阅读说明：本技术 一种用于ffpe样本dna质控的试剂盒及检测方法 (Kit for FFPE sample DNA quality control and detection method ) 是由 任绪义 张锋 曹子豪 毕亭亭 于 2019-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于FFPE样本DNA质控的试剂盒及检测方法,属于生物检测技术领域。本试剂盒中包含的引物和探针序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示,实施步骤包括：采用生物信息学技术手段在人类基因组序列上(hg19)设计了3条PCR扩增引物,通过三条引物采用荧光定量PCR技术对待评估标本进行PCR扩增(包含108bp和212bp的扩增产物),根据两个扩增产物的CT值差异以及浓度,对标本质量进行评估,为PCR扩增或第二代测序(NGS)等下游分子实验提供重要的样本质量依据。(The invention discloses a kit and a detection method for FFPE sample DNA quality control, and belongs to the technical field of biological detection. The sequences of the primers and the probes contained in the kit are shown as SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 4, the implementation steps comprise: 3 PCR amplification primers are designed on a human genome sequence (hg19) by adopting a bioinformatics technical means, PCR amplification (including amplification products of 108bp and 212 bp) is carried out on a sample to be evaluated by adopting a fluorescent quantitative PCR technology through the three primers, the quality of the sample is evaluated according to the difference of CT values and the concentration of the two amplification products, and an important sample quality basis is provided for downstream molecular experiments such as PCR amplification or second generation sequencing (NGS).)

一种用于FFPE样本DNA质控的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种用于FFPE样本DNA质控的试剂盒及检测方法。

背景技术

使用***固定石蜡包埋(Formalin-fixed and Paraffin-embedded，FFPE)方法处理组织样本，能够使样本得到较长时间地保存，因此该方法被广泛用在临床病理检验、医学科学研究和生物样本保存等工作中。目前，在医学或生物学研究机构的组织样品库中，存在着数量巨大的FFPE样本，这些样本为阐明疾病的发病机制、发掘新药物的治疗靶点和全面的回顾性研究等工作提供了珍贵的研究材料。

随着科学技术的发展，第二代测序技术(Next-generation sequencingtechnology，NGS)的出现极大地提高了研究人员对基因的检测能力。测序速度快，通量高，不断降低的测序成本等优势，使得NGS方法成功应用在医学检验的工作中，并成为检验人员的得力工具。同时，NGS对组织样品库中保存的众多FFPE样本进行大规模基因测序也成为可能。然而由于样本处理和保存过程中众多的不可控因素，FFPE样本存在DNA降解和碎片化的风险，不同FFPE样本的DNA降解程度/完整性差异很大。在NGS检测过程中，如果采用相同的测序策略将会严重影响最后有效测序数据的产出。因此，在对FFPE样本DNA进行NGS测序或其他分子检测前，准确评估DNA浓度和完整性是十分必要的。

目前检测DNA浓度方法主要有Nanodrop微量分光光度计和Qubit荧光定量。Nanodrop主要利用DNA在260nm、280nm处的吸光值计算DNA浓度；Qubit利用可特异结合dsDNA的荧光染料，在特定波长光源的激发下发出的荧光值计算DNA浓度。该2种方法只能检测DNA浓度，不能反映出DNA完整性。

检测FFPE样本DNA完整性的常用方法有：琼脂糖凝胶电泳、核酸片段分析仪及qPCR方法。琼脂糖凝胶电泳是利用核酸分子被放置在电场中时，带负电的核酸分子会向正电极的方向迁移，而迁移速度取决于核酸分子本身的大小和构型，即分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。利用该特性琼脂糖凝胶电泳可区分FFPE样本DNA的片段大小分布。核酸片段分析仪的作用原理与琼脂糖凝胶电泳类似。

本发明，采用生物信息学方法设计了3条PCR引物和1条探针，通过3条引物和1条探针对待检进行荧光定量PCR扩增(扩增108bp和212bp的片段)，根据两个扩增子的CT值差异以及得到的待测标本浓度，对标本质量进行评估，为PCR扩增或第二代测序(NGS)等下游实验提供重要的样本质量依据。

发明内容

本发明提供了一种利用人类基因组中存在的多拷贝同源序列并基于Taqman-MGB探针技术定量检测FFPE样本DNA的浓度和完整性的试剂盒。

一种用于FFPE样本中DNA质控的试剂盒，该检测试剂盒包括用于扩增的试剂包括以下3条引物和1条探针，其中3条引物分别为：

SEQ ID NO.：1：CCAAGAGGTAGAGATCATCAAGAGC；

SEQ ID NO.：2：TCCATTAGACCAGAAAAGACAGCA；

SEQ ID NO.：3：CCAAGAATCAAGACAGACACAAA；

1条探针为：SEQ ID NO.：4：FAM-TTGATGGGACGTATT-MGB；

其中SEQ ID NO.：1与SEQ ID NO.：2引物得到扩增子1，以及SEQ ID NO.：1与SEQID NO.：3引物对得到扩增子2，扩增子1长度为108bp，扩增子2长度为212bp，并且扩增1和扩增子2在人类基因组(hg19)上存在多个拷贝，且分布于不同的染色体上。

