阅读说明：本技术 一种环境中抗生素抗性基因的快速定量试剂盒及其检测方法 (Rapid quantitative kit for antibiotic resistance gene in environment and detection method thereof ) 是由 谢冰 王盼亮 奚慧 乔子茹 杜飞 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种环境中抗生素抗性基因的定量检测试剂盒及其定量检测方法。该试剂盒包括以下成分：Solution I、Solution II、Solution III、ddH<Sub>2</Sub>O和ROX。所述检测方法主要步骤为：1)以环境样品的DNA为模板,将其与Solution I和Solution II加入八联排管中,并根据qPCR仪型号确定是否加入ROX,最后添加ddH<Sub>2</Sub>O；2)将标准质粒Solution III(与Solution I对应)按10倍梯度稀释,随后将不同梯度的标准质粒Solution III分别与Solution I和Solution II加入八联排管中,ddH<Sub>2</Sub>O和ROX加入方法与步骤1)相同；3)将步骤1)和2)中的样品同时进行荧光定量PCR扩增,最终得出抗性基因标准曲线和基因丰度。本发明的试剂盒可以快速高效地定量分析环境中抗生素抗性基因的丰度,不仅特异性好,精确度高,而且能大大缩短实验周期,提高实验操作效率。(The invention discloses a quantitative detection kit and a quantitative detection method for antibiotic resistance genes in an environment. The kit comprises the following components: solution I, Solution II, Solution III, ddH 2 O and ROX. The detection method mainly comprises the following steps: 1) adding DNA of an environment sample, Solution I and Solution II into an eight-connected calandria by taking the DNA of the environment sample as a template, determining whether ROX is added or not according to the model of a qPCR instrument, and finally adding ddH 2 O; 2) diluting standard plasmid Solution III (corresponding to Solution I) according to 10-fold gradient, adding standard plasmid Solution III with different gradients, Solution I and Solution II into eight-connected pipes, ddH 2 The adding method of O and ROX is the same as that of the step 1); 3) and (3) carrying out fluorescence quantitative PCR amplification on the samples in the steps 1) and 2) simultaneously to finally obtain a resistance gene standard curve and gene abundance. The kit can rapidly and efficiently quantitatively analyze the antibiotics in the environmentThe abundance of the resistance gene has good specificity and high accuracy, and can greatly shorten the experimental period and improve the experimental operation efficiency.)

一种环境中抗生素抗性基因的快速定量试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于环境和分子生物学技术领域，涉及一种环境中抗生素抗性基因的快速定量试剂盒及其检测方法。

背景技术

自二十世纪二三十年代微生物学家弗莱明发现抗生素以来，因其能治疗和预防人类及动物疾病而广泛应用于医疗卫生领域和畜禽养殖业中。然而，随着抗生素的大量使用或滥用，导致其在环境中大量残留。而环境体系中残留的抗生素诱导了抗生素抗性基因的产生、传播及耐药细菌的产生。抗生素抗性基因被认为是一种新型、持久的环境污染物，具有潜在环境和人类健康风险。已有大量研究表明，抗生素抗性基因种类繁多，且分布广泛在包括养殖场及周围环境、污水处理厂及其污水排放受纳水体、河流沉积物、景观水体、饮用水体、土壤和垃圾填埋场等人为环境中，甚至有研究者发现空气中也存在抗生素抗性基因和抗性细菌。这些耐药细菌可通过直接或间接的途径转移到人体内。越来越多的证据表明，环境中的抗生素抗性细菌和抗性基因与临床上的耐药性密切相关。每年由于抗生素抗性细菌感染而造成重大疾病或导致死亡的病例在不断增加。据统计，美国每年有两百万人遭受耐药细菌的感染，其中大约23000人死于其感染，欧洲每年有25000人死于多重耐药细菌的感染。因此，对环境中抗生素抗性基因的定量检测及风险评估是非常重要的，尤其对环境中抗生素抗性基因的健康风险评估具有重要的意义。

环境中抗生素抗性基因的定量检测方法主要有聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)、DNA测序技术和DNA分子杂交技术等。PCR技术是体外快速扩增特异性基因最常用的技术，其技术原理与细胞内DNA复制相似。并且操作简单、灵敏度高、反应快速、对样品的纯度要求较低，能检测出pg级的DNA量。实时荧光定量PCR(Real-timequantitative PCR，qPCR)作为PCR技术的补充，已成为对环境中抗性基因定量分析强有力的工具，qPCR技术具有稳定性强、重复性好、实现耐药基因的定量研究。目前，qPCR技术已广泛应用于江河、湖泊、污水处理系统、土壤和养殖业等环境中抗性基因丰度的研究。

抗生素抗性基因定量PCR反应包括引物的选择、标准品的制定、反应体系的建立和条件的优化。然而，在抗生素抗性基因的定量分析过程中，通常存在诸多的不便利性。例如在常规的qPCR扩增体系配置中，正反引物、荧光染料、酶、dNTP等试剂通常需要单独保存，待要进行扩增时，将样品分别加到同一PCR管中。因此，在操作过程中除了耗时较长，操作繁琐的缺点外，多次取用会对试剂造成污染，影响后续使用。同时，标准质粒的制备也是一个较为繁琐复杂的过程。

