阅读说明：本技术 一种基于双细胞水平的皮肤光刺激性评价方法 (Skin light irritation evaluation method based on double-cell level ) 是由 黄健聪 程树军 冯鉴鸿 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于双细胞水平的皮肤光刺激性评价方法,包括以下步骤：(1)获取离体正常人皮肤角质细胞和成纤维细胞,进行细胞铺板；(2)取细胞铺板,去除上部培养液,分别加入一系列不同浓度的受试物,置于UV下进行辐照,记为UV+,在暗处放置相同时间,记为UV-；(3)暴露结束后,测试受试物在不同浓度下的细胞活性,计算IC<Sub>50</Sub>值,获取角质细胞和成纤维细胞IC<Sub>50</Sub>值(UV+)和IC<Sub>50</Sub>值(UV-)；(4)计算光刺激比值,根据该比值,将受试物分为非皮肤光刺激物、可疑皮肤光刺激物和皮肤光刺激物。该法具有快速、通量高、可重复性良好、与人相关性高等优点,可对多种受试物进行快速评价,大大减少了实验动物的使用。(The invention discloses a skin light irritation evaluation method based on a double-cell level, which comprises the following steps of: (1) obtaining in vitro normal human skin keratinocytes and fibroblasts, and performing cell plating; (2) taking a cell plate, removing the upper culture solution, respectively adding a series of test substances with different concentrations, placing under UV for irradiation, and recording as UV +, placing in a dark place for the same time, and recording as UV-; (3) after exposure, the test substance was tested for cellular activity at different concentrations and IC was calculated 50 Value, obtaining keratinocyte and fibroblast IC 50 Value (UV +) and IC 50 Value (UV-); (4) calculating a ratio of light stimuli, and classifying the test substance into a non-skin light stimulus, a suspected skin light stimulus and a skin light stimulus according to the ratio. The method has the advantages of high speed, high flux, good repeatability, high correlation with human and the like, can quickly evaluate various tested substances, and greatly reduces the use of experimental animals.)

一种基于双细胞水平的皮肤光刺激性评价方法

技术领域

本发明属于非动物测试方法技术领域，具体涉及一种基于双细胞水平的皮肤光刺激性评价方法。

背景技术

某些化合物，称为光感物质，在光照(主要是紫外线)的作用下由稳定态转化为激发态，进而对细胞组织产生有害作用。皮肤覆盖于人体表面，是人体与外界环境最外的屏障。而皮肤作为与紫外线直接接触的器官，皮肤表面涂抹的药物、化妆品等，可引起光刺激性，通常表现为受到照射的部位皮肤瘙痒、疼痛、红肿，出现鲜红色丘疹和水疱，严重者甚至会导致皮肤组织坏死等损伤。

日常接触的化学物质中，沥青、煤焦油、燃料等，化妆品香料中佛手柑精油、柠檬油、檀香油等，植物中的柠檬、苋菜、香菜等，中药中的补骨脂、白芷、防风等，还有药物类的磺胺、氯丙嗪、水杨酸盐类及口服避孕药中的***等都是光感物质，都可以引起皮肤甚至全身光反应性。

现有的皮肤光毒性评价方法为豚鼠动物实验，在豚鼠皮肤涂抹受试物后进行光照，观察辐照后皮肤的红斑水肿进行评价和预测。但是其主观性/重复性差、物种差异、周期长、成本高、通量低、使用活体动物造成动物痛苦死亡等不足，已经逐步被现代毒理学所淘汰。目前，以体外技术为核心的试验方法，逐渐被许多国家和地区的监管部门所接受和认可。基于细胞水平的3T3光毒性试验，为多方监管机构接受，并广泛应用于光毒性评价，但是其具由较高的假阳性率，采用小鼠来源的细胞，且并不特异性针对皮肤局部光刺激性，仍具有一定的局限性。目前仍未有公认的专门用于皮肤光刺激性的体外测试方法。

