一种建立***诱导致精神***症大鼠模型的方法及应用
阅读说明：本技术 一种建立***诱导致精神***症大鼠模型的方法及应用 (Method for establishing ketamine-induced schizophrenia rat model and application ) 是由 解润芳 韩梓逸 解继明 王欣 马旭涛 于 2019-08-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种建立氯胺酮诱导致精神分裂症大鼠模型的方法,通过给大鼠注射不同浓度的氯胺酮溶液,然后对大鼠的脑组织海马及前额叶皮质中的NRG1及ErbB4进行免疫组化试验,确定了本模型,本方法简单,可靠性强,不仅仅对阴性和阳性的区分,还能对精神分裂程度进行区分,本方法可用于探究氯胺酮与精神分裂症易感基因NRG1/ErbB4之间的相关性,最终探索精神分裂症的发病机制,并为法医精神分裂症鉴定提供理论依据。(the invention discloses a method for establishing a rat model of inducing schizophrenia by ketamine, which is characterized in that ketamine solutions with different concentrations are injected into rats, then immunohistochemical tests are carried out on NRG1 and ErbB4 in hippocampus and prefrontal cortex of brain tissues of the rats, and the model is determined.)
技术领域
本发明涉及医学技术领域，具体涉及一种建立***诱导致精神***症大鼠模型的方法。
背景技术
目前，药物滥用是一个十分严重的社会问题，***(K粉)作为一种***正受到越来越多的关注。近20年来，我国滥用***比例连年攀升，资料显示，二十一岁以下的人服用***的情况最为严重。***是一种非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，NMDA受体在突出可塑性的诱导、维护和表达中起着重要的作用，而突出与学习和记忆机制密切相关。NMDA受体异常会影响学习和记忆功能，也会对中枢神经系统造成损伤；***使用剂量愈大，毒副作用愈显著，毒副作用主要表现为中枢神经系统反应，如梦幻觉、错觉(illusion)、分离状态或***症、兴奋、定向障碍、认知障碍、谵妄等。长期滥用***不仅对中枢神经系统造成损伤而且可产生精神***症(schizophrenia)的症状；滥用***的吸毒人员还被发现会产生精神***症的阴性及阳性症状。我们研究的基础，用******诱导来建立一个客观、稳定及可靠的精神***症动物模型。精神***症是一类严重的致残性精神疾病，主要症状包括阳性症状、阴性症状和认知功能损害。阳性症状表现为幻觉、妄想、思维紊乱以及行为怪异；阴性症状表现为行为动机低下、情感反应淡漠、失语症以及兴奋能力低下；认知功能损害以注意力、记忆力和计划能力的损害最为常见。精神***症病因不明，对其发病机制的研究也较少，临床诊断主要取决于对阳性症状和阴性症状的判定，缺乏客观的生物学检测指标，其治疗也一直是医学界的一个难题，因此建立可靠的精神***症动物模型来探究精神***症的发病及治疗机制就显得尤为重要。
迄今为止精神***症的发病机制仍不清楚，普遍接受的观点是：精神***症是在环境因素影响下，多个“中至微效”基因协同作用的结果，神经发育因素参与其中。遗传学研究发现了多个与精神***症相关的重要候选基因，其中神经调节素1(neuregulin1,NRG1)及其受体ErbB4基因均被鉴定为精神***症的易感基因。临床研究表明，在中国汉族人群中NRG1基因与精神***症是相关联的，特别是和精神***症的阳性症状关系密切。NRG可以与ErbB家族的ErbB3、 ErbB4酪氨酸酶结合，从而形成ErbB同二聚体和杂二聚体，继而激活细胞外信号传导通路，产生一系列细胞反应，包括增生、凋亡、迁移、分化和粘附的活跃或抑制。总之，NRG1/ErbB4信号系统异常与精神***症的发病有关，该信号系统损伤后会增加精神***症的易感性；精神***症患者中NRG1和ErbB4表达上调，信号转导增强； NRG1/ErbB4基因突变大鼠也表现出典型的精神***症症状。因为 NRG1/ErbB4信号通路也被认为是精神***症发生及发展最典型的通路，所以将NRG1/ErbB4信号通路作为生物学检测指标进行研究。
现有的精神***症动物模型难以建立客观的生物学检测目标，难以对精神***症的发病机制进行研究。如果要探索精神***症的发病机制及治疗，现在的模型都不具有可靠性和可行性。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种建立***诱导致精神***症大鼠模型的方法，以探究***与精神***症易感基因NRG1/ErbB4 之间的相关性，最终探索精神***症的发病机制，并为法医精神***症鉴定提供理论依据。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种建立***诱导致精神***症大鼠模型的方法，包括以下步骤：
