阅读说明：本技术 一种新型尿液细菌检测方法 (Novel urine bacterium detection method ) 是由 吴芃 曾嘉荣 赵洁 陈春晓 李坤 温粤辉 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新型尿液细菌检测方法,通过增加培养标本量、改变不同的生长介质和气体条件,并延长细菌的培养时间对尿液中细菌进行鉴定,包括以下步骤：尿液的采集；保存及运输；初步传代培养；亚传代培养；细菌鉴定。本发明能从种水平上确定尿液中细菌种类,对培养出的细菌进一步生化特性、代谢特性等方面进行分析与研究；能鉴定出标准培养所遗漏的细菌,能够将尿液中存活的厌氧菌、需氧菌、微需氧菌进行培养、鉴定,与标准培养相比,本发明能更全面反映尿液所有细菌的情况。本发明所需的时间较16S rDNA测序明显缩短,而且操作上更为简便,对实验室以及实验设备要求相对不高,大部分医院以及实验室均可以实现,具有较高的可操作性及推广性。(The invention discloses a novel urine bacterium detection method, which identifies bacteria in urine by increasing the amount of a culture sample, changing different growth media and gas conditions and prolonging the culture time of the bacteria, and comprises the following steps: collecting urine; storing and transporting; performing primary subculture; sub-subculturing; and (5) identifying bacteria. The invention can determine the bacterial species in urine from the species level, and analyze and research the further biochemical characteristics, metabolic characteristics and other aspects of the cultured bacteria; the missed bacteria in the standard culture can be identified, the living anaerobic bacteria, aerobic bacteria and microaerophilic bacteria in the urine can be cultured and identified, and compared with the standard culture, the invention can more comprehensively reflect the conditions of all bacteria in the urine. The time required by the method is obviously shortened compared with 16S rDNA sequencing, the method is simpler and more convenient to operate, has relatively low requirements on laboratories and experimental equipment, can be realized in most hospitals and laboratories, and has high operability and popularization.)

一种新型尿液细菌检测方法

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，涉及一种新型尿液细菌检测方法。

背景技术

人体并非单一个体，其中并存着数目庞大且结构复杂的微生物，包括细菌、古细菌、原生生物、真菌和病毒等，他们定殖于胃肠道、口腔、皮肤、泌尿生殖道、呼吸道等。人体微生物累积干重仅约为人体总重1％至2％，但具有庞大的基因总量，所编码的基因数量可达人体自身基因数量150倍，相当于人体的“第二个基因组”。微生物是人体微环境的重要组成部分，对于机体的健康的维护以及疾病的发生起着关键作用，人体疾病发生的背后，可能都有微生态失衡的因素存在。人体微生态颠覆了医学上关于感染、肿瘤、代谢等重大疾病的传统认识，并被证实与感染性疾病、代谢性疾病、消化道疾病以及精神类疾病等相关。

人体不同部位微生态研究中，肠道微生态备受关注，而受传统观念“健康人泌尿道无菌”的影响，泌尿道微生态研究起步较晚且受关注较少，随着16S rDNA高通量测序等技术的运用，已证实健康人尿液同样存在常驻菌群，并且在维持泌尿道健康中扮演重要角色。现研究已表明泌尿道菌群可能与泌尿道疾病，如膀胱过度活动症、急迫性尿失禁、膀胱癌、***癌等的发病、症状严重程度、预后等相关。

目前，研究泌尿液细菌的主要手段包括16S rDNA测序以及尿液标准培养。16SrDNA测序可通过检测细菌高度保守的核糖体RNA基因，即便在菌量较低的情况下也可以在属水平上确定细菌种类。但基于分子检测的16S rDNA测序不能判定细菌存活状态，而且检测水平仅精确到属水平上的缺点也限制了研究的进一步深化。依靠细菌培养后进行鉴定的方法则能够在种水平上确定细菌类型，如尿液标准培养，而这也是临床上***的主要诊断方法。然而，尿液标准培养的方法仅可用于培养某些需氧、生长快速的病原菌，比如肠杆菌属、粪肠球菌属等。而对于另一些生长较慢、厌氧以及对生长环境要求较严格的微生物，比如棒状杆菌属、乳杆菌属等，则难以通过标准培养进行分离与鉴定。