人体皮肤主要由表皮角质层和真皮成纤维细胞组成，研究指出，UVA辐照可达真皮层，其主要作用于角质层和真皮层，而UVB主要作用于表皮层，并未达到真皮层。且离体皮肤分离角质细胞和成纤维可以在体外培养并产生相应的生物学功能，已经广泛应用于各类皮肤相关的安全和功效评价中。

发明内容

本发明目的是提供一种基于双细胞水平的皮肤光刺激性评价方法，该方法通过两种皮肤相关细胞，角质细胞和成纤维细胞，分析在有无紫外辐照下，通过测量细胞存活的情况，评价待测物质是否具有皮肤光刺激性，具有快速、简便、通量高、与人相关性高等特点，可以对多种受试物进行快速评价，大大减少了实验动物的使用。

本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于双细胞水平的皮肤光刺激性评价方法，包括以下步骤：

(1)获取离体正常人皮肤角质细胞和成纤维细胞，采用常规培养液培养和鉴定后分别进行细胞铺板；

(2)取步骤(1)中细胞铺板，去除上部培养液，保留底部的角质细胞和成纤维细胞，分别加入一系列不同浓度的受试物，预处理后置于UV下进行辐照，记为UV+，在暗处放置相同时间，记为UV-；

(3)暴露结束后进行重新培养，然后测试受试物在不同浓度下的细胞活性，计算IC₅₀值，即引起一半细胞抑制的浓度，获取角质细胞和成纤维细胞IC₅₀值(UV+)和IC₅₀值(UV-)；

(4)计算光刺激比值RPV＝IC₅₀(UV-)/IC₅₀(UV+)，根据该比值，将受试物区分为非皮肤光刺激物、可疑皮肤光刺激物和皮肤光刺激物，具体如下：

在上述基于双细胞水平的皮肤光刺激性评价方法中：

可选地，步骤(1)中所述离体正常人皮肤角质细胞和成纤维细胞来源于手术分离的皮肤组织。

本发明中因为细胞来源于正常人体皮肤，故实验结果能够较真实地反映正常人皮肤组织中的两种主要细胞(成纤维细胞、角质细胞)对受测试物质的光损伤效果，该方法也可以作为现有动物光毒性实验和细胞光毒性实验的补充。

可选地，步骤(1)中细胞铺板时：将角质细胞细胞和成纤维细胞分别以(0.5-2)×10⁵个/mL的密度接种于96孔板中，培养箱培养过夜18-22h，培养条件37±0.5℃，(5±1)％CO₂浓度，饱和湿度，每种细胞制备相同的两块96孔板。

可选地，步骤(2)中所述的受试物化学物质、表面活性剂、化妆品香料、植物、植物提取物、中药、中药提取物和西药中的一种或几种。

进一步地，步骤(2)中所述的化学物质为盐酸氯丙嗪(CPZ)等，表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SLS)等。

可选地，步骤(2)中所述一系列不同浓度的受试物为梯度设置，每种受试物设置6-12个浓度。

可选地，步骤(2)中所述一系列不同浓度的受试物可以采用缓冲液稀释获得，所述缓冲液可以为Hank's平衡盐溶液(HBSS)、含钙镁离子的磷酸盐缓冲液(DPBS)或磷酸盐缓冲液(PBS)等。

可选地，步骤(2)中所述预处理为返回培养箱中继续培养0.5-6h。

可选地，步骤(2)中置于UV下进行辐照时，成纤维细胞辐照剂量为UVA2-12J/cm²；角质细胞辐照剂量为UVA 2-12J/cm²或UVB100-1000mJ/cm²。

本发明方法利用两种人体皮肤细胞，同时暴露于受试物和UV辐照下，通过分析有无UV辐照后，测量细胞活性，反应受试物在有无UV辐照下对细胞的损伤程度，预测受试物质是否为皮肤光刺激物。

可选地，步骤(3)中重新培养时，先清洗细胞层1～3次，再重新加入培养液，培养箱中培养20±2h，然后测量受试物不同浓度下细胞活性。

可选地，步骤(3)中测量受试物在不同浓度下的细胞活性时，采用MTT、XTT、中性红或CCK-8方法，计算不同浓度下相对细胞活性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明方法使用人源皮肤组织，其分离的细胞可以维持相应的生物学功能，具有科学性和人体相关性；

