一种儿童营养基因组检测试剂盒及应用
阅读说明：本技术 一种儿童营养基因组检测试剂盒及应用 (Kit for detecting children nutrition genome and application ) 是由 黄必胜 胡咏武 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种儿童营养基因组检测试剂盒及应用,包括由表1所列的基因及位点的探针或引物、PCR扩增所需的试剂及其它耗材,本发明涉及基因工程技术领域。该儿童营养基因组检测试剂盒及应用,可实现通过筛选和整合了各个研究文献的研究结果,提出了我们自己特有的基因组合和多态性基因型的表型评判标准,儿童营养代谢基因检测通过检测与多种营养素代谢、吸收、偏好性相关的基因位点,评估孩子对营养素的代谢能力、吸收能力及偏好性,可以为孩子提供更精准、更科学的个性化营养膳食指导,科学饮食,从而获取均衡的营养成分,弥补基因差异造成的健康影响,达到让孩子健康成长的目的。(The invention discloses a kit for detecting a children nutrition genome and application thereof, which comprises probes or primers of genes and loci listed in a table 1, reagents required by PCR amplification and other consumables, and relates to the technical field of genetic engineering. The kit for detecting the children nutrition genome and the application thereof can realize that research results of various research documents are screened and integrated, the phenotype judgment standard of the own specific gene combination and polymorphic genotype is provided, the children nutrition metabolism gene detection evaluates the metabolism capability, the absorption capability and the preference of children to nutrients by detecting gene loci related to the metabolism, the absorption and the preference of various nutrients, and can provide more accurate and scientific personalized nutrition diet guidance and scientific diet for the children, thereby obtaining balanced nutrition components, compensating the health influence caused by gene difference and achieving the aim of healthy growth of the children.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种儿童营养基因组检测试剂盒及应用。
背景技术
儿童对于营养的吸收与代谢能力很大一部分是跟DNA的转录有关，因此可藉由基因检测的方式不仅可以知道营养的吸收状况，更准确、更合理地评价个体的营养素状况，而且可以使个性化营养成为可能，避免不合理的营养素摄入对身体造成伤害。
基因检测不仅可以对儿童白血病、儿童精神心理疾病、青少年眼病等儿童常见疾病患病风险进行评估，还可以对常见营养素吸收、代谢能力进行评估，帮助受检儿童制定个性化健康管理方案，如生活方式调整尤其是个性化膳食营养建议，生活环境选择等，并提供专业的检测报告及遗传咨询服务，帮助受检儿童有目的地规避导致疾病发生的危险因素，有效预防疾病发生，为儿童的健康成长保驾护航。