上述两种尿液细菌鉴定方法常不能完整地反映尿液中细菌的真实情况，更无法掌握尿液中细菌的生化特性、代谢特性、遗传特性以及临床相关性等，因此，发明一种能够更全面反映尿液细菌真实情况的方法显得尤为重要。

本发明为一种能够全面反映尿液细菌真实情况的新技术。由于传统的检测方法并不能够较全面的反应尿液细菌的种类、数量，因此对于尿液细菌在机体发病、进展以及治疗中的作用研究不甚透彻。而本发明能够分离出尿液中存活的厌氧菌、需氧菌、微需氧菌，有望为泌尿道微生态以及临床研究提供新的技术手段。

尿路菌群被证实与多种下尿路症状相关，如膀胱癌以及膀胱过度活动症等，利用16S rDNA高通量测序，吴芃等发现膀胱癌组菌群丰富度明显高于对照组，尿液中鞘脂杆菌科和不动杆菌属相对丰度明显高于对照组。OAB患者的泌尿道菌群丰富度和多样性均显著降低，且与患者抑郁严重程度呈负相关。16S rDNA高通量测序是此类研究的重要技术手段，但基于分子检测的原理也让其短板显而易见，本发明新型的尿液细菌培养技术能从种水平上确定尿液中细菌种类，对培养出的细菌进一步生化特性、代谢特性等方面进行分析与研究，从而与16S rDNA高通量测序相辅相成，起到良好的互补作用。

尿细菌培养法为***诊断的金标准，能为临床医生抗菌药物的使用提供指导，但尿标准细菌培养法会遗漏大部分尿路细菌，如生长较慢、以及厌氧菌等，而此类细菌有可能在临床症状、治疗、预后等扮演重要角色。尿标准培养的低敏感度一方面为患者带来不必要的负担，另一方面由于大部分患者尿培养结果为阴性，因此不能为临床治疗提供精确指导，迫使医生经验性使用抗生素，从而可能引起耐药性病菌的出现。

经验性用药易导致耐药菌产生，甚至病情拖延，明确细菌种类并依照药敏试验来调整抗菌方案显得尤为重要。本发明的方法可对患者的病原学进行监测，了解病原菌菌种，进而分析抗生素与细菌耐药性的关系，以此指导临床抗生素的合理使用，有助于避免盲目用药，减少抗生素滥用，提高下尿路疾病的诊断和治愈率，减少患者痛苦。

发明内容

本发明的目的在于克服目前尿液细菌鉴定方法的不足，提供一种新型的尿液细菌检测方法。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种新型尿液细菌检测方法，包括以下步骤：

1)尿液的采集；

2)保存及运输；

3)初步传代培养；

4)亚传代培养；

5)细菌鉴定。

进一步地，本发明通过增加培养标本量、改变不同的生长介质和气体条件，并延长细菌的培养时间对尿液中细菌进行鉴定。

进一步地，所述1)中尿液的采集方法为耻骨上穿刺尿、导管尿或中段尿。

进一步地，所述耻骨上穿刺尿为下腹部皮肤消毒，在耻骨联合上缘一横指正中部行局麻，选好穿刺点，以穿刺针向后下方倾斜刺入膀胱腔内。拔出针芯，即有尿液溢出，将尿液抽尽并送检；

所述导管尿为使用消毒液剂(比如0.5％的碘伏溶液)消毒***局部，用导尿管经尿道***膀胱，先弃其前段尿液约15ml，再留取中段尿液于无菌容器内；

所述中段尿采集为充分清洁外***及消毒尿道口，并取中段尿。

进一步地，所述1)中尿液的采集前清洁***区，避免尿标本受污染，采集的尿标本放入无菌、清洁、无渗漏、无颗粒的容器中。比如收集尿标本放入50ml无菌、清洁、无渗漏、无颗粒的EP管中(留取3份，1份用于尿液培养，约10ml即可，另外2份留取约40-50ml，用于备份或者用于其他检测)。

进一步地，所述2)中的保存及运输为采集尿标本之后应在2小时内分析完毕，对不能及时检验的尿标本应及时冷藏，4℃冷藏保存时间不得超过8小时，避光加盖。

进一步地，所述3)中的初步传代培养为在生物安全柜内进行接种以及传代操作，严格避免标本污染，尿液具体培养方法根据标本采集方式有所不同，每次要求10-100ul尿标本涂布在4种不同的培养平板，涂布后将不同培养平板倒置，放在不同气体环境中培养48h之后，根据菌落形态学上的差异进行亚传代培养。