(2)本发明方法通过两种皮肤的主要细胞进行测试，避免的单一细胞的局限性，接近于实际暴露情况；

(3)本发明建立的方法可以直接用于评价皮肤表面应用的药物、原料，或皮肤接触类产品成分的皮肤光刺激性评价；

(4)本发明方法具有通量高、可重复、与人相关性高、多指标评价等优点，可以对多种受试物进行快速评价，并大大减少了实验动物的使用。

附图说明

图1是实施例1中细胞形态学观察，其中A角质细胞，B成纤维细胞；

图2是实施例1中CPZ测试结果，其中A角质细胞，B成纤维细胞；

图3是实施例1中SLS测试结果，其中A角质细胞，B成纤维细胞；

图4是实施例2中受试样品测试结果，其中A角质细胞，B成纤维细胞。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的基于双细胞水平的皮肤光刺激性评价方法，包括以下步骤：

1、实验的准备

1.1正常人无菌皮肤标本(约4cm²)；

1.2培养液：

成纤维细胞：含10％胎牛血清的DMEM培养基；

角质细胞：Keratinocyte-SFM无血清培养液；

1.3其他试剂：0.25％胰酶-EDTA、HBSS、PBS缓冲液、75％消毒酒精、DispasesⅡ、MTT溶液、DMSO、盐酸氯丙嗪(CPZ)、十二烷基硫酸钠(SLS)；

1.4培养条件：温度37±1℃，5％CO₂浓度，饱和相对湿度；

2试验过程

2.1细胞分离和体外培养

2.1.1皮肤处理：将外科手术环切下的幼儿新鲜***用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.01mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2-3次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和***；将清洗干净的***剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；将皮片展开，表皮朝向上方浸泡于质量浓度0.25％的裂解酶(DispasesⅡ)中分离表皮和真皮，方式有37℃消化2±0.5小时或是4℃过夜12-18小时；分离：将分离的皮片从裂解酶(DispasesⅡ)中取出，用镊子轻轻将表皮和真皮分离，

2.1.2角质细胞分离：将表皮收集在含有双抗的PBS中反复清洗2-3次，用已经灭菌的眼科手术剪彻底将组织剪碎；将表皮剪碎后置于0.25％胰酶-EDTA，37℃消化15min，期间多次吹打辅助解离细胞。消化结束离心收集细胞，重复2次。用200目过滤器进行过滤并计数。将细胞重悬后置于培养瓶中放入培养箱培养。需要3-5天可长满。

2.1.3成纤维细胞分离：将真皮收集在含有双抗的PBS中反复清洗2-3次，用已经灭菌的眼科手术剪彻底将真皮组织剪碎；将剪碎的真皮组织放入培养瓶中，均匀铺开，加入少量的培养基，待成纤维细胞爬出后去除组织碎片，加入含有10％新生牛血清的DMEM培养基培养。待细胞稳定后3天传代一次。

2.1.4角质细胞鉴定：形态学观察，角蛋白染色

2.1.5成纤维细胞鉴定：形态学观察，波形蛋白染色

2.2受试物配制

SLS用HBSS配制100mg/mL浓度，使用前用HBSS稀释至10mg/mL作为最高测试浓度，以3.16倍依次稀释7个浓度。

CPZ用乙醇溶解后，使用前用HBSS稀释0.1mg/mL作为最高测试浓度，依次稀释7个浓度。

2.3细胞铺板

将细胞以0.8*10⁵/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μL，放置培养箱培养18-22h。每种细胞制备2块96孔板，每块96孔板接种中间60孔，四周孔以PBS填充。

2.4受试物预处理

取出96孔板，去除原培养液(保留底部的角质细胞和成纤维细胞)，将受试物以HBSS稀释8个浓度后，每孔100μL加入培养板中，同时设置对照组(不含受试物)和溶剂对照组。返回培养箱预处理1.5h。

