Prkra基因作为靶点在抑制小反刍兽疫病毒复制中的应用
阅读说明：本技术 Prkra基因作为靶点在抑制小反刍兽疫病毒复制中的应用 (Application of PRKRA gene as target in inhibiting replication of peste des petits ruminants virus ) 是由 郑海学 陈淑莹 朱紫祥 杨帆 曹伟军 齐晓兰 唐闻达 马昭 张向乐 刘湘涛 于 2021-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物基因工程技术领域,具体涉及一种PRKRA基因作为靶点在抑制小反刍兽疫病毒复制中的应用。本发明首先发现通过抑制或沉默宿主PRKRA基因,能够抑制小反刍兽疫病毒的复制,可作为靶点用于制备抑制小反刍兽疫病毒复制的药物；其次,以PRKRA基因为靶点,本发明设计了小干扰RNA,所述小干扰RNA能够干扰小反刍兽疫病毒复制,可用于制备抑制小反刍兽疫病毒的复制的药物；并且,本发明提供了一种特异性靶向PRKRA基因的sgRNA,所述的sgRNA能够特异性靶向PRKRA基因,结合CRISPR-Cas9技术实现了PRKRA基因的完全敲除,获得的单克隆细胞系PRKRA-KOs对PPRV具有抗性表型,能够显著抑制PPRV在细胞内的复制,为进一步研究PRKRA基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。(The invention belongs to the technical field of biological gene engineering, and particularly relates to application of a PRKRA gene as a target spot in inhibiting the replication of peste des petits ruminants virus. The invention firstly discovers that the replication of the peste des petits ruminants virus can be inhibited by inhibiting or silencing a PRKRA gene of a host, and the peste des petits ruminants virus can be used as a target for preparing a medicament for inhibiting the replication of the peste des petits ruminants virus; secondly, with PRKRA gene as a target spot, the invention designs small interfering RNA which can interfere the replication of the peste des petits ruminants virus and can be used for preparing a medicament for inhibiting the replication of the peste des petits ruminants virus; moreover, the sgRNA of the specific targeting PRKRA gene can specifically target the PRKRA gene, the complete knockout of the PRKRA gene is realized by combining the CRISPR-Cas9 technology, the obtained monoclonal cell line PRKRA-KOs has a resistance phenotype to PPRV, the replication of PPRV in cells can be obviously inhibited, and research tools and materials are provided for further researching the molecular mechanism of the PRKRA gene for regulating the replication of pathogenic microorganisms in the cells.)
技术领域
本发明属于生物基因工程
技术领域
，具体涉及一种PRKRA基因作为靶点在抑制小反刍兽疫病毒复制中的应用。背景技术
小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)，属于单股负链且不分节段的RNA病毒，主要感染山羊、绵羊等小反刍动物。PPRV主要侵害淋巴组织和消化道、呼吸道上皮细胞，临床上主要表现为急性发热、肠炎、支气管肺炎和怀孕母羊流产等症状，对我国乃至全球发展中国家的畜牧养殖业造成巨大的经济损失。目前，免疫接种疫苗是抵御小反刍兽疫最有效的方法。与灭活疫苗相比，弱毒疫苗(Nigeria 75/1和Sungri 96)的免疫效果更好、持续时间更长。但从病原学、致病机理等方面的研究并未有很大的突破。因此深入了解宿主蛋白抑制PPRV复制的机制，通过CRISPR-Cas9技术构建抑制PPRV病毒复制的细胞系对于小反刍兽疫疫苗的生产意义重大。