进一步地，所述初步传代培养的具体方法如下：

当尿液采集的方法为导管尿以及耻骨上穿刺尿时：

(1)分别取100ul尿标本在血琼脂平板、巧克力平板、哥伦比亚CNA血琼脂平板上涂布，然后将培养平板放置在35℃的5％CO₂气体环境中培养48小时；

(2)取100ul尿标本在血琼脂平板上涂布，然后将培养平板放置在35℃的空气环境中培养48小时；

(3)取100ul尿标本在CDC厌氧血琼脂平板上涂布，然后将培养平板放置在35℃的无氧环境中培养48小时；

当尿液采集的方法为中段尿时：

(1)无菌接种环(优选10ul接种环)取10ul尿标本在血琼脂平板、巧克力平板、哥伦比亚CNA血琼脂平板上涂布，然后将培养平板放置在35℃的5％CO₂气体环境中培养48小时；

(2)无菌接种环(优选10ul接种环)取10ul尿标本在血琼脂平板上涂布，然后将培养平板放置在35℃的空气环境中培养48小时；

(3)无菌接种环(优选10ul接种环)取10ul尿标本在CDC厌氧血琼脂平板上涂布，然后将培养平板放置在35℃的无氧环境中培养48小时。

进一步地，所述4)中的亚传代培养的方法如下：

(1)初步传代培养48h后，根据菌落特征区分不同菌落，计数培养平板上生长的菌落数，做下菌落形态学的文字描述；

(2)对每种不同菌落进行纯化分离培养：用无菌、圆滑的接种环(优选1ul接种环)，按无菌操作法挑取不同菌种进行分区划线，将培养平板中的菌落涂布在相同的培养基、放置在相同的环境下进行纯化培养24-48小时(具体时间根据菌落大小而定，大部分的培养时间为24h，倘若菌落较小则延长至48h)。比如：35℃空气环境、血琼脂平板中培养出的菌落，应该同样涂布在血琼脂平板，并放置在35℃空气环境培养24-48小时。

进一步地，所述菌落特征为菌落的形状、大小、高低、位置、表面的粗细、边缘的形状、色调、透明度，以及菌块的质地、软硬、粘稠度和特殊培养基的着色。

进一步地，所述5)中的细菌鉴定为经过24-48小时亚传代纯化培养后，利用MALDI-TOF MS(MALDI)对细菌的种类进行鉴定，进行记录及生物信息学分析。

本发明的有益效果为：本发明为基于细菌培养方法的细菌鉴定技术，通过改变尿液菌群生长条件，包括增加标本量(由1ul的培养量增加至10ul以及100ul)、改变不同的生长介质(创造了血琼脂平板、巧克力平板、哥伦比亚CNA血琼脂平板和CDC厌氧血琼脂平板的组合)和气体条件(创造了厌氧、5％CO₂以及空气培养环境的组合)，并延长细菌的培养时间(由24小时延长至48小时)对尿液中细菌进行鉴定，该方法能够将尿液中存活的厌氧菌、需氧菌、微需氧菌进行培养、鉴定，从而在种水平上鉴定出标准培养所遗漏的细菌，能更全面反映尿液所有细菌的情况。本发明能从种水平上确定尿液中细菌种类，对培养出的细菌进一步生化特性、代谢特性等方面进行分析与研究。本发明所需的时间较16S rDNA测序明显缩短，而且操作上更为简便，对实验室以及实验设备要求相对不高，大部分医院以及实验室均可以实现，因此具有较高的可操作性及推广性。

附图说明

图1为本发明与标准培养结果阳性对比图，其中深灰色为标准培养阳性平板，浅灰色为本发明新型尿液培养阳性平板；

图2为本发明所培养出的尿液细菌种类与标准培养对比图，其中浅灰色边框代表新型培养技术单独培养出来的尿液细菌类型，深灰色代表标准培养以及新培养技术共同培养出的细菌类型。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。

我们对本发明新型尿液培养技术与标准尿液培养技术的效果进行对比，实验对25例导管尿标本进行细菌培养、鉴定。

实施例1本发明新型尿液培养技术

1)尿液的采集：使用0.5％的碘伏溶液等消毒液剂消毒***局部，用导尿管经尿道***膀胱，先弃其前段尿液约15ml，再留取中段尿液于50ml无菌、清洁、无渗漏、无颗粒的EP管中；