发明内容

针对上述现有技术中出现的缺陷，本发明提供了一种用于抗生素抗性基因快速检测的定量试剂盒及其检测方法，此试剂盒能够快速、高效、准确的对不同环境中抗性基因进行定量研究。

本发明的目的在于解决环境中抗生素抗性基因定量分析过程中操作步骤繁琐的问题，提供一种可以快速、高效、准确测定环境中抗生素抗性基因的定量试剂盒及其检测方法，此试剂盒和检测方法可快速地对环境中多种类型的抗性基因进行定量研究。

本发明提出了一种快速定量检测环境中抗生素抗性基因的试剂盒，所述试剂盒含有Solution I(10×)、Solution II(2×)、Solution III(标准质粒)、ROX和ddH₂O。

其中，所述Solution I是由单个目的基因的正向引物和反向引物组成。

所述Solution I中正、反向引物的浓度优选为4μM。

所述正、反向引物选取的是各个环境中丰度较高的几大类抗生素抗性基因，Solution I主要设置的抗性基因的种类有但不仅仅包括：磺胺类(sul1和sul2)、四环素类(tetM和tetQ)、β-内酰胺类(bla_CTX-M和bla_TEM)和大环内酯类(ermA和ermB)等。

该试剂盒可以通过客户需求定制相关目的抗性基因的对应的Solution I和Solution III。

其中，所述Solution II是由HotStart DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg²⁺以及优化的缓冲体系和ddH₂O组成。

所述HotStart DNA Polymerase的浓度优选为0.2U/μl。

所述SYBR Green I的浓度优选为0.5×。

所述dNTPs包括dATPs、dTTPs、dGTPs和dCTPs，所述各个dNTPs的摩尔比优选为1:1:1:1，且各个dNTPs的最优摩尔浓度为40mM。

所述Mg²⁺的浓度优选为4mM。

其中，所述Solution III是与Solution I对应使用的质粒标准品，是由pMD18-T或pMD19-T或pMD20-T等T质粒载体构建的对应基因的标准质粒。

待标准质粒使用时，需要将其按照10倍梯度稀释5个梯度以上，根据定量结果将Ct与标准质粒拷贝数做成标准曲线，要求R²≥0.99。

其中，所述ROX的添加与否根据其qPCR仪型号确定其添加量。

其中，添加所述ddH₂O(双蒸水)到反应体系量。

本发明还提供了一种用于抗生素抗性基因快速检测的方法，具体内容及步骤如下：

(1)根据测定环境样品的类型选用合适的DNA提取试剂盒，待DNA提取后，利用超微量分光光度计对DNA的浓度和A_260/280进行测定；

(2)将检测合格的DNA样品稀释到一定的浓度(建议模板浓度为50～100ng)，随后依次加入Solution I(10×)、ROX(根据仪器型号确定加入量)、ddH₂O和Solution II(2×)到八联排管中，建议设置qPCR反应体系为20μL或10μL，每个反应设置3个平行以上；

(3)将稀释5个梯度浓度的Solution III(标准质粒)与ROX(根据仪器型号确定加入量)、ddH₂O和Solution II(2×)按照步骤(2)加入到八联排管中；

(4)将步骤(3)准备好的样品放入qPCR仪中，反应程序设置为：①预变性：94℃，5min；②设置40个循环，变性：94℃，30s；退火：退火温度(根据Solution I引物设定)，30s；延伸：72℃，30s；③72℃，10min；④溶解曲线：可根据仪器系统设置(或设置溶解曲线在65-95℃，每5秒增加0.5℃)；

(5)同时按照步骤(2)加入设置阴性对照；

(6)待反应结束后根据标准质粒的拷贝数log₁₀值和对应Ct值(循环阈值)做出目的基因的标准曲线；

(7)将待测样品的Ct值代入到标准曲线中，计算出待测样品定量抗性基因的拷贝数，并计算出样品中抗性基因的拷贝数。

本发明的有益效果在于：本发明提出的试剂盒能够解决环境中抗生素抗性基因定量分析过程中操作步骤繁琐的问题。并且本发明提供了一种可以快速、高效、准确测定环境中抗生素抗性基因的检测方法，此试剂盒和检测方法可快速地对环境中多种类型的抗性基因进行定量研究。

附图说明

图1苏州河中磺胺类抗性基因的丰度。

图2苏州河中四环素类抗性基因的丰度。

图3苏州河中β-内酰胺类抗性基因的丰度。

图4苏州河中大环内酯类抗性基因的丰度。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：苏州河中磺胺类抗性基因(sul1和sul2)测定

从两个季节(冬季和夏季，每个季节分3次采集样品)的苏州河(黄浦江的支流)3个地点采取河水样品，设置3个平行，共18个样品。采集的河水样品立即放入冰盒中，带回实验室后过0.22μm滤膜，然后滤膜存储在-80℃冰箱中，并按照DNA Isolation Kit操作说明进行DNA的提取。