RNA干扰技术的出现对选择毒性提出了可能，为抗病毒研究提供了新思路。RNA干扰是RNA序列特异性转录后基因沉默现象。与以往抗病毒治疗的手段相比，RNA干扰介导的抗病毒效应具有高度的特异性，对非同源基因表达几乎没有影响，因此可将不良反应降到最小；RNA干扰能高效抑制病毒复制，少量的siRNA就可达到降低病毒表达产物的作用；RNA干扰可以针对病毒基因组保守区域发挥作用，从而在一定程度上限制了病毒产生逃避突变株的能力。因此，设计合成靶向小反刍兽疫病毒基因组的siRNAs将可能成为抑制小反刍兽疫病毒感染的有效途径。
PRKRA(interferon-inducible double-stranded RNA-dependent proteinkinase activator A)是细胞内一种不依赖于ds RNA的PKR激活蛋白。之前的研究表明在细胞没有收到病毒感染或者ds RNA刺激的情况下，PRKRA或称PACT(PKR-activatingprotein)仍可以激活PKR，从而导致其下游分子eIF2α的磷酸化，从而抑制宿主细胞翻译功能最终导致细胞发生凋亡。正常情况下，PRKRA与PKR一样广泛存在于各个组织和细胞中，且保持较低的水平，当细胞受到环境刺激变化时，其表达水平会显著提高。PRKRA在哺乳动物发育过程中起到重要的生理作用，且参与细胞生长和肿瘤的发生过程，同时PRKRA还能与Rb蛋白相互作用来改变细胞周期的进程从而调控细胞生长状况。PRKRA在肿瘤治疗中也起到重要的作用，研究发现PRKRA具有促进癌细胞增值的功能，这为肿瘤治疗研究提供新的靶点。
本发明发现，通过抑制或沉默宿主PRKRA基因，能够抑制PPRV的复制，可作为靶点用于制备抑制小反刍兽疫病毒复制的药物。基于此，本发明以PRKRA基因为靶点，设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰PPRV的复制，可用于制备抑制PPRV复制的药物。而且为了进一步研究PRKRA基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制，本发明设计了一种特异性靶向PRKRA基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向PRKRA基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了PRKRA基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系PRKRA-KOs对PPRV具有抗性表型，能够显著抑制PPRV在细胞内的复制，为研究PRKRA基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供了研究工具和材料，也可用于抗PPRV的动物育种。
发明内容
针对上述技术问题，本发明首先发现通过抑制或沉默宿主PRKRA基因，能够抑制小反刍兽疫病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制小反刍兽疫病毒复制的药物；其次，以PRKRA基因为靶点，本发明设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰小反刍兽疫病毒复制，可用于制备抑制小反刍兽疫病毒的复制的药物；并且，本发明提供了一种特异性靶向PRKRA基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向PRKRA基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了PRKRA基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系PRKRA-KOs对PPRV具有抗性表型，能够显著抑制PPRV在细胞内的复制，为进一步研究PRKRA基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种PRKRA基因作为靶点在筛选用于预防或治疗小反刍兽疫药物中的应用，所述药物以PRKRA基因为靶点，抑制或者沉默PRKRA基因的表达。
第二方面，本发明提供了一种抑制PRKRA基因表达的试剂或药物在制备预防或治疗小反刍兽疫病毒感染药物中的应用。
优选地，所述试剂或药物为以PRKRA基因为靶点设计的小干扰RNA。
优选地，所述小干扰RNA的序列为：
PRKRA-siRNA-F:5’-CCCAGUUUAUGAAUGUGAATT-3’；
PRKRA-siRNA-R:5’-UUCACAUUCAUAAACUGGGTT-3’。
优选地，所述试剂或药物包括靶向敲除PRKRA基因的sgRNA和/或Cas9蛋白的mRNA序列。
优选地，所述药物通过药物递送载体将携带靶向PRKRA基因的sgRNA和/或Cas9蛋白的mRNA序列递送至动物体内抑制PRKRA基因表达。
优选地，所述药物递送载体为脂质体纳米颗粒。
优选地，所述sgRNA包括PRKRA-sgRNA1、PRKRA-sgRNA2中的任一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：
PRKRA-sgRNA1-F：5’-GCCACTGTCCTCGCGCTCCAG-3’；
PRKRA-sgRNA1-R：5’-CTGGAGCGCGAGGACAGTGGC-3’；
PRKRA-sgRNA2-F：5’-GAGATGATAACAGCTAAGCCA-3’；