每个孩子的营养素合理摄入量并不是一定的，而是因人而异的，它和个体的遗传因素有着密切的关系，也就是说，基因比你更了解孩子的身体。通过大量研究，我们已经知道不同的基因特点会影响营养素的吸收、代谢和作用位点(分子靶)，携带不同基因型的孩子对某些营养素的需求不同。
通过基因检测与多种营养素代谢、吸收、偏好性相关的基因位点，评估孩子对营养素的代谢能力、吸收能力及偏好性，可以为孩子个性化的营养膳食做指导，从而获取均衡的营养成分，弥补基因差异造成的健康影响。
儿童营养代谢基因检测，包括维生素类(维生素A、B族维生素、维生素C、维生素D)和矿物质(钾、钙、镁、铁、锌等)以及其它主要营养物质的代谢相关的基因的多态性位点，已有相关研究文献报道它们的相关性，本发明在此基础上，筛选和整合了各个研究文献的研究结果，提出了我们自己特有的基因组合和多态性基因型的表型评判标准，儿童营养代谢基因检测通过检测与多种营养素代谢、吸收、偏好性相关的基因位点，评估孩子对营养素的代谢能力、吸收能力及偏好性，可以为孩子提供更精准、更科学的个性化营养膳食指导，科学饮食，从而获取均衡的营养成分，弥补基因差异造成的健康影响，达到让孩子健康成长的目的。
本发明通过常规一些检测手段只能评估儿童当下营养状况，基因测序技术恰好可以发挥其优势，评估儿童终生具备的遗传代谢特质，能够进行成长关键时期微量元素缺乏疾病预防，降低疾病风险，并通过结合基因检测和医学检测，构成了儿童一生成长的疾病科学预防体系，人体对微量元素的吸收十分缓慢，只有生活中持续关注，才能预防疾病发生。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种儿童营养基因组检测试剂盒及应用，通过对营养代谢相关基因的多态性位点目标区域捕获联合第二代高通量测序技术，并结合生物信息分析方法，实现对儿童营养基因的检测，具有检测通量高、灵敏度高、特异性强、准确性高、覆盖度广技术优势，有效解决营养相关基因众多，传统PCR检测或一代测序法难以一次性检测的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种儿童营养基因组检测试剂盒,包括由表1所列的基因及位点的探针或引物、PCR扩增所需的试剂及其它耗材。
本发明还公开了一种利用儿童营养基因组检测剂盒测序的方法，是以表1所示的63个基因96个位点儿童营养代谢相关基因组的所有外显子区域和外显子与内含子连接区域为目标捕获区域，设计能够同时捕获所有目标序列区域的探针组合，定制液相芯片，并联合测序技术和信息分析技术，对所有捕获到的目标序列进行测序及不同类型的突变信息分析，以解读目标样本中各个基因位点的基因型，分析多态性和突变，并根据多态型分析标准，确定相应的表型，其测序方法具体如下：
S1、根据表1所列的基因及相关位点，确定各目标基因的目标捕获区域，定制液相芯片；
S2、提取样本DNA：使用DNA提取试剂盒从受检者血液中提取基因组DNA，用于后续建库实验；
S3、目标区域捕获的文库构建；
S4、文库质控：使用Qubit及电泳检测样品条带和降解情况，使用PAGE-Urea测量插入片段大小情况，用BMG测量文库的摩尔浓度，测量样品文库是否合格；
S5、上机测序：捕获文库质检合格后，按照CG测序平台操作说明进行上机测序，并保证每个文库的原始数据量达到0.6Gb以上，目标区域测序深度达到30×以上，目标区域覆盖度达到99％以上；
S6、测序数据过滤、比对、突变分析；
S7、突变数据解读，获得与营养代谢相关的基因的多态型或突变位点。
优选的，所述定制液相芯片是由罗氏公司生产的Nimblegen EZ芯片。
优选的，所述测序技术是采用Complete Genomics(CG)第二代高通量测序技术。
优选的，所述步骤S1中确定各目标基因的目标捕获区域，定制液相芯片具体如下：以63个相关基因96个位点所在的外显子区为目标区域，定制液相捕获芯片，获得的目标区域探针序列包含108条探针，每条探针序列的长度为121bp，序列前后各包含16bp和15bp的标签序列，前后两个标签序列的序列组成分别是GAAGCGAGGATCAACT(SEQ ID NO：4)和CATTGCGTGAACCGA(SEQ ID NO：5)。
