48小时。简而言之，将细胞接种在用50nM模拟物或100nM抑制剂转染的6孔板中，孵育48或72小时以进行RNA或蛋白质提取。使用的miR-431序列是：登录号NO.MIMAT0001625。

1.4RNA提取及RP-PCR

cDNA合成和RT-PCR通过Trizol试剂(Invitrogen；Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)从细胞中分离总RNA。通过NanoDrop2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA)检测RNA浓度。根据制造商的说明书，用逆转录酶(用于qPCR的IIQ SelectRT SuperMix(R232-01，Vazyme，Nanjing，Jiangsu，China))将miR-431转化为cDNA[4μl5×HiScript II Select qRT SuperMix，1μlmiR-431-引物(50ng/μl)，1μgRNA]。miR-431的RT-引物由表1中列出的GENEray Biotech CO.LTD(中国上海)设计和合成。使用逆转录酶IIQ将从A549细胞分离的1μgRNA逆转录成cDNA。根据制造商的说明[4μl5×HiScript II Select qRT SuperMix，1μgRNA]选择RT SuperMix用于qPCR(R222-01，Vazyme，南京，江苏，中国)。

逆转录(RT)反应在37℃下进行15分钟，在85℃下进行2分钟。接下来，根据制造商的说明书[1μlcDNA，5μlGreenMaster Mix(Low Rox Premixed)，0.2μl反向)，用qPCR(Q131-01，Vazyme，Nanjing，Jiangsu，China)进行RT-PCR反应。在ABI 7500热循环仪(AppliedBiosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.Wilmington，DE，USA)上加入正向引物和3.6μl二乙基碳酸酯(DEPC)水，反应条件包括在95℃下进行5分钟的初始步骤，在90℃下进行40个循环15秒，在60℃下进行15个循环，在72℃下进行1分钟，最后在72℃下循环10分钟。U6用作miR-431的内部对照。GAPDH用作其他人的内部对照(SMAD4，BMP4，SP)。使用的所有引物序列均由表I中列出的GENEray Biotech CO.LTD(中国上海)设计和合成。使用2-ΔΔCT方法测量相对mRNA表达(17)。

1.5蛋白质印迹分析

收获细胞并在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物(Beyotime，Shanghai，China)的RIPA缓冲液(Beyotime，Shanghai，China)中裂解。在4℃温育10分钟后，将总裂解物在4℃下以1400g离心15分钟，然后提取上清液。用二辛可宁酸(BCA)蛋白质定量(Beyotime，Shanghai，China)测定蛋白质浓度。然后，在100℃下加入2μl5×SDS-PAGE(Beyotime，中国上海)上样缓冲液至8μl上清液10min。通过10％SDS-PAGE电泳(Bio-RadLaboratories，USA)分离每孔约40μg蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯膜聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Massachusetts，USA)，用TBST缓冲液中的5％脱脂奶粉封闭。1小时，然后在4℃下用一抗进行免疫印迹过夜。用TBST洗涤四次后，将膜与HRP-缀合的抗兔二抗(1：2000,7074，Cell Signaling Technology)在室温下进一步温育2小时。最后，通过增强化学发光(ECL)系统进行免疫检测，再用TBST进行四次。所有抗体for western blotting，包括：抗Smad4(1：1000,46535，Cell Signaling Technology)，抗BMP4(1：10000，ab124715，Abcam)，抗SP-A(1：1000，sc-80621，SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)，抗SP-B(1：1000，sc-133143，SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)，抗ProSP-C(1：500，批号：2464523，Millipore)和抗β-肌动蛋白(1：5000，4967，Cell Signaling Technology)。

1.6统计分析

所有数据均表示为平均值±标准偏差。同时，通过SSPSS 17.0和GraphPad Prism5.0统计软件包分析数据，并通过两组之间的t检验进行评估。P值<0.05被认为是统计学显着的。

2.结果

SMAD4对SPS和BMP4/activin/TGF-β信号通路表达的影响用显微镜观察最佳嘌呤霉素浓度为1.2μg/ml(图1.A)，72h和96h后用显微镜观察慢病毒感染效率(图1B)。为了证实A549中LV-SMAD4+，LV-SMAD4-和NC的转染效率，通过RT-PCR和蛋白质印迹证实了相对SMAD4表达。与LV-SMAD4+-NC相比，LV-SMAD4+转染显着增加SMAD4在细胞中的表达，并且LV-SMAD4-与LV-SMAD4-NC相比显着降低SMAD4的表达(图2A和图3B)。此外，为了探索SMAD4是否通过BMP4/激活素/TGF-β信号通路在SPs合成中起作用，通过RT-PCR测定SPs(SP-A，SP-B和SP-C)和BMP4的表达。在本研究中，SP(SP-A，SP-B和SP-C)和BMP4通过RT-PCR在LV-SMAD4-细胞中显示更高的表达。相反，通过RT-PCR，与LV-SMAD4+-NC细胞相比，LV-SMAD4+细胞中SP和BMP4的表达降低(图2)。为了在蛋白质水平确认这种效果，收获具有慢病毒的稳定细胞系用于蛋白质印迹分析。我们通过蛋白质印迹试验观察到了类似的趋势，尽管差异不如RT-PCR显示的那么显着(图3)。此外，当通过RT-PCR实验增加SMAD4的表达时，还发现miR-431减少(图2)。

先前的研究已经证明miR-431可能通过靶向SMAD4负向调节肺发育。基于此，本发明确定了miR-431是否通过BMP4/激活素/TGF-β信号通路在用SMAD4处理的A549细胞系中抑制SPs合成。在我们的研究中，用miR-431模拟物与LV-SMAD4-组合处理的细胞在mRNA水平上显示出比miR-431模拟物nc更高的BMP4表达和更低的SP表达。相反，用miR-431抑制剂与LV-SMAD4-组合处理的细胞在mRNA水平上显示出比miR-431抑制剂-nc更低的BMP4表达和更高的SP表达(图4)。同时，我们在蛋白质水平上获得了相同的趋势(图5)。同样地，miR-431与LV-SMAD4+的过表达显示SPs的表达下降，BMP4的表达在mRNA和蛋白水平上升，并且用LV-SMAD4+抑制miR-431表明SP的表达增加并且BMP4的表达在mRNA和蛋白水平下降。此外，我们在LV-SMAD4+细胞中转染miR-431后重新测量了SMAD4的表达，发现miR-431下调SMAD4的表达(图6和图7)。