2.5光暴露

预处理结束，随机取出1块角质细胞和成纤维细胞的培养板，置于UV下进行辐照(UV+)，成纤维细胞辐照剂量UVA 3J/cm²、角质细胞辐照剂量UVB 500mJ/cm²，另一块培养板在暗处(UV-)放置相同时间。

辐照结束后，用DPBS清洗细胞层2次，重新加入新鲜培养液，培养箱中培养20±1h。到达规定的培养时间后，采用测量细胞活性的方法，如MTT/XTT/中性红/CCK-8等，以对照组为100％，计算各浓度下相对细胞活性。本实施例中采用MTT法。

2.6细胞活性测量

观察细胞状态，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)，培养箱中放置3h。取出培养板，去除含MTT的培养液，各孔加入150μL DMSO，避光室温下振荡15min，溶解甲瓒，在570nm波长下测定吸光度值。以对照组细胞活性为100％，计算各浓度下细胞活性，结果以均值±标准差表示。

MTT英文全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumro mide，化学名称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料，MTT比色法是一种常用检测细胞存活和生长的方法。

通过相对细胞活性，采用非线性回归计算IC₅₀值，即引起一半细胞抑制的浓度，获得角质细胞和成纤维细胞的IC₅₀(UV+和UV-)，共4个IC₅₀值。通过计算光刺激比值(ratio ofphoto-irritation value，RPV)＝IC₅₀UV+/IC₅₀UV-。每次试验需至少重复2次，且获得一致的预测结果时方可下判定。

其他情况可预测为可疑皮肤光刺激物，通常需要追加第三次试验或者结合其他类型的试验/数据进行预测，本发明中暂不作这部分工作。

3结果

3.1：角质细胞：在光镜下观察到角质形成细胞成多角形或不规则形，如“铺路石”样，呈典型上皮样特征，高核浆比例，细胞紧密排列，轮廓清楚折光性好。从形态学上可确定为角质细胞。(见图1)。采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈角质蛋白阳性。

成纤维细胞：在光镜下成纤维细胞胞体呈梭形或三角形，有2～3个长短不一的突起，胞核椭圆形，位于胞体中间，细胞汇合后，排列紧密，呈典型漩涡状、放射状走行(见图1)。采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈Vimentin阳性。

3.2细胞毒性结果

CPZ测试结果见表1和图2。

表1 CPZ测试结果

SLS测试结果见图3和表2。

表2 SLS测试结果

3.3结论

根据表1和表2中结果预测：CPZ为皮肤光刺激物，SLS为非皮肤光刺激物。

实施例2

本实施例提供的基于双细胞水平的皮肤光刺激性评价方法，包括以下步骤：

1、实验的准备

1.1人原代皮肤角质细胞和人原代皮肤成纤维细胞

1.2培养液：成纤维细胞：含10％胎牛血清的DMEM培养基

角质细胞：Keratinocyte-SFM无血清培养液

1.3其他试剂：0.25％胰酶-EDTA、HBSS、PBS缓冲液、75％消毒酒精、MTT溶液、DMSO、样品1(某种植物叶子提取物)。

1.4培养条件：温度37±1℃，5％CO₂浓度，饱和相对湿度

2试验过程

2.1受试物配制

受试物(样品1)用HBSS配制成200mg/mL浓度，使用前用HBSS稀释至100mg/mL，随后以10倍梯度稀释，共设置9个测试浓度。

2.2细胞铺板

将细胞以0.8*10⁵/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μL，放置培养箱培养18-22h。每种细胞制备2块96孔板，每块96孔板接种中间60孔，四周孔以PBS填充。

2.3受试物预处理

取出96孔板，去除原培养液，将受试物以HBSS稀释9个浓度后，每孔100μL加入培养板中，同时设置培养液对照组和溶剂对照组。返回培养箱预处理1.5h。

2.4光暴露

预处理结束，随机取出1块角质细胞和成纤维细胞的培养板，置于UV下进行辐照(UV+)，成纤维细胞辐照剂量UVA 3J/cm²、角质细胞辐照剂量UVB 500mJ/cm²，另一块培养板在暗处(UV-)放置相同时间。