将提取好的DNA按照发明内容中所描述的检测方法进行实验操作。本发明采用10μL的qPCR反应体系，设置阴性对照。荧光定量PCR仪型号为CFX96 Real-Time Systerm(美国BIO-RAD)。Solution I选择磺胺类抗性基因sul1和sul2，即Solution I-sul1和SolutionI-sul2，其序列和退火温度如表1所示。

表1磺胺类抗生素抗性基因选用引物

Solution III所含标准质粒与Solution I对应，即Solution III-sul1和Solution III-sul2。磺胺类抗性基因sul1和sul2的标准曲线如表2所示。由表2可知，sul1和sul2的线性关系较好，扩增效率分别为91.2％和91.3％(通常要求为85～110％之间)，说明其扩增效果较好。

表2磺胺类抗生素抗性基因qPCR标准曲线

将测量样品结果分别代入各自的标准曲线，苏州河中磺胺类抗性基因的丰度结果如图1所示，sul1和sul2的丰度分别为1.24×10⁷～7.56×10⁷copies/mL和8.88×10⁵～1.52×10⁷copies/mL，sul1基因丰度高于sul2；由此说明，本发明所制备的试剂盒能够有效检测环境中存在的磺胺类抗性基因。

实施例2：苏州河中四环素类抗性基因(tetM和tetQ)测定

样品采集和DNA提取方法见实施例1，将提取合格的DNA样品按照发明内容中进行实验操作。本发明采用10μL的qPCR反应体系，设置阴性对照。荧光定量PCR仪型号为CFX96Real-Time Systerm(美国BIO-RAD)。选择四环素类抗性基因tetM和tetQ，其序列和退火温度如表3所示。

表3四环素类抗生素抗性基因选用引物

四环素类抗性基因tetM和tetQ的标准曲线如表4所示。由表4可知，tetM和tetQ的线性关系较好，扩增效率分别为91.5％和96.2％，说明其扩增效果较好。

表4四环素类抗生素抗性基因qPCR标准曲线

将测量样品结果分别代入各自的标准曲线，苏州河中四环素类抗性基因的丰度结果如图2所示，tetM和tetQ的丰度分别为5.94×10⁴～7.87×10⁵copies/mL和7.14×10⁴～1.59×10⁷

copies/mL；由此说明，本发明所制备的试剂盒能够有效检测环境中存在的四环素类抗性基因。

实施例3：苏州河中β-内酰胺类抗性基因(bla_CTX-M和bla_TEM)测定

样品采集和DNA提取方法见实施例1，将提取合格的DNA样品按照发明内容进行实验操作。本发明采用10μL的qPCR反应体系，设置阴性对照。荧光定量PCR仪型号为CFX96Real-Time Systerm(美国BIO-RAD)。选择β-内酰胺类抗性基因bla_CTX-M和bla_TEM，其序列和退火温度如表5所示。

表5β-内酰胺类抗生素抗性基因选用引物

β-内酰胺类抗性基因bla_CTX-M和bla_TEM的标准曲线如表6所示。由表6可知，bla_CTX-M和bla_TEM的线性关系较好，扩增效率分别为90.5％和102.4％，说明其扩增效果较好。

表6β-内酰胺类抗生素抗性基因qPCR标准曲线

将测量样品结果分别代入各自的标准曲线，苏州河中β-内酰胺类抗性基因的丰度结果如图3所示，bla_CTX-M和bla_TEM的丰度分别为1.22×10⁵～1.02×10⁷copies/mL和2.52×10⁴～5.78×10⁶copies/mL；由此说明，本发明所制备的试剂盒能够有效检测环境中存在的β-内酰胺类抗性基因。

实施例4：苏州河中大环内酯类抗性基因(ermA和ermB)测定

样品采集和DNA提取方法见实施例1，将提取合格的DNA样品按照发明内容进行实验操作。本发明采用10μL的qPCR反应体系，设置阴性对照。荧光定量PCR仪型号为CFX96Real-Time Systerm(美国BIO-RAD)。选择大环内酯类抗性基因ermA和ermB，其序列和退火温度如表7所示。

表7大环内酯类抗生素抗性基因选用引物

大环内酯类抗性基因ermA和ermB的标准曲线如表8所示。由表8可知，ermA和ermB的线性关系较好，扩增效率分别为90.8％和94.6％，说明其扩增效果较好。

表8大环内酯类抗生素抗性基因qPCR标准曲线

将测量样品结果分别代入各自的标准曲线，苏州河中大环内酯类抗性基因的丰度结果如图4所示，ermA和ermB的丰度分别为9.29×10³～3.35×10⁵copies/mL和9.68×10⁴～9.90×10⁵copies/mL；由此说明，本发明所制备的试剂盒能够有效检测环境中存在的大环内酯类抗性基因。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学，上海众择生物科技有限公司

<120> 一种环境中抗生素抗性基因的快速定量试剂盒及其检测方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 22

<212> DNA

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tccggtggag gccggtatct gg 22

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atgtgcagya ccagtaargt katggc 26

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gaacgcgata ttcacggttt a 21

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