PRKRA-sgRNA2-R：5’-TGGCTTAGCTGTTATCATCTC-3’。
第三方面，本发明提供了一种特异性靶向敲除PRKRA基因的sgRNA，所述sgRNA包括PRKRA-sgRNA1、PRKRA-sgRNA2中的任一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：
PRKRA-sgRNA1-F：5’-GCCACTGTCCTCGCGCTCCAG-3’；
PRKRA-sgRNA1-R：5’-CTGGAGCGCGAGGACAGTGGC-3’；
PRKRA-sgRNA2-F：5’-GAGATGATAACAGCTAAGCCA-3’；
PRKRA-sgRNA2-R：5’-TGGCTTAGCTGTTATCATCTC-3’。
第四方面，本发明提供了一种上述第三方面所述的sgRNA在制备PRKRA基因敲除细胞系中的应用。
第五方面，本发明提供了一种PRKRA基因敲除细胞系的构建方法，所述方法为通过基因打靶技术使宿主细胞中PRKRA基因编码蛋白功能丧失。
优选地，所述方法为CRISPR-Cas9技术。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)制备上述第三方面所述的特异性靶向PRKRA基因的sgRNA，在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向PRKRA基因的sgRNA寡聚核苷酸；
(2)将步骤(1)制备的双链片段插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到同时表达Cas9蛋白基因和打靶sgRNA序列的重组载体；
(3)将步骤(2)制备的重组载体转染宿主细胞，挑取单个细胞，接种培养，获得PRKRA基因功能缺失细胞系。
第六方面，本发明提供了一种根据上述第五方面所述的方法构建的PRKRA基因敲除细胞系。
第七方面，本发明提供了一种上述第六方面所述的PRKRA基因敲除细胞系在非诊断治疗目的的检测中的应用。
第八方面，本发明提供了一种上述第六方面所述的PRKRA基因编码蛋白功能丧失细胞系在动物抗小反刍兽疫病毒育种中的应用。
本发明的有益效果是：①本发明发现通过抑制或沉默宿主PRKRA基因，能够抑制小反刍兽疫病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制小反刍兽疫病毒复制的药物；②本发明以PRKRA基因为靶点，本发明设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰小反刍兽疫病毒复制，可用于制备抑制小反刍兽疫病毒的复制的药物；③本发明提供了一种靶向PRKRA基因的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向RPSA基因，结合CRISPR-Cas9技术可实现宿主细胞中PRKRA基因的完全敲除；将靶向PRKRA基因的sgRNA和Cas9蛋白的mRNA序列通过药物载体递送至动物体内，可实现PRKRA基因的抑制，进而抑制小反刍兽疫病毒的复制；④本发明提供了一种通过CRISPR-Cas9技术将所述sgRNA转染于宿主细胞，构建PRKRA基因编码蛋白功能丧失细胞系的方法，通过使PRKRA基因编码蛋白功能丧失，获得的了具有PPRV抗性表型的细胞系，能够显著抑制PPRV的复制，为进一步研究PRKRA基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料，也可用于抗PPRV的动物育种。
附图说明
图1小干扰RNA干扰后Vero细胞中PRKRA基因的表达结果；
图2小干扰RNA干扰后Vero细胞中PPRV病毒的表达结果；
图3 PX459-PRKRA-sgRNA重组质粒构建测序比对结果；
图4转染PX459-PRKRA-sgRNA质粒后，Vero细胞DNA check引物PCR扩增结果；
图5转染PX459-PRKRA-sgRNA1质粒后，Vero细胞DNA check引物扩增片段测序图谱；
图6 PRKRA基因敲除Vero备选细胞PRKRA蛋白Western blotting检测结果；
图7 PRKRA基因敲除Vero细胞经PPRV攻毒后细胞内病毒蛋白复制水平的Westernblotting检测结果；
图8 PRKRA基因敲除Vero细胞经PPRV攻毒后细胞内病毒mRNA水平的qPCR检测结果。
图9 PRKRA基因敲除Vero细胞经PPRV攻毒后细胞内病毒蛋白染色结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
定义
术语“基因沉默”是指在不损伤原有DNA的情况下使基因低表达或不表达的现象，主要包括两个方面，一是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默；二是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制、基因抑制、RNA干扰和微小RNA介导的翻译抑制等。本发明可通过基因沉默技术，抑制宿主细胞中的PRKRA基因的表达，从而抑制PPRV感染后的病毒复制，用于预防或治疗PPRV感染。