辐照结束后，用DPBS清洗细胞层2次，重新加入新鲜培养液，培养箱中培养20±1h。

2.5细胞活性测量

观察细胞状态，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)，培养箱中放置3h。取出培养板，去除含MTT的培养液，各孔加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，避光室温下振荡15min，溶解甲瓒，在570nm波长下测定吸光度值。以对照组细胞活性为100％，计算各浓度下细胞活性，结果以均值±标准差表示。

2.6结果预测

计算光刺激比值RPV＝IC₅₀(UV-)/IC₅₀(UV+)

3结果

3.1细胞毒性结果

细胞毒性结果如表3和图4所示。

表3样品1测试结果

3.2结论

根据结果预测：样品1为非皮肤光刺激物。

实施例3

本实施例提供的基于双细胞水平的皮肤光刺激性评价方法，包括以下步骤：

1、实验的准备

1.1人原代皮肤角质细胞和人原代皮肤成纤维细胞

1.2培养液：成纤维细胞：含10％胎牛血清的DMEM培养基

角质细胞：Keratinocyte-SFM无血清培养液

1.3其他试剂：0.25％胰酶-EDTA、HBSS、PBS缓冲液、75％消毒酒精、中性红、无水乙醇、冰乙酸、样品2(某中药提取物)

1.4培养条件：温度37±1℃，5％CO₂浓度，饱和相对湿度

2试验过程

2.1受试物配制

受试物(样品2)用HBSS配制成200mg/mL浓度，使用前用HBSS稀释至100mg/mL，随后以10倍梯度稀释，共设置9个测试浓度。

2.2细胞铺板

将细胞以0.8*10⁵/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μL，放置培养箱培养18-22h。每种细胞制备2块96孔板，每块96孔板接种中间60孔，四周孔以PBS填充。

2.3受试物预处理

取出96孔板，去除原培养液，将受试物以HBSS稀释9个浓度后，每孔100μL加入培养板中，同时设置培养液对照组(不含有受试物)和溶剂对照组。返回培养箱预处理1.5h。

2.4光暴露

预处理结束，随机取出1块角质细胞和成纤维细胞的培养板，置于UV下进行辐照(UV+)，成纤维细胞辐照剂量UVA 4J/cm²、角质细胞辐照剂量UVB 700mJ/cm²，另一块培养板在暗处(UV-)放置相同时间。

辐照结束后，用DPBS清洗细胞层2次，重新加入新鲜培养液，培养箱中培养20±1h。

2.5细胞活性测量

观察细胞状态，去除孔中培养液，每孔加入中性红溶液(50μ/mL)，培养箱中放置3h。取出培养板，去除孔中液体，加入缓冲液清洗1次，各孔加入200μL解吸液(无水乙醇：水：冰乙酸＝49:50:1)，避光室温下振荡25-30min，溶解中性红，在540nm波长下测定吸光度值。以对照组细胞活性为100％，计算各浓度下细胞活性，结果以均值±标准差表示。

2.6结果预测

计算光刺激比值RPV＝IC₅₀(UV-)/IC₅₀(UV+)

3结果

3.1细胞毒性结果：细胞毒性结果如表4所示。

表4样品1测试结果

3.2结论

根据结果预测：样品2为可疑皮肤光刺激物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。本发明虽然仅列举了部分化学药品、表面活性剂等样品。但本发明中提到的其他非单一成分体系，如日常接触的化学物质、化妆品香料、植物、植物提取物、中药、中药提取物等，还有药物类及口服避孕药等也可以用本发明所述方法进行皮肤光刺激性评价，另外，测量受试物在不同浓度下的细胞活性时，除了采用MTT法和中性红法之外，还可以采用XTT或CCK-8等方法，计算不同浓度下相对细胞活性，此处不再一一列举。