进一步地，所述试剂盒仅通过3条引物和1条探针，即可有效的评估FFPE样本中DNA的质量。

进一步地，所述试剂盒包含如下扩增体系：

体系1包含如下组分：1×PCR预混液，上游引物SEQ ID NO.：1，下游引物SEQ IDNO.：2，探针SEQ ID NO.：4，模板DNA。

体系2包含如下组分：1×PCR预混液，上游引物SEQ ID NO.：1，下游引物SEQ IDNO.：3，探针SEQ ID NO.：4，模板DNA。

本发明还公开了另一个技术方案：一种用于FFPE样本DNA质控的检测方法，用所述检测试剂盒实施，包含以下步骤：

1)配制体系1和体系2的PCR反应液；

2)配制包含待评估标本以及基于标准品的标准曲线反应体系；

3)进行荧光定量PCR扩增反应。

4)计算扩增子1和扩增子2的CT值以及待评估标本的浓度，进行标本质量的评估。

进一步地，所述评估标本质量的标准如下：

1)CT值差值小于2，DNA完整性好；

2)CT值差异介于2-4，DNA存在降解，但是仍可用于标准实验；

3)CT差值介于4-6，DNA降解，用于下游实验存在较大风险；

4)CT差值小于6，DNA降解严重，不建议进行后续实验。

本发明提供的FFPE样本DNA质控的试剂盒及检测方法的优点为：

(1)特异性强：使用优选的基因引物和对应的MGB标记探针仅对扩增同源序列的保守区序列进行识别，引物二聚体无法对检测造成干扰，有效杜绝假阳性和假阴性。

(2)安全简便：检测体系中，扩增和检测均在一管内进行，无需开盖，可有效防止污染；使用时只需加入待测样品的DNA即可开始PCR反应，使用简便。

(3)准确性高：本试剂盒中采用标准曲线法，不同浓度梯度的标准品之间线性关系好，可精确定量样本DNA中对应可扩增片段的相对浓度。

(4)快速：速度快，通量高，可在1小时内完成。

本发明提供的试剂盒，可以准确、快速检测FFPE样本DNA浓度和完整性。在临床检测中，对FFPE样本DNA进行准确的质量评估，可为NGS等下游分子检测实验提供有效的样本质控依据。

附图说明

图1A为荧光定量PCR体系1采用标准品进行梯度稀释的标准曲线；

图1B为荧光定量PCR体系2采用标准品进行梯度稀释的标准曲线；

图2为引物探针设计示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

下面结合实施例进一步说明本发明的有益效果：

实施例：

1)采用生物信息学方法，在人类基因组序列上(hg19)设计基于多个拷贝的扩增子引物序列，其中SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2引物对扩增子大小为108bp，SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：3引物对扩增子大小为212bp，且两个扩增子在人类基因组上存在多个拷贝，更有益于评估整个基因组水平的完整性。

2)核酸制备

血液基因组DNA提取：取200μL外周血，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自杭州新捷生物科技有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃，次DNA用于定量曲线中的标准品。

FFPE标本DNA提取：取FFPE标本，按照Generead DNA FFPE DNA Kit试剂盒(Qiagen)标准操作流程进行核酸提取，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。

3)PCR扩增

配制体系1(包含如下组分：1×PCR预混液，上游引物SEQ ID NO.：1，下游引物SEQID NO.：2，探针SEQ ID NO.：4，模板DNA)和体系2(包含如下组分：1×PCR预混液，上游引物SEQ ID NO.：1，下游引物SEQ ID NO.：3，探针SEQ ID NO.：4，模板DNA)的反应体系，同时采用血液基因组DNA制作标准曲线，用于待评估标本的浓度定量。采用如下PCR体系进行扩增：95℃预变性2min；95℃变性5s，60℃退火10s，进行40个循环；最后37℃降温1s，荧光检测选择在“60℃退火10s”这一步，荧光通道选择“FAM(465-510)”。

4)文库构建

采用安捷伦SureSelect^{XT HS} Enrichment System进行文库构建和靶向捕获，其中，该试剂盒包含EGFR、KRAS、BRAF等20个基因的外显子区域和部分内含子区域，试剂盒覆盖区域约为100kb。

5)测序

采用Illumina NextSeq500测序上机测序，测序数据量为600M。

6)数据分析

计算平均测序深度大于500x的区域占比。

7)结果分析

表1：质控结果与二代测序结果对照表

编号	文库浓度	CT差值	大于95％占比	备注
					1	242	1.98	95.65％	符合
2	202	1.56	97.77％	符合
					3	256	1.68	95.32％	符合
4	26	7.55	10％	符合
					5	61.4	6.51	15％	符合
6	6.2	10.11	～	符合

表1为6例标本的质控结果与二代测序结果的对照表。从结果看出，当CT值差值小于2时，表示模板DNA质量好，不会影响下游实验；当CT值差异较大时，代表标本存在降解，差值越大，降解程度越高，甚至会导致下游实验失败或者不能通过质控标准。

本发明所提供的试剂盒和检测方法反应时间短、样本经简单处理即可上荧光定量PCR仪，操作简便且检测高通量。可在FFPE样本DNA进行NGS测序等下游分子检测实验之前，对样本DNA进行质量控制，适合用于临床检验的要求。

序列表

<110> 杭州迪安医学检验中心有限公司

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccaagaggta gagatcatca agagc 25

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tccattagac cagaaaagac agca 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccaagaatca agacagacac aaa 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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