术语“基因打靶”是指利用DNA定点同源重组进行细胞或生物个体遗传信息定向改变的定向转基因技术，主要包括基因敲除、基因灭活、基因敲入、点突变、缺失突变以及染色体组大片段删除等。其中“基因敲除”是指通过同源重组使特定靶基因失活。本发明通过基因敲除技术，使宿主细胞中的PRKRA基因敲除，获得的PRKRA基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系既能抑制PPRV感染后的病毒复制；本发明也可以通过对宿主细胞中的PRKRA基因突变，或缺失基因片段，导致PRKRA基因编码蛋白发生移码突变，成功构建出PRKRA基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系。
术语“sgRNA”为向导RNA，是指在RNA编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体(kinetoplastid)中，属于一种小型非编码RNA。
本发明通过人工合成了靶向PRKRA基因的sgRNA，进一步在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端制备了靶向PRKRA基因的sgRNA寡聚核苷酸，并退火为双链片段；
本发明在直接靶向剪接PRKRA基因的基础上，利用CRISPR/Cas9联合特异性敲除PRKRA基因的方法，以非洲绿猴肾细胞Vero为例，进行了PRKRA基因敲除(所述PRKRA基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，为PPRV的预防或治疗提供了一种策略。本发明虽然仅对非洲绿猴肾细胞Vero中PRKRA基因进行敲除，获得了一种具有PPRV抗性的基因敲除细胞，但是本发明所述的方法可以推论并扩展到对其他动物细胞中PRKRA基因敲除，构建具有PPRV抗性的基因敲除细胞。
CRISPR/Cas9系统对基因的定向识别和剪切是由sgRNA和Cas9实现的，sgRNA决定了Cas9的靶向性，也决定了Cas9的切割活性。本发明旨在应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过体内外筛选针对PRKRA基因的sgRNA序列，实现PRKRA基因的准确、高效地敲除，获得一种具有抑制PPRV病毒复制的PRKRA基因敲除单克隆细胞系，从而为PPRV感染的预防或治疗提供新的策略。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过靶向PRKRA基因的sgRNA引导Cas9蛋白结合到PRKRA基因特定序列位置对DNA双链进行切割，造成基因双链断裂，在细胞自身修复机制作用下，产生随机突变，核苷酸的缺失或插入等突变会造成基因的读码框发生改变，最终达到基因编码蛋白功能丧失的目的，获得基因编码蛋白功能丧失细胞系。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。
以下实施例中所涉及的质粒来源：购买于淼灵质粒平台。
细胞培养：Vero细胞来源于猴科(Cercopithecidae)动物；用含有5％胎牛血清(FBS)、1％双抗的DMEM培养基置于含有5％CO2温箱(37℃)中进行培养。
病毒来源：PPRV Nigeria 75/1疫苗毒株保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队与国家口蹄疫参考实验室。
实施例1 PRKRA基因沉默后PPRV病毒复制结果
1.小干扰RNA(siRNA)的设计
设计PRKRA基因的RNA干扰靶点序列PRKRA siRNA(SEQ ID NO.3-4)和NC siRNA(SEQ ID NO.5-6)所示，具体序列如下：
PRKRA-siRNA-F:5’-CCCAGUUUAUGAAUGUGAATT-3’(SEQ ID NO.3)；
PRKRA-siRNA-R:5’-UUCACAUUCAUAAACUGGGTT-3’(SEQ ID NO.4)；
NC siRNA-F:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO.5)；
NC siRNA-R:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.6)。
2.PRKRA基因沉默细胞系构建：
(1)PRKRA基因沉默siRNA Oligo制备：将设计好的干扰RNA序列送至上海吉玛公司进行合成，得到相对应的siRNA Oligo，用DEPC H2O重悬1OD的siRNA使其终浓度为20Μm。溶解前先离心，10000rpm，2min,再慢慢打开管盖，溶解时加足DEPC水后充分振荡使其溶解。对照组siRNA(NC)用同样的方法溶解备用。
(2)PRKRA基因沉默细胞系的构建：Vero细胞计数后铺在六孔板中，待细胞融合度至70％～80％融合度时，将溶解好的siRNA 6μL分别与Lipofectamine2000，6μL加至100μL的Opti-MEM中，静止5min后将两者混合。将脂质体-siRNA混合物静置20min后直接加至细胞培养基中。将细胞重新置于37℃、5％CO2培养箱中培养6h后换液，24-72h检测mRNA 表达，48-96h检测蛋白表达。
3.PRKRA基因表达水平检测
Vero细胞分别转染NC siRNA和PRKRA siRNA，转染24h后，接种PPRV(MOI＝1)，感染48h后，用PBS清洗一遍，收取细胞提取RNA，反转录后检测PRKRA mRNA表达水平。检测结果如图1所示，相较于NC siRNA，转染PRKRA siRNA后Vero细胞中基本检测不到PRKRA基因的表达，说明PRKRA siRNA能够抑制PRKRA基因的表达。
4.PPRV病毒感染后的PPRV病毒结果