(1)动物选择与分组：将2月龄成年SD大鼠24只(不分雌雄，体重290～340g)随机分成4组即K对照、K15给、K30给、K60给。
(2)***溶液配制:将***用蒸馏水配置成15mg/kg、 30mg/kg和60mg/kg组三个浓度的***溶液。
(3)喂养大鼠：K对照组每天指腹腔给予2次1.2ml体积的生理盐水，K15给、K30给、K60给分别每天指腹腔给予两次相同体积的***15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg，K对照指腹腔给予相同体积的生理盐水，连续7天。
(4)处死动物：在大鼠最后一次给药13h后，大鼠经***深度麻醉，固定于解剖台，剪开左胸壁暴露心脏，经左心室***灌注针并固定，切开右心耳，先灌注生理盐水，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清，动物断头取脑，在冰上迅速分离脑组织中所需的海马及前额叶皮质部位。
(5)免疫组化染色实验观察：将海马及前额叶皮质部位免疫组化染色切片，显微镜下观察并拍照。每张切片随机取2个高倍视野(400×)，采用Image-pro plus 6.0图像分析系统测定海马及前额叶皮质NRG1及ErbB4免疫阳性灰度值，进而转化为光密度(OD) 值。
(6)构建大鼠***诱导致精神***症模型，通过步骤1-5，得出***诱导致精神***症大鼠模型，并建立档案构成模型。
建立***诱导致精神***症大鼠模型的方法用于检测***与海马及前额叶皮质中NRG1/ErbB4 mRNA的表达情况的相关性。
建立***诱导致精神***症大鼠模型的方法用于开发治疗***诱导致精神***症药物的应用。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种建立***诱导致精神***症大鼠模型的方法，本方法简单，可靠性强，诱导时间短，本方法所建立的精神***症模型不仅体现了精神***症的阳性症状而且体现了精神***症的阴性症状，还能对精神***的不同程度进行区分，动物模型稳定，客观，可靠。本方法可用于探究***与精神***症易感基因NRG1/ErbB4之间的相关性，最终探索精神***症的发病机制，并为法医精神***症鉴定提供理论依据。
附图说明
图1中a-d为分离脑组织中的海马及前额叶皮质部位的操作步骤图；
图2为免疫组化试验前期图：ErbB4在脑组织中的海马及前额叶皮质的定位；
图3中，a为ErbB4在海马CA3区中不同浓度的***中的表达情况，b为ErbB4在前额皮质cg1区中不同浓度的***中的表达情况；
图4为PCR扩增曲线；
图5为PCR溶解曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1***诱导致精神***症大鼠模型建立的步骤：
(1)动物选择与分组：将2月龄成年SD大鼠24只(不分雌雄，体重290～340g)随机分成4组即K对照、K15给、K30给、K60给。
(2)***溶液配制:将***用蒸馏水配置成15mg/kg、 30mg/kg和60mg/kg组三个浓度的***溶液。
(3)喂养大鼠：K对照组每天指腹腔给予2次1.2ml体积的生理盐水，K15给、K30给、K60给分别每天指腹腔给予两次相同体积的*** 15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg，K对照指腹腔给予相同体积的生理盐水，连续7天。
(4)处死动物：在大鼠最后一次给药13h后，大鼠经***深度麻醉，固定于解剖台，剪开左胸壁暴露心脏，经左心室***灌注针并固定，切开右心耳，先灌注生理盐水，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清，动物断头取脑，在冰上迅速分离脑组织中所需的海马及前额叶皮质部位，如图1所示。
(5)免疫组化染色实验观察
免疫组化实验具体试验方法如下：
a.脑组织的移取
大鼠经***深度麻醉，固定于解剖台，剪开左胸壁暴露心脏，经左心室***灌注针并固定，切开右心耳，先灌注生理盐水，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清，再灌注4％多聚甲醛，断头取脑，将脑置于4％多聚甲醛液中固定48小时。
b.免疫组化
NRG1及ErbB4抗体浓度为1:200～1:400，按试剂盒说明书操作。
①将固定后的大鼠脑取相应的海马及前额叶皮质脑区组织，进行脱水，石蜡包埋，制作5μm厚切片，贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，70℃烤片3h；
②切片脱蜡至水；0.05M(pH7.2)PBS洗3次，每次2min；
③抗原修复：高压锅内加入pH6.0柠檬酸盐缓冲液1500ml，加热至沸腾，将置于抗原修复架上的切片放入缓冲液内，继续加热至喷气后3min，流水冷却至室温，取出玻片，蒸馏水冲洗10min，PBS (pH7.2)冲洗4次，每次1min；
④滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS冲洗3 次，每次2min，免疫组化笔圈定待测组织区域；
⑤取出切片，甩去多余液体，然后用正常山羊血清封闭20min；
⑥滴加适当稀释的一抗，37℃孵育过夜，PBS(pH7.2)洗3次，每次2min；
⑦滴加反应增强剂，37℃孵育20min，PBS冲洗3次，每次 2min；
