阅读说明：本技术 Dyngo-4a和/或Dynasore在制备抗轮状病毒腹泻药物中的应用 (Application of Dyngo-4a and/or Dynasore in preparation of anti-rotavirus diarrhea medicine ) 是由 吴叔文 蓝柯 张全志 于 2019-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了Dyngo-4a和/或Dynasore在制备抗轮状病毒腹泻药物中的应用。所述抗轮状病毒腹泻药物包括含Dyngo-4a和/或Dynasore的药理或生理上可接受的盐、含Dyngo-4a和/或Dynasore的药学上可接受的载体或赋形剂。本发明提供的Dyngo-4a和Dynasore两种小分子化合物可以有效抑制轮状病毒的感染和复制,其对细胞的毒性小,可用于制备抗轮状病毒腹泻药物,适于临床推广。(The invention provides application of Dyngo-4a and/or Dynasore in preparing medicaments for resisting rotavirus diarrhea. The rotavirus diarrhea resisting medicine comprises pharmacologically or physiologically acceptable salt containing Dyngo-4a and/or Dynasore and pharmaceutically acceptable carrier or excipient containing Dyngo-4a and/or Dynasore. The Dyngo-4a and Dynasore micromolecule compounds provided by the invention can effectively inhibit infection and replication of rotavirus, have low toxicity to cells, can be used for preparing anti-rotavirus diarrhea medicines, and are suitable for clinical popularization.)

Dyngo-4a和/或Dynasore在制备抗轮状病毒腹泻药物中的 应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及Dyngo-4a和/或Dynasore在制备抗轮状病毒腹泻药物中的应用。

背景技术

轮状病毒腹泻(rotavirus diarrhoea)是由轮状毒引起的急性传染病，主要感染哺乳动物和鸟类，包括人和家畜、家禽，导致牛、猪、马、绵/山羊、兔、鹿、鼠、鸡、鸭、鸽、鹌鹑等多种动物的新生儿及其幼畜发生急性胃肠炎，是人和动物新生儿死亡的重要原因，每年可导致全球范围内的20万婴幼儿死亡；成年的人和动物也可被感染，但一般无症状或症状较轻；每年大约2400万人由于轮状病毒感染而需要就医，其中的大约230万人需要住院治疗；感染动物时，除动物死亡造成直接经济损失外，动物在患病期间生长停滞也可造成较大的经济损失。

轮状病毒腹泻病源是轮状病毒(rotaviruses,RV)。RV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)成员。到目前为止，已发现了10类RV(A–J)，其中A型轮状病毒基本占所有轮状病毒感染和致死病例的90％左右；根据轮状病毒糖蛋白(VP7，标示为“G”)和宿主蛋白酶靶标(VP4，标示为“P”)的差异，A型轮状病毒通常被命名为GiP[j]，如G1P[8]毒株；已知的A型轮状病毒G蛋白有32种、P蛋白有47种，但在全球范围内比较流行的A型轮状病毒G蛋白亚型主要有G1、G2、G3、G4、G9和G12，P蛋白亚型主要有P[4]、P[6]和P[8]，主要流行的毒株为G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[8]和G12P[8]。血清型间无交叉免疫现象。

目前轮状病毒腹泻尚无特效治疗手段，临床主要采取对症治疗，通常以防止病患过分脱水为治疗手段；疫苗方面，截止2017年，我国口服轮状病毒疫苗的接种率通常不到10％(2017年我国出生人口1723万人，当年兰州所单价口服轮状病毒疫苗的批签发量为484万支，口服轮状病毒疫苗采用三剂口服免疫程序)，采用疫苗来预防轮状病毒腹泻存在覆盖率不足的缺陷；因此有必要研究新的抗病毒策略以应对该疾病的威胁。一些科研工作者尝试采用红酒提取物、小分子氯离子通道抑制剂等来防控轮状病毒腹泻，虽然在细胞或动物水平取得一些进展，但却都未能投入使用。

目前较少有采用化学小分子来防控轮状病毒腹泻的报道，因此获得一些能够较好抑制轮状病毒感染的活性化合物对于研制轮状病毒腹泻药物是十分有利的。

发明内容

本发明的目的在于提供Dyngo-4a和/或Dynasore在制备抗轮状病毒腹泻药物中的应用，所述Dyngo-4a和/或Dynasore对细胞的毒性小，在轮状病毒腹泻的预防和治疗方面有一定的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