细胞转染和感染方法如上述3所述，感染PPRV 48h后，收取细胞提取RNA，利用荧光定量PCR的方法检测PPRV病毒的表达水平。结果如图2所示，相比较于NC siRNA转染的Vero细胞，转染PRKRA siRNA后的Vero细胞感染PPRV后，能够显著抑制PPRV N蛋白的表达。
上述结果表明，以PRKRA为靶点涉及的小干扰RNA能够显著抑制PRKRA基因的表达，进而抑制PPRV病毒的复制。因此，PRKRA作为靶点能够用于筛选或设计用于抑制PPRV病毒复制的药物，进而用于预防或治疗小反刍兽疫。
实施例2 PRKRA基因敲除Vero细胞系
1.靶向PRKRA基因sgRNA的设计
利用Ensemble数据库查询PRKRA基因序列,定位PRKRA在基因组中不同转录本重叠区的第一个外显子段，用于靶点设计。
根据CRISPR/Cas9设计原则，登录CRISPR在线设计网站http://crispor.tefor.net/进行sgRNA的设计，分别命名为：PRKRA-sgRNAsp1、PRKRA-sgRNAsp2；在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向PRKRA基因的sgRNA寡聚核苷酸(sgRNA1-oligo)。所述sgRNA1-oligo由金唯智生物科技有限公司合成，详细序列见表1。
表1靶向PRKRA基因的sgRNA寡聚核苷酸
注：下划线部分所标注的序列为加入的酶切位点，不加下划线的序列为sgRNA序列(SEQ ID NO.7-10)。
2.sgRNA重组质粒PX459-sgRNA的构建
双链sgRNA-oligo的获得：将合成的sgRNA-oligo稀释至100μmol/L，配制共10μL反应体系：上游引物4.5μL；下游引物，4.5μL；10×LA PCR Buffer，1μL，轻柔混匀。退火程序：95℃，10min；后从PCR仪中拿出来自然放凉。
PX459载体质粒的酶切：利用Bbs I限制性内切酶酶切PX459载体，共配制20μL酶切体系如下：PX459载体，5μL；BbsI，1μL；10×Buffer，2μL；ddH2O，12μL。37℃中放置3h进行酶切。之后进行核酸电泳，利用promega公司的DNA纯化回收试剂盒纯化回收含有粘性末端的PX459载体线性化片段。
PX459-sgRNA重组质粒的构建：将纯化回收PX459线性化片段产物与双链sgRNA-oligo进行连接反应，反应体系：T4 Ligase，0.5μL；10×T4Ligase Buffer，0.5μL；PX459酶切纯化片段，0.5μL；双链sgRNA-oligo，3.5μL，共5μL体系。16℃过夜连接，将连接产物转化Trans5α大肠杆菌感受态细胞，进行重组质粒的克隆扩增。转化程序：将50μL的Trans5α感受态细胞与500ng连接产物混合，冰上放置30分钟。42℃水浴热激45秒，取出冰浴2分钟。加入无抗性LB培养液500mL，37℃，220rpm摇菌60分钟。将复苏好的菌液4000rpm室温离心5min。吸去400μL上清后，将剩余的上清与沉淀的菌体充分悬浮，利用涂菌棒将转化的大肠杆菌涂布在具有氨苄抗生素抗性的LB平板上，37℃温箱培养12h，观察生长状况。
挑取单克隆菌落，利用含有氨苄抗生素抗性的LB液体培养基摇菌12h，利用质粒提取试剂盒提取并测序验证，测序结果如图3所示，利用TRC通用引物检测所构建质粒得到的序列与原载体进行比对，与预期结果相符。表明表达sgRNA的质粒
PX459-PRKRA-sgRNA1，PX459-PRKRA-sgRNA2构建成功。
3.细胞转染
在转染前复苏Vero细胞于T25细胞瓶中，使用含有5％的FBS、1％双抗的DMEM培养基培养，当细胞传代2-3次性状稳定且状态较好时，将细胞消化后铺于细胞六孔板中，待细胞融合度至70％～80％时，将成功构建的重组质粒2μg分别与Lipofectamine2000，4μL(按照比例1μg：2μL)加至50μL的Opti-MEM中，静止5min后将两者混合。将脂质体-质粒DNA混合物静置20min后直接加至细胞培养基中。将细胞重新置于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，用puromycin浓度8μg/mL的培养基处理细胞2-3天，筛选出转染阳性的细胞。随后通过细胞计数，数100个阳性细胞铺在96孔板中获得单个细胞克隆。
(1)细胞DNA的提取及基因打靶效率检测：
按照微量DNA提取试剂盒的操作说明，提取单个细胞克隆的基因组，进一步利用DNA check引物扩增含有打靶位点区段的PRKRA基因片段，所述DNA check引物为：
PRKRA-check-F：GAACGCAAGCAGGAGGAGGGGGAGT(SEQ ID NO.15)
PRKRA-check-R：GGGTATGAAAAGAGTCGTGCAGGAT(SEQ ID NO.16)。
结果如图4所示，以野生型Vero细胞为对照，所有单个细胞克隆均扩增到了约1100bp大小片段，与预期设计片段大小相符。紧接着将目标位置的核酸凝胶切胶纯化回收后送样进行测序，测序图谱如图5所示，测序峰图中出现了大量的套峰，表明扩增片段中发生了有效的基因编辑。
(2)PRKRA-KOs Western blotting验证