优选的，所述定制液相捕获芯片具体由罗氏公司根据提供的目标捕获区域设计捕获探针，生产成Nimblegen EZ芯片，GAAGCGAGGATCAACT(SEQ ID NO：4)和CATTGCGTGAACCGA(SEQ ID NO：5)两个标签序列分别为酶切位点和转录位点，两端均是用来设计PCR引物的，同时转录位点用来做转录，起到转录为RNA探针的作用。
优选的，所述步骤S2中DNA提取试剂盒是为QIAGEN DNA Blood mini kit。
优选的，所述步骤S3中目标区域捕获的文库构建具体步骤如下：
A1、首先用超声波仪将基因组DNA随机打断成220-400bp小片段，对DNA进行纯化、末端修复、加A接头(CG测序平台的接头)并用PCR进行扩增；
A2、然后通过碱基互补配对原理，使用液相捕获芯片上的捕获探针对与其配对的基因组目标区域的DNA进行杂交，捕获到目标区域的DNA，通过洗脱试剂将目标DNA从探针上洗脱下来，获得需要的目标DNA；
A3、其后再次进行PCR，对双链DNA进行环化，在A接头两端26bp处进行酶切，对切口进行末端修复，加上B接头(CG测序平台的接头)；
A4、最后分离DNA双链成单链，对单链进行环化，即构建成目标区域捕获的文库。
优选的，所述步骤S6中对下机数据进行生物信息分析的具体步骤如下：
B1、首先将测序得到的reads用Teramap软件(Complete Genomics公司提供)比对到参考基因组Hg19上，不允许有插入和缺失；
B2、然后鉴定可能与参考基因组不一样的区域，将有可能比对到这些区域的reads挑选出来进行局部组装，将组装得到的序列与参考基因组比较，确定各种类型的变异；
B3、其后用varScoreVAF(Complete Genomics公司提供)和varScoreEAF(CompleteGenomics公司提供)对检测到的突变进行打分；
B4、最后，过滤掉低质量(标注VQLOW)、低深度(支持突变的reads小于2)、低频率(突变allele频率(MAF)小于0.25)的突变，得到最后的突变列表。
优选的，所述步骤S7中突变数据解读，获得与营养代谢相关的基因的多态型或突变位点具体步骤如下：
C1、对于检测到的突变，首先用annovar注释，得到它们的基因信息、基因区域信息、转录本信息和氨基酸变化的信息；
C2、然后使用公共数据库dbSNP，1000ge nome，hapmap，BIC，HGMD，软件SIFT以及文献报道的信息来解读这些突变，确定它们与营养代谢的相关性。
(三)有益效果
本发明提供了一种儿童营养基因组检测试剂盒及应用。与现有技术相比具备以下有益效果：该儿童营养基因组检测试剂盒及应用，包括由表1所列的基因及位点的探针或引物、PCR扩增所需的试剂及其它耗材，可实现通过筛选和整合了各个研究文献的研究结果，提出了我们自己特有的基因组合和多态性基因型的表型评判标准，儿童营养代谢基因检测通过检测与多种营养素代谢、吸收、偏好性相关的基因位点，评估孩子对营养素的代谢能力、吸收能力及偏好性，可以为孩子提供更精准、更科学的个性化营养膳食指导，科学饮食，从而获取均衡的营养成分，弥补基因差异造成的健康影响，达到让孩子健康成长的目的。
附图说明
图1为本发明测序方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明实施例提供一种技术方案：一种儿童营养基因组检测试剂盒，包括由表1所列的基因及位点的探针或引物、PCR扩增所需的试剂及其它耗材。
本发明实施例还提供了一种利用儿童营养基因组检测剂盒测序的方法，是以表1所示的63个基因96个位点儿童营养代谢相关基因组的所有外显子区域和外显子与内含子连接区域为目标捕获区域，设计能够同时捕获所有目标序列区域的探针组合，定制液相芯片，并联合测序技术和信息分析技术，对所有捕获到的目标序列进行测序及不同类型的突变信息分析，以解读目标样本中各个基因位点的基因型，分析多态性和突变，并根据多态型分析标准，确定相应的表型，其测序方法具体如下：
S1、根据表1所列的基因及相关位点，确定各目标基因的目标捕获区域，定制液相芯片；
S2、提取样本DNA：使用DNA提取试剂盒从受检者血液中提取基因组DNA，用于后续建库实验；
S3、目标区域捕获的文库构建；
S4、文库质控：使用Qubit及电泳检测样品条带和降解情况，使用PAGE-Urea测量插入片段大小情况，用BMG测量文库的摩尔浓度，测量样品文库是否合格；
S5、上机测序：捕获文库质检合格后，按照CG测序平台操作说明进行上机测序，并保证每个文库的原始数据量达到0.6Gb以上，目标区域测序深度达到30×以上，目标区域覆盖度达到99％以上；