2)保存及运输：采集尿标本之后在2小时内分析完毕；

3)初步传代培养：在生物安全柜内进行接种以及传代操作，严格避免标本污染，方法如下：

(1)分别取100ul尿标本在血琼脂平板、巧克力平板、哥伦比亚CNA血琼脂平板上涂布，然后将培养平板放置在35℃的5％CO₂气体环境中培养48小时；

(2)取100ul尿标本在血琼脂平板上涂布，然后将培养平板放置在35℃的空气环境中培养48小时；

(3)取100ul尿标本在CDC厌氧血琼脂平板上涂布，然后将培养平板放置在35℃的无氧环境中培养48小时；

4)亚传代培养：方法如下：

(1)初步传代培养48h后，根据菌落的形状、大小、高低、位置、表面的粗细、边缘的形状、色调、透明度，以及菌块的质地、软硬、粘稠度和特殊培养基的着色等菌落特征区分不同菌落，计数培养平板上生长的菌落数，做下菌落形态学的文字描述；

(2)对每种不同菌落进行纯化分离培养：用无菌、圆滑的1ul接种环，按无菌操作法挑取不同菌种进行分区划线，将培养平板中的菌落涂布在相同的培养基、放置在相同的环境下进行纯化培养24-48小时(具体时间根据菌落大小而定，大部分的培养时间为24h，倘若菌落较小则延长至48h)。

5)细菌鉴定：经过24-48小时亚传代纯化培养后，利用MALDI-TOF MS(MALDI)对细菌的种类进行鉴定，进行记录及生物信息学分析。

对比例1标准尿液培养技术

1)尿液的采集：使用0.5％的碘伏溶液等消毒液剂消毒***局部，用导尿管经尿道***膀胱，先弃其前段尿液约15ml，再留取中段尿液于50ml无菌、清洁、无渗漏、无颗粒的EP管中；

2)保存及运输：采集尿标本之后在2小时内分析完毕；

3)初步传代培养：在生物安全柜内进行接种以及传代操作，严格避免标本污染，方法如下：

1ul接种环取1ul尿标本分别在血琼脂平板以及麦康凯琼脂平板上涂布，然后将培养平板放置在35℃的空气环境中培养24小时。

4)亚传代培养：方法如下：(1)初步传代培养24h后，根据菌落的形状、大小、高低、位置、表面的粗细、边缘的形状、色调、透明度，以及菌块的质地、软硬、粘稠度和特殊培养基的着色等菌落特征区分不同菌落，计数培养平板上生长的菌落数，做下菌落形态学的文字描述；

(2)对每种不同菌落进行纯化分离培养：用无菌、圆滑的1ul接种环，按无菌操作法挑取不同菌种进行分区划线，将培养平板中的菌落涂布在相同的培养基、放置在相同的环境下进行纯化培养24-48小时(具体时间根据菌落大小而定，大部分的培养时间为24h，倘若菌落较小则延长至48h)。

5)细菌鉴定：经过24-48小时亚传代纯化培养后，利用MALDI-TOF MS(MALDI)对细菌的种类进行鉴定，进行记录及生物信息学分析。

培养阳性标本在不同培养平板阳性情况如图1，培养出的细菌种类差异情况如图2。

图1可见，标准培养阳性的标本，其新型培养技术的培养结果也为阳性，而反之则不然。新型尿液细菌培养技术的阳性例数为20例，阳性率为80％，而标准培养阳性例数为3例，阳性率为12％。所用不同的培养平板中，CDC厌氧血琼脂平板的培养阳性率最高(85％)，表明大部分的导管尿标本中都至少含有1种或1种以上的厌氧菌或兼性厌氧菌。

图2可见，新型尿液细菌培养技术培养出咽峡炎链球菌、***加德纳菌、惰性乳杆菌、木糖葡萄球菌等16种细菌类型，而标准培养仅培养出其中3种细菌类型，这3种细菌分别为：木糖葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌，该结果表明新型尿液细菌培养技术的细菌培养效果明显高于标准培养。通过新型尿液细菌培养技术，我们可知，这20例培养阳性的标本中，出现频率最高的细菌类型为咽峡炎链球菌(7/20)，其次为惰性乳杆菌(5/20)、木糖葡萄球菌与***加德纳菌(均为4/20)。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。