以未发生基因编辑的Vero细胞(野生型细胞)作为阴性对照。取野生型细胞(WT)株与3株敲除型候选细胞株(分别编号为KO1-KO3)分别培养，待细胞长满后，收取细胞放置冰上。加入适量1×SDS loading Buffer充分搅拌裂解，待细胞全部脱落后吸取至EP管中，做好标记；金属浴放置15分钟变性，离心后，取上清进行SDS-PAGE。电泳后通过湿转法转移至NC膜，转印后使用5％的脱脂奶粉封闭，用购买的35kDa PRKRA鼠抗为一抗，兔抗鼠IgG(IgG-HRP)为二抗，进行抗原抗体复合物检测，对PRKRA基因敲除的Vero单克隆细胞系在蛋白表达水平进行验证。
实验结果如图6所示，WT检测到清晰的PRKRA蛋白条带，在3株候选细胞株中均未检测到PRKRA蛋白条带，说明KO1、KO2和KO3三株候选株中PRKRA基因打靶成功，说明采用本发明提供的sgRNA，并应用CRISPR-Cas9技术实现了对宿主细胞中PRKRA基因的完全敲除。
实施例3 PRKRA基因敲除Vero细胞系对PPRV复制的影响
用PRKRA基因敲除Vero细胞和野生型Vero细胞，进行正常传代培养后，将细胞铺至35mm细胞培养皿，接种PPRV Nigeria 75/1病毒，分别用Western blotting和qPCR方法检测PPRV复制情况。
Western blotting检测结果如图7所示，结果表明，PRKRA基因敲除Vero细胞中基本检测不到PPRV的N蛋白表达。
qPCR检测结果如图8所示，PRKRA基因敲除Vero细胞接种PPRV后N蛋白和P蛋白的mRNA水平相比野生型细胞均显著下调。间接免疫荧光结果如图9所示，野生型细胞中病毒衣壳蛋白随病毒感染时间推移而增加，而PRKRA基因敲除细胞中几乎检测不到PPRV衣壳蛋白的表达。其中蓝色为细胞核染色结果，绿色为PPRV衣壳蛋白染色。
以上结果表明，通过基因编辑技术获得PRKRA基因敲除Vero细胞能够显著抑制PPRV的复制，具有PPRV抗性。因此，构建的PRKRA基因编码蛋白的功能丧失细胞可用于动物抗PPRV病毒的育种。
综上所述，本发明通过CRISPR-Cas9技术成功构建了PRKRA基因编码蛋白功能丧失的细胞系。但本发明并不局限于CRISPR-Cas9技术，在本发明的基础上，通过其他技术手段使PRKRA基因编码蛋白功能丧失也能够获得PRKRA基因编码蛋白功能丧失的细胞系。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> PRKRA基因作为靶点在抑制小反刍兽疫病毒复制中的应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 313
<212> PRT
<213> 非洲绿猴(African green monkey)
<400> 1
Met Ser Gly Ser Ala His Ala Ala Gly Ala Pro Pro Leu Gly Ala Gly
1 5 10 15
Ala Ser Gly Thr Pro Ser Leu Gly Leu Met Ile Thr Ala Leu Pro Gly
20 25 30
Leu Thr Pro Ile Gly Val Leu His Gly Thr Gly Met Leu Thr Leu Ala
35 40 45
Ile Pro Val Thr Gly Cys Gly Ala Ser Ala Val Gly Ile His Val Pro
50 55 60
Thr Pro Thr Pro Ala Val Thr Val Gly Ala Ile Thr Cys Thr Gly Gly
65 70 75 80
Gly Thr Ser Leu Leu Leu Ala Leu His Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ile
85 90 95
Ala Ile Leu Leu Ala Ala Ala Ser Ile Cys Pro Ala Val Pro Ala Pro
100 105 110
Leu Met Pro Ala Pro Ser Leu Gly Pro Leu Ala Gly Leu Ala Pro Ile
115 120 125
Gly Ser Leu Gly Gly Leu Ala Ile His His Gly Thr Ala Leu Pro Gly
130 135 140
Thr Thr Leu Ser Gly Gly Gly Gly Pro Ala His Leu Ala Gly Thr Thr
145 150 155 160
Thr Ile Cys Ala Leu Gly Ser Pro Met Gly Thr Gly Leu Gly Ala Ser
165 170 175
Leu Leu Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Leu Pro
180 185 190
Ser Ala Ile Ser Pro Gly Ala His Ile Ser Leu Thr Ala Val Val Gly
195 200 205
His Ser Leu Gly Cys Thr Thr His Ser Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly
210 215 220
Leu Ile Ala Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Ser Ile Pro Ala Thr Ala
225 230 235 240
Thr Ile Gly Leu Leu Ser Gly Ile Ala Leu Gly Gly Gly Pro Ala Ile
245 250 255