Dyngo-4a和/或Dynasore在制备抗轮状病毒腹泻药物中的应用。

所述抗轮状病毒腹泻药物包括含Dyngo-4a和/或Dynasore的药理或生理上可接受的盐。

所述抗轮状病毒腹泻药物包括含Dyngo-4a和/或Dynasore的药学上可接受的载体或赋形剂。

所述Dyngo-4a结构式如下，

所述Dynasore结构式如下，

本发明通过实验研究证实Dyngo-4a和Dynasore两种小分子化合物能抑制轮状病毒胞浆运输过程，从而抑制轮状病毒的感染、复制和再感染，体外实验证实其细胞毒性小，对轮状病毒显示出非常好的抗病毒活性和非常高的选择性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所提供Dyngo-4a和Dynasore两种小分子化合物可以有效抑制轮状病毒的感染入胞和新生病毒粒子出胞，其对细胞的毒性小，可用于制备抗轮状病毒腹泻药物，克服了现有防控轮状病毒腹泻手段存在的缺陷与不足；并可经临床试验验证后进一步广泛推广至人及家畜、家禽等的轮状病毒腹泻防治，支持公共卫生以及畜牧业的进一步发展。

附图说明

图1为本发明中Dyngo-4a的细胞毒性测定结果图；

图2为本发明中Dynasore的细胞毒性测定结果图。

具体实施方式

通过以下详细说明和附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明进一步的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例】Dyngo-4a、Dynasore生物活性测试

1、Dyngo-4a、Dynasore细胞毒性测定:

CCK-8试剂中含有WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)是一种类似于MTT的化合物，它在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物Formazan，生成的Formazan数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。

实验时，将MA-104细胞以每孔2×10⁴的密度传至96孔板中，在37℃培养24小时后，吸走培养基，分别将含有多种浓度梯度化合物(Dyngo-4a或Dynasore)药物的细胞培养基加到每个孔(DMSO,0.98μM,1.95μM,3.91μM,7.81μM,15.63μM,31.25μM,62.5μM,125μM,250μM,500μM)，同时做空白对照(具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度)、阴性(0加药)对照(具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度)；24小时后，每孔加入10μl的CCK-8试剂，细胞板在37℃的CO₂孵化器中培养4h，酶标仪测定450nm波长下的OD值。细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100，其中：A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液(Dyngo-4a或Dynasore)的孔的吸光度，A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度，A(0加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。化合物的半数抑制浓度(CC₅₀)作为该化合物细胞毒性的指标。

2、Dyngo-4a、Dynasore抗轮状病毒(RV)活性实验：

通过MA-104细胞感染后上清病毒产量的减少来评估化合物的抗病毒活性。用含有多种浓度梯度的轮状病毒去感染铺满MA-104细胞的96孔板，1小时后除去含病毒培养基并分别加入含有特定浓度待测药物(Dyngo-4a或Dynasore)的培养基(DMSO,0.98μM,1.95μM,3.91μM,7.81μM,15.63μM,31.25μM,62.5μM,125μM,250μM,500μM)。在37℃、5％CO₂条件下培养48小时后，取细胞培养液提取上清病毒的总RNA，经逆转录后对其进行qPCR定量，其相对Ct值反映了RV感染后细胞培养上清中病毒的相对数量，可以反映药物对病毒感染和复制的影响。EC₅₀是指特定药物有效抑制细胞培养上清中病毒产生量至对照孔的50％所需的浓度。

3、Dyngo-4a、Dynasore细胞毒性测定以及抗RV活性实验结果：

结果如下表1所示，

表1

Compounds	EC<sub>50</sub>(μM)	CC<sub>50</sub>(μM)	SI(CC<sub>50</sub>/EC<sub>50</sub>)
				Dyngo-4a	1.2	213	178
Dynasore	2.1	471	224

结果表明：化合物Dyngo-4a、Dynasore能抑制轮状病毒胞浆运输过程，有效抑制轮状病毒的感染入胞和新生病毒粒子出胞，从而抑制轮状病毒的感染、复制和再感染，显示出非常好的抗轮状病毒活性和非常高的选择性；同时，由细胞毒性(CC₅₀)数据(图1、图2)可知，Dyngo-4a、Dynasore对细胞毒性小，因此这两种化合物在轮状病毒腹泻的预防和治疗方面有很强的应用前景。