⑧滴加辣根过氧化酶标记羊抗大鼠/兔IgG聚合物，37℃孵育 30min，PBS冲洗3次，每次2min；
⑨滴加新鲜配置DAB显色剂(DAB底物液1ml，滴加1滴(50μl) DAB浓缩液，混匀)，室温显色，镜下控制反应时间，充分水洗；
⑩梯度酒精快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜观察。
c.免疫组化染色半定量分析
每组随机取5张海马及前额叶皮质免疫组化染色切片，显微镜下观察并拍照。每张切片随机取2个高倍视野(400×)，采用 Image-pro plus 6.0图像分析系统测定海马及前额叶皮质NRG1及 ErbB4免疫阳性灰度值，进而转化为光密度(OD)值。
d.统计与分析：
各组结果以Mean±SEM表示，应用GraphPad Prism 5软件包进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。方差齐者组间比较用SNK(Student﹣Newman﹣Keuls)检验，方差不齐者用Games Howell 检验。P<0.05时有统计学意义。
结果：
如图2所示，免疫组化实验显示海马定位于CA3区，前额皮质定位于Cg1区；如图3中a、b图所示，***滥用导致两个脑区 ErbB4低表达，并且这种趋势成剂量依赖,表明***滥用确实能引起精神***症易感基因NRG1/ErbB4的改变，说明该***诱导致精神***症大鼠模型建立成功。
(6)构建大鼠***诱导致精神***症模型，通过步骤1至5，得出***诱导致精神***症大鼠模型，并建立档案构成模型。
实施例2
检测***与海马及前额叶皮质中NRG1/ErbB4 mRNA的表达情况的相关性。
试验方法：
1.脑组织总RNA的提取
大鼠经***深度麻醉，固定于解剖台，剪开左胸壁暴露心脏，经左心室***灌注针并固定，切开右心耳，灌注生理盐水，直到肝脏和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清。动物断头取脑，在冰上迅速分离脑组织中所需的海马及前额叶皮质部位。按每50mg～100mg组织加 1ml Trizol的比例加入适量的Trizol，用电动匀浆器高速匀浆，确保Trizol将样品完全溶解，必要时4℃12000rpm离心10min以除去难以裂解的组织。将匀浆液转移至新的无菌离心管中，于室温将匀浆物温育5min使核蛋白复合物完全解离，匀浆物加入0.2ml的氯仿，剧烈振荡15sec，4℃12000rpm离心15min以分离两相。将上层液相转移至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀(轻柔上下颠倒) 后置于室温10min或﹣20℃1h以沉淀RNA，再次在4℃12000rpm 离心10min，弃上清。用1ml 75％乙醇洗涤沉淀后，4℃7500rpm离心10min，小心地吸去上清，空气中干燥或超净台吹干。
2.RNA定量与纯度鉴定
用蛋白核酸分析仪测定RNA溶液在260nm和280nm的吸光度值(A)。按照A260＝1时RNA的质量为40μg计算RNA浓度，即 RNA(μg/μl)＝OD260×40μg/μl×样品稀释倍数/1000，样品A260/280 比值在1.6-2.0表明RNA纯度符合实验要求。
3.引物设计
引物设计参照Gen bank的mRNA序列。内参和目的基因的引物序列及产物大小：
β-actin引物：上游5’-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CC-3’，下游5’-AAC AGT CCGCCT AGA AGC AC-3’，281bp；
NRG1引物：上游5’-CCT CTG CTT CTT GTG ACG CC-3’，下游5’-GCC ATT GGG CTTGGT TCT TT-3’，234bp；
ErbB4引物：上游5’-CCA TTC CAC TTT ACC ACA ACA CGC-3’，下游5’-CGA GCCAAG GAC CTT TAC CCT CT-3’，259bp。
4.逆转录
每个样本各取2μg RNA产物，加入1μl Oligo(dT)18随机引物，DEPC水调制12μl，混匀，70℃，水浴5min；冰水浴1min，依次加入5×buffer 4μl，10×dNTP 2μl，RNaseinhibitor 1μl，混匀，37℃，5min；M﹣MLV 1μl，40℃，60min。
以上操作均在冰盒上进行，逆转录反应产物保存于﹣80℃备用。
5.PCR扩增
每个样本各取2μg逆转录产物，加入各类试剂，混匀，PCR扩增仪94℃预变性4min，94℃变性30sec，52℃退火45sec，72℃延伸1min，重复循环30-35次(β﹣actin 30个循环，NRG135 个循环,ErbB435个循环)，最后72℃延伸8min。
6.RT-PCR实验结果
RT-PCR实验结果表明，如图4-5所示，实验设计引物特异性好，实验方法可靠；同时表明NRG1及ErbB4 mRNA在前额皮质按***剂量从低到高呈现高表达，而且NRG1及ErbB4mRNA在海马按***剂量从低到高也呈现高表达。
综上所述，本发明提供的***诱导致精神***症大鼠模型建立成功，通过本模型发现目标蛋白海马定位于CA3区，前额皮质定位于Cg1区，并发现***对NRG1/ErbB4表达有影响，这种影响成剂量相关性。