Thr Thr Leu Ala Ile Ala Gly Leu Ser Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys
260 265 270
Leu Ala Gly Leu Ser Thr Ser Pro Ile Thr Val Cys His Gly Ser Gly
275 280 285
Ile Ser Cys Gly Ala Ala Gly Ser Ala Ala Ala His Ala Ala Leu Gly
290 295 300
Thr Leu Leu Ile Ile Ala Gly Ala Leu
305 310
<210> 2
<211> 942
<212> DNA
<213> 非洲绿猴(African green monkey)
<400> 2
atgtcccaga gcaggcaccg cgccgaggcc ccgccgctgg agcgcgagga cagtgggacc 60
ttcagtttgg ggaagatgat aacagctaag ccagggaaaa caccgattca ggtattacac 120
gaatacggca tgaagaccaa gaacatccca gtttatgaat gtgaaagatc tgatgtgcaa 180
atacatgtgc ccacattcac cttcagagta accgttggtg acataacctg cacaggtgaa 240
ggtacaagta agaagctggc gaaacataga gctgcagagg ctgccataaa cattttgaaa 300
gccaatgcaa gtatttgctt tgcagttcct gatcccttaa tgcctgaccc ttccaagcaa 360
ccaaagaacc agcttaatcc tattggttca ttacaggaat tggctattca tcatggctgg 420
agacttcctg aatataccct ttcccaggag ggaggacctg ctcataagag agaatatacc 480
acaatttgca ggctagagtc atttatggaa actggaaagg gggcatcaaa aaagcaagcc 540
aaaaggaatg ctgctgagaa atttcttgcc aaatttagta atatttctcc agagaaccac 600
atttctttaa caaatgtagt aggacattct ttaggatgta cttggcattc cttgaggaat 660
tctcctggtg aaaagatcaa cttactgaaa agaagcctcc ttagtattcc aaatacagat 720
tacatccagc tgcttagtga aattgccaag gaacaaggtt ttaatataac atatttggat 780
atagatgaac tgagcgccaa tggacagtat caatgtcttg ctgaactgtc caccagcccc 840
atcacggtct gtcatggctc cggtatctcc tgtggcaatg cacaaagtga tgcagctcac 900
aatgctttgc agtatttaaa gataatagca gaaagaaagt aa 942
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccaguuuau gaaugugaat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uucacauuca uaaacugggt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccactgtcc tcgcgctcca g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctggagcgcg aggacagtgg 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagatgataa cagctaagcc a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggcttagct gttatcatct c 21
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caccgccact gtcctcgcgc tccag 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaacctggag cgcgaggaca gtgg 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caccgagatg ataacagcta agcca 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaactggctt agctgttatc atctc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaacgcaagc aggaggaggg ggagt 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggtatgaaa agagtcgtgc aggat 25