阅读说明：本技术 一种新型孢子鞭毛染色液以及染色观察方法 (Novel spore flagellum staining solution and staining observation method ) 是由 史娟 姜粉霞 马新 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种新型孢子鞭毛染色液以及染色观察方法。所述的染色液为番红或者固绿。一种新型孢子鞭毛染色观察方法,其特征在于,首先材料需要再15度低温下预培养1.5h,室温下进行染色处理后置于20℃培养箱中染色30min,取出冲洗多余的染色液,吸干边缘多余的液体,置于显微镜下观察,可清晰地观察到游动孢子的孢子鞭毛。建立霜霉病菌游动孢子鞭毛的染色技术,可为霜霉病菌游动孢子发育机制、靶向运动等相关研究提供支持。该方法具有操作步骤简单,容易掌握,鞭毛观察明显,且不需要特殊设备即可进行。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to a novel spore flagellum staining solution and a staining observation method. The staining solution is safranin or fast green. A novel spore flagellum dyeing observation method is characterized in that firstly, materials need to be pre-cultured for 1.5h at low temperature of 15 ℃, the materials are placed in an incubator at 20 ℃ for dyeing for 30min after being dyed at room temperature, the excess dyeing liquid is taken out and washed, the excess liquid on the edge is sucked dry, and the materials are placed under a microscope for observation, so that the spore flagellum of zoospores can be observed clearly. The establishment of the dyeing technology of the flagella of the downy mildew zoospores can provide support for the relevant researches such as the development mechanism, the targeted movement and the like of the downy mildew zoospores. The method has the advantages of simple operation steps, easy mastering, obvious flagellum observation and no need of special equipment.)

一种新型孢子鞭毛染色液以及染色观察方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种新型孢子鞭毛染色液以及染色观察方法。

背景技术

霜霉菌在分类学上隶属于卵菌。是一类形态和侵染特征与真菌类似的真核微生物。霜霉菌能够侵染许多重要的农作物，引起的霜霉病常常给农户造成巨大的经济损失。

游动孢子是霜霉病菌最重要的侵染接种体，游动孢子依靠鞭毛进行运动并靶向寄主植物细胞,一旦接触到寄主植物,即迅速休止并开始萌发，萌发的芽管往往形成附着胞类似结构,以利于进一步侵入寄主植物。因此，游动孢子鞭毛的观察不仅是霜霉病菌生物学基础研究中的重要内容，而且对于对于游动孢子发育机制的研究提供重要的依据。由于鞭毛是附属结构，纤细，光学显微镜下不易观察到，因此，寻求简单易操作，观察效果明显的染色方法，对霜霉病菌游动孢子发育进而形成静止孢子的机制研究是必须的，同时为深入研究鞭毛发育机制、超微结构等提供重要的观察方法。细菌的鞭毛是重要的运动器官，细菌鞭毛的有无对于细菌的分类和鉴定是必须的，因此针对细菌的鞭毛染色技术很多。但是，卵菌不是原核微生物，由于卵菌的游动孢子没有细胞壁，故现有的针对细菌鞭毛的染色方法并不能适用于霜霉病菌游动孢子鞭毛的染色观察。

发明内容

发明的目的：为了提供一种效果更好的新型孢子鞭毛染色液以及染色观察方法，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。

为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：

一种新型孢子鞭毛染色液，其特征在于，所述的染色液为番红或者固绿。

一种新型孢子鞭毛染色观察方法，其特征在于，首先材料需要再15度低温下预培养1.5h，室温下进行染色处理后置于20℃培养箱中染色0.5h，取出冲洗多余的染色液，吸干边缘多余的液体，置于显微镜下观察，可清晰地观察到游动孢子的孢子鞭毛。

本发明进一步技术方案在于，包含如下步骤，

染色液的配置配制：称取番红0.1g溶入蒸馏水中，定溶至100ml，装入棕色滴瓶中，贴上标签备用；称取0.1g固绿溶入95％乙醇中，定溶至100ml，待全部溶解后转移入棕色滴瓶中，贴标签备用；