S6、测序数据过滤、比对、突变分析；
S7、突变数据解读，获得与营养代谢相关的基因的多态型或突变位点。
本发明实施例中，定制液相芯片是由罗氏公司生产的Nimblegen EZ芯片。
本发明实施例中，测序技术是采用Complete Genomics(CG)第二代高通量测序技术。
本发明实施例，步骤S1中确定各目标基因的目标捕获区域，定制液相芯片具体如下：以63个相关基因96个位点所在的外显子区为目标区域，定制液相捕获芯片，获得的目标区域探针序列包含108条探针，每条探针序列的长度为121bp，序列前后各包含16bp和15bp的标签序列，前后两个标签序列的序列组成分别是GAAGCGAGGATCAACT(SEQ ID NO：4)和CATTGCGTGAACCGA(SEQ ID NO：5)，定制液相捕获芯片具体由罗氏公司根据提供的目标捕获区域设计捕获探针，生产成Nimblegen EZ芯片，GAAGCGAGGATCAACT(SEQ ID NO：4)和CATTGCGTGAACCGA(SEQ ID NO：5)两个标签序列分别为酶切位点和转录位点，两端均是用来设计PCR引物的，同时转录位点用来做转录，起到转录为RNA探针的作用。
本发明实施例，步骤S2中DNA提取试剂盒是为QIAGEN DNA Blood mini kit。
本发明实施例，步骤S3中目标区域捕获的文库构建具体步骤如下：
A1、首先用超声波仪将基因组DNA随机打断成220-400bp小片段，对DNA进行纯化、末端修复、加A接头(CG测序平台的接头)并用PCR进行扩增；
A2、然后通过碱基互补配对原理，使用液相捕获芯片上的捕获探针对与其配对的基因组目标区域的DNA进行杂交，捕获到目标区域的DNA，通过洗脱试剂将目标DNA从探针上洗脱下来，获得需要的目标DNA；
A3、其后再次进行PCR，对双链DNA进行环化，在A接头两端26bp处进行酶切，对切口进行末端修复，加上B接头(CG测序平台的接头)；
A4、最后分离DNA双链成单链，对单链进行环化，即构建成目标区域捕获的文库。
本发明实施例，步骤S6中对下机数据进行生物信息分析的具体步骤如下：
B1、首先将测序得到的reads用Teramap软件(Complete Genomics公司提供)比对到参考基因组Hg19上，不允许有插入和缺失；
B2、然后鉴定可能与参考基因组不一样的区域，将有可能比对到这些区域的reads挑选出来进行局部组装，将组装得到的序列与参考基因组比较，确定各种类型的变异；
B3、其后用varScoreVAF(Complete Genomics公司提供)和varScoreEAF(CompleteGenomics公司提供)对检测到的突变进行打分；
B4、最后，过滤掉低质量(标注VQLOW)、低深度(支持突变的reads小于2)、低频率(突变allele频率(MAF)小于0.25)的突变，得到最后的突变列表。
本发明实施例，步骤S7中突变数据解读，获得与营养代谢相关的基因的多态型或突变位点具体步骤如下：
C1、对于检测到的突变，首先用annovar注释，得到它们的基因信息、基因区域信息、转录本信息和氨基酸变化的信息；
C2、然后使用公共数据库dbSNP，1000ge nome，hapmap，BIC，HGMD，软件SIFT以及文献报道的信息来解读这些突变，确定它们与营养代谢的相关性。
综上，本发明通过对营养代谢相关基因的多态性位点目标区域捕获联合第二代高通量测序技术，并结合生物信息分析方法，实现对儿童营养基因的检测，具有检测通量高、灵敏度高、特异性强、准确性高、覆盖度广等技术优势，有效解决营养相关基因众多，传统PCR检测或一代测序法难以一次性检测的问题。
儿童营养代谢基因检测，包括维生素类(维生素A、B族维生素、维生素C、维生素D)和矿物质(钾、钙、镁、铁、锌等)以及其它主要营养物质的代谢相关的基因的多态性位点，已有相关研究文献报道它们的相关性。我们在此基础上，筛选和整合了各个研究文献的研究结果，提出了我们自己特有的基因组合和多态性基因型的表型评判标准。儿童营养代谢基因检测通过检测与多种营养素代谢、吸收、偏好性相关的基因位点，评估孩子对营养素的代谢能力、吸收能力及偏好性，可以为孩子提供更精准、更科学的个性化营养膳食指导，科学饮食，从而获取均衡的营养成分，弥补基因差异造成的健康影响，达到让孩子健康成长的目的。
表1营养相关基因及位点
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。