霜霉病菌的预培养：将田间采集的霜霉病叶在15-20度培养箱中进行保湿培养12h；采集标准：采集叶片正面具有鲜黄色的多角形病斑，叶背具有灰色至灰黑色或黑色的霜霉层即霜霉病菌的孢子囊梗或孢子囊，迅速装入保湿袋中，防止叶片失水，影响孢子囊；或者是下午待太阳落山前进行霜霉病叶片采集，迅速装入保湿袋中，防止叶片失水；带回实验室，叶柄用浸透蒸馏水的棉花包裹严实，放入15cm底部铺有饱和水分的滤纸的培养皿中进行保湿培养，放入20度培养箱中保持培养12h；

孢子悬浮液的制备：将预培养的霜霉病菌，用洁净的毛笔刷轻轻刷取霉层即病菌的孢子囊，避开叶片表皮细胞置于凹玻片上的灭菌水中，反复2-3次，盖上盖玻片，放入9cm的培养皿中保湿0.5h，≤26℃的室温环境；

染色：用滴管吸取染色液，滴在凹玻片一边，适度倾斜，让染液进入凹玻片的灭菌水中，待凹玻片中的悬浮液呈均匀的红色和蓝色，放入培养皿中，置于20度培养箱中染色0.5h；

脱色：将灭菌水沿盖玻片一边缓缓滴入，洗去多余的染色液，用吸水纸擦干盖玻片周围多余的染色液；

显微镜观察：将擦干净的载玻片置于光学显微镜下低倍镜下观察，找到目标后进行高倍镜观察；可清晰地观察到孢子鞭毛；并进行拍照。

本发明进一步技术方案在于，放入15cm底部铺有饱和水分的滤纸的培养皿中进行保湿培养是采用如下专用设计装备完成的，该专用设计装备是保湿培养结构，该保湿培养结构包含相互扣合的培养皿下方1和培养皿上方2，培养皿下方1朝下热合着一个立方体形状的不锈钢滤网5，该不锈钢滤网5中放置有海绵9，在培养皿下方1上包含一个螺纹孔，还包含穿过该螺纹孔的手持轴6；手持轴6为螺纹轴，转动手持轴就能够让手持轴下方的挤压板8朝下运动挤压海绵9；挤压的过程中能够让海绵中的水朝下穿过不锈钢滤网5滴到保湿培养结构3上；因此不打开培养皿下方1和培养皿上方2避免空气中的杂菌进入就能加水；

所述的保湿培养结构3包含一个包覆结构，该包覆结构中部包含夹持空间4，夹持空间4为持水材料；

霜霉病叶片能够放置进夹持空间4中使得霜霉病叶片两面都能接触到持水材料。

本发明进一步技术方案在于，所述的持水材料为滤纸。

采用如上技术方案的本发明，相对于现有技术有如下有益效果：建立霜霉病菌游动孢子鞭毛的染色技术，可为霜霉病菌游动孢子发育机制、靶向运动等相关研究提供支持。该方法具有操作步骤简单，容易掌握，鞭毛观察明显，且不需要特殊设备即可进行。游动孢子作为霜霉病菌的无性繁殖体，由孢子囊发育而来，因此，自然条件下存在的时间是非常短暂的。通过该方法可以实现游动孢子鞭毛的观察。

附图说明

为了进一步说明本发明，下面结合附图进一步进行说明：

图1为番红染色；图2为固绿染色；图3为未染色处理的游动孢子鞭毛；图4为本专利专门设计的保湿培养结构；其中：1.培养皿下方；2.培养皿上方；3.保湿培养结构；4.夹持空间；5.不锈钢滤网；6.手持轴；7.垫圈；8.挤压板；9.海绵。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本专利提供多种并列方案，不同表述之处，属于基于基本方案的改进型方案或者是并列型方案。每种方案都有自己的独特特点。

我们参阅了相关的文献，先后采用番红、苯胺蓝、亚甲基蓝、固绿等四种染色剂对霜霉病菌游动孢子进行了鞭毛的染色观察。筛选出番红和固绿2种染色剂用于霜霉病菌游动孢子鞭毛的染色，并获得了比较理想的观察效果。通过2种染色剂染色观察，能清晰的在显微镜下观察到霜霉病菌游动孢子的鞭毛，为观察游动孢子运动规律、不同时期游动孢子鞭毛的变化以及鞭毛形态的观察提供了方法。利用番红、0.5％苯胺蓝、0.1％亚甲基蓝、固绿等四种不同染色剂与游动孢子细胞质结合原理，通过背景反差，清晰的观察到鞭毛。通过鞭毛的清晰度，筛选出番红和固绿2种染色剂染色处理，观察效果最好。关键技术点是首先材料需要再15度低温下预培养1.5h，室温下进行染色处理后置于20℃培养箱中染色0.5h，取出冲洗多余的染色液，吸干边缘多余的液体，置于显微镜下观察，可清晰地观察到游动孢子的鞭毛。目前没有检索到其它替代方案同样能完成本发明。

1染色液的配置配制：称取番红0.1g溶入蒸馏水中，定溶至100ml，装入棕色滴瓶中，贴上标签备用；称取0.1g固绿溶入95％乙醇中，定溶至100ml，待全部溶解后转移入棕色滴瓶中，贴标签备用。

2、霜霉病菌的预培养：将田间采集的霜霉病叶在15-20度培养箱中进行保湿培养12h。采集标准：采集叶片正面具有鲜黄色的多角形病斑，叶背具有灰色至灰黑色或黑色的霜霉层(霜霉病菌的孢子囊梗或孢子囊)，迅速装入保湿袋中，防止叶片失水，影响孢子囊；或者是下午待太阳落山前进行霜霉病叶片采集，迅速装入保湿袋中，防止叶片失水。带回实验室，叶柄用浸透蒸馏水的棉花包裹严实，放入15cm底部铺有饱和水分的滤纸的培养皿中进行保湿培养，放入20度培养箱中保持培养12h。

3、孢子悬浮液的制备：将预培养的霜霉病菌，用洁净的毛笔刷轻轻刷取霉层(病菌的孢子囊，避开叶片表皮细胞)置于凹玻片上的灭菌水中，反复2-3次，盖上盖玻片，放入9cm的培养皿中保湿0.5h(≤26℃的室温)；

4、染色：用滴管吸取染色液，滴在凹玻片一边，适度倾斜，让染液进入凹玻片的灭菌水中，待凹玻片中的悬浮液呈均匀的红色和蓝色，放入培养皿中，置于20度培养箱中染色0.5h；

5、脱色：将灭菌水沿盖玻片一边缓缓滴入，洗去多余的染色液，用吸水纸擦干盖玻片周围多余的染色液；

6、显微镜观察：将擦干净的载玻片置于光学显微镜下低倍镜下观察，找到目标后进行高倍镜观察。可清晰地观察到鞭毛。并进行拍照。

本发明进一步技术方案在于，放入15cm底部铺有饱和水分的滤纸的培养皿中进行保湿培养是采用如下专用设计装备完成的，该专用设计装备是保湿培养结构，该保湿培养结构包含相互扣合的培养皿下方1和培养皿上方2，培养皿下方1朝下热合着一个立方体形状的不锈钢滤网5，该不锈钢滤网5中放置有海绵9，在培养皿下方1上包含一个螺纹孔，还包含穿过该螺纹孔的手持轴6；手持轴6为螺纹轴，转动手持轴就能够让手持轴下方的挤压板8朝下运动挤压海绵9；挤压的过程中能够让海绵中的水朝下穿过不锈钢滤网5滴到保湿培养结构3上；因此不打开培养皿下方1和培养皿上方2避免空气中的杂菌进入就能加水；

所述的保湿培养结构3包含一个包覆结构，该包覆结构中部包含夹持空间4，夹持空间4为持水材料；

霜霉病叶片能够放置进夹持空间4中使得霜霉病叶片两面都能接触到持水材料。本处的技术方案所起到的实质的技术效果及其实现过程为如下：现有技术的缺陷是，培育的时候，需要不断打开培养皿，需要不断加水，忘记加水的话，培养效果就不好；本专利直接采用不打开培养皿下方1的方式加水，避免空气中的杂菌进入。

另外，本专利的夹持空间4的存在使得叶子两面都能持水培养，避免了原来的培养的时候有时搞不清叶子哪一面有可培养的菌种的问题造成培养失误。

所述的持水材料为滤纸。

需要说明的是，本专利提供的多个方案包含本身的基本方案，相互独立，并不相互制约，但是其也可以在不冲突的情况下相互组合，达到多个效